Determinazione non invasiva, High-throughput di durata di sonno in roditori

Riepilogo

Descriviamo un metodo di alto-rendimento di misurazione sonno per mezzo di monitoraggio basato su attività di home-gabbia. Questo metodo offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali basati su EEG. E è convalidata anche per la determinazione della durata totale di sonno e può essere un potente strumento per monitorare il sonno nei modelli del roditore della malattia umana.

Abstract

Tradizionalmente, il sonno è monitorato da un elettroencefalogramma (EEG). Gli studi di EEG in roditori richiedono impianto chirurgico di elettrodi seguita da un periodo di recupero lunghi. Per eseguire una registrazione EEG, l'animale è collegato a un ricevitore, creando un tether innaturale per il montaggio a testa. Il monitoraggio EEG è che richiede tempo, porta un rischio per l'animale e non è un ambiente completamente naturale per la misura di sonno. Metodi alternativi per rilevare il sonno, specialmente in una moda di alto-rendimento, avanzerebbe notevolmente il campo di ricerca di sonno. Qui, descriviamo un metodo convalidato per la rilevazione del sonno tramite monitoraggio basato su attività di home-gabbia. Studi precedenti hanno dimostrato che il sonno valutato tramite questo metodo ha un alto grado di accordo con sonno definita da misure basate su EEG tradizionale. Considerando che questo metodo viene convalidato per tempo totale di sonno, è importante notare che durata di attacco di sonno dovrebbe essere valutata da un EEG che ha la migliore risoluzione temporale. L'EEG può differenziare anche rapido del movimento oculare (REM) e non - REM del sonno, dando maggiori dettagli circa l'esatta natura del sonno. Tuttavia, determinazione basata sulle attività di sonno può essere utilizzato per analizzare più giorni di sonno indisturbato e valutare il sonno come una risposta ad un evento acuto (come lo stress). Qui, ci mostra la potenza di questo sistema per rilevare la risposta dei topi per le iniezioni intraperitoneali quotidiane.

Introduzione

Sonno ha funzioni importanti per il restauro del corpo e del cervello che segue il carico quotidiano di Veglia¹. È stato dimostrato che il sonno gioca un ruolo nella conservazione della memoria e di plasticità cerebrale generale¹. L'EEG è il gold standard per rilevare il sonno². Nei roditori, monitoraggio EEG richiede l'impianto chirurgico di elettrodi applicata ad un testa-mount, dopo che l'animale ha bisogno di un periodo di tempo per recuperare². Dopo il recupero, l'animale è collegato al dispositivo di registrazione e viene dato un altro periodo di assuefazione². A causa di questi necessari periodi di recupero e assuefazione, EEG è che richiede tempo e laborioso e non può essere ragionevolmente eseguita su larga scala. Inoltre, la procedura chirurgica di impianto dell'elettrodo trasporta un rischio intrinseco all'animale. Infine, l'analisi dei dati per il Punteggio di sonno negli studi di EEG è molto laborioso. In alternativa, metodo non invasivo, ad alta produttività di sonno monitoraggio sarebbe molto gli aiuti ricerca roditore sonno.

Un activity based casa-gabbia sistema di monitoraggio utilizzato per rilevare sonno risolve i limiti degli studi EEG. La semplice premessa è che un animale inattivo è probabilmente un animale dorme. È stato dimostrato che 40 s di inattività continuo (cestinate in 10 epoche di s) è una misura affidabile del sonno come misurato con un EEG (indicato per avere 88-94% accordo)³. Sistemi di monitoraggio casa-gabbia possono essere utilizzati per studiare i grandi gruppi di animali con il tempo di installazione minima. Abbiamo dimostrato che ci vuole circa un giorno gli animali per habituate per alloggi individuali in casa-gabbia monitoraggio sistema⁴ in contrasto con le settimane di recupero necessari per EEG studi². Inoltre, alcune configurazioni è in grado di rilevare i parametri fisiologici come la temperatura corporea, frequenza cardiaca, attività e l'alimentazione. Temperatura e frequenza cardiaca sono determinati dall'impianto di un piccolo trasmettitore. Questi parametri possono fornire ulteriori informazioni sul mouse e possono essere utilizzati in parallelo con la registrazione del sonno per ulteriormente aggiungere alla nostra comprensione del sonno e come è influenzato.

Mentre è un potente strumento, ci sono alcune limitazioni ai tipi di dati che possono essere acquisiti da monitoraggio basato su attività di home-gabbia. Studi di EEG possono differenziare fra REM e non - REM del sonno, che possono essere importanti per una più profonda comprensione dell'architettura di sonno. Sistemi di monitoraggio casa-gabbia di Activity based possono fornire solo dati per la durata totale di sonno. Inoltre, anche se l'output per monitoraggio basato su attività di home-gabbia dà informazioni sulla durata del periodo di sonno, noi non possiamo valutare con precisione Durata incontro a causa dei limiti intrinseci di 40 s intervalli³. Nonostante queste limitazioni, casa-gabbia il monitoraggio della durata del sonno fornisce un'importante misura biologica che può influenzare molti fattori a valle, compresa la salute dell'animale e comportamento⁵.

Monitoraggio basato su attività di home-gabbia è stato utilizzato per rilevare il sonno in molti studi che indicano la sua versatilità. Citiamo un esempio di questi studi^{4,6,7,8,9,10,11,12}. Oltre al metodo presentato, ci sono altri metodi di rilevazione del sonno tramite monitoraggio basato su attività, ciascuno dei quali contiene la propria limitazioni^13,14. Alcuni di questi studi esaminare lunghi periodi di sonno ininterrotto (72 h) mentre alcuni esaminare sonno in blocchi di 24 h. In questo studio, presentiamo sonno analisi per ogni periodo di 24 h dopo la risposta per le iniezioni intraperitoneali quotidiane di (IP) e ai cambiamenti periodici gabbia in un modello murino di sindrome (Fmr1 KO topi) del X fragile. Abbiamo scelto di topi Fmr1 KO perché hanno ridotto il sonno⁴ e sono supposti per essere iper-reattive a informazioni sensoriali¹⁵. I nostri dati evidenziano la capacità di rilevare i cambiamenti nel ritmo del sonno in risposta a un evento stressante. Questo metodo è ideale per ottenere informazioni generali su sonno in larghe coorti di topi. Il metodo può essere utile per la comprensione degli effetti di specifiche alterazioni genetiche sul sonno, gli effetti di trattamenti farmacologici, o le risposte agli eventi, ad esempio un fattore di stress. Inoltre, il metodo fornisce un semplice mezzo di screening per una risposta prima di iniziare gli studi più coinvolti.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso nazionale Istituto di mentale salute Animal Care ed ed eseguite secondo gli istituti nazionali di salute orientamenti sull'uso degli animali e manutenzione.

1. impostazione delle unità di rilevamento Sleep

1. Acquistare il numero di unità e il software desiderato.
2. Seguire le istruzioni per configurare i sistemi di monitoraggio.
   1. Allineare un rivelatore di fronte un emettitore. Assicurarsi che i raggi infrarossi sono rivolti verso l'interno e sono allineati alla stessa altezza.
   2. Utilizzare le viti in dotazione per posizionare i rivelatori e gli emettitori all'altezza desiderata sul cavalletto in metallo. Questa altezza deve essere regolata in modo che la biancheria da letto della gabbia è sotto il livello dei raggi infrarossi, ma la trave è ad altezza adeguata per rilevare l'attività dell'animale. Questo crea una superficie interna di 27 cm × 32 cm (10,625 × in 12,75).
      1. Se sono necessarie altre viti, acquisto più a un hardware memorizzare (6-32 ¼ Pan vite a testa).
3. Collegare ogni rivelatore con ogni emettitore. Collegare l'emettitore all'hub fornito collegato al ricevitore. Eseguire questa operazione per la x e il y aerei. Ripetere questo passaggio per tutte le configurazioni.
4. Collegare il ricevitore a un computer con l'hub USB fornito.

2. il software Setup

1. Installare il software di analisi e selezionare il file di configurazione dell'hardware fornito come predefinito. Il file di configurazione dell'hardware deve essere modificato solo dall'azienda.
2. Fare clic su File | Aprire Configurazione di esperimento. Aprire la configurazione di esperimento predefinito.
3. Fai clic su esperimento | Proprietà.
4. Scegliere la scheda scansione modificare la velocità di scansione a 10 s.
5. Scegliere la scheda attività modificare la frequenza di campionamento di attività a 10 s.
6. Fare clic su File | Salvare esperimento come per salvare queste impostazioni di configurazione per gli esperimenti futuri.

3. installazione animale

1. Casa singolarmente i topi in gabbie pulite che sono 31 cm (12,25 in) di lunghezza e larghezza 16,5 cm (6,5 pollici). Per impedire la creazione la biancheria da letto il mouse e che ostruisce le travi, utilizzano letti ad una profondità di 3 mm. Non forniscono materiale di nidificazione aggiuntivo per i topi.
2. I topi con accesso al cibo e acqua ad libitum per mezzo di un alimentatore di filo che riposa nella parte superiore della gabbia fuori del modo le travi. Se necessario, riempire il cibo e cambiare le bottiglie di acqua quando gabbie vengono cambiate ogni 3-5 giorni per tutta la durata dello studio.
3. Allineare la gabbia del mouse all'interno del fascio infrarosso istituito, assicurando che si riposa in circa la metà dei fasci per una copertura completa.
4. Garantire la luce del ciclo di buio della camera è impostata su specchio ciclo luminoso scuro delle condizioni normali alloggiamento dei topi, o modificare come desiderato in base all'esperimento.

4. preparazione e iniezioni di droga

1. Ottenere acqua sterile e sterile ciclodestrina.
2. Per tutte le iniezioni, utilizzare una siringa da 1 mL con ago ipodermico 25.5-30.5 G. Un nuovo ago sterile e la siringa deve essere utilizzati per ogni mouse.
3. Per ridurre il tempo tra le iniezioni, assemblare tutte le siringhe in anticipo.
4. Per preparazioni iniettabili ciclodestrina: preparare la soluzione di ciclodestrina aggiungendo 3 g di ciclodestrina a 10 mL di acqua per fare una soluzione di ciclodestrina del 30%.
5. Amministrare 0,3 mL di soluzione fisiologica o di ciclodestrina tramite iniezione del IP.

5. software per registrare sonno

1. Aprire il file di configurazione dell'hardware.
2. Fare clic su File | Aprire Configurazione di esperimento. Aprire il desiderato o esperimento configurazione predefinita.
3. Fai clic su esperimento | Installazione.
   1. Designare il percorso in cui salvare il file di dati, nonché un percorso in cui salvare il file di backup. Il software richiede che il file di dati memorizzato nei File di programma nella cartella di programma specifico.
      Nota: dato che alcuni computer Mostra i File di programma come sensibile, accesso al file di dati potrebbe non essere possibile dopo l'esperimento. Pertanto, si consiglia di salvare il file di backup in un'altra area non sensibili sul computer locale.
   2. Designare l'animale ID per ogni sonno dell'alloggiamento e inserire il peso dell'animale, se lo si desidera. Se una camera non viene utilizzata nell'esperimento, deselezionando la casella si disattiva quella camera. Una volta immesse le informazioni di identificazione, fare clic su fatto.
4. Fare clic su File | Salvare sperimentare come per salvare la configurazione corrente di esperimento sotto il nome di file desiderato.
5. Fai clic su esperimento | Eseguire o F5 per avviare la registrazione. Attendere un epoca s 10 per assicurarsi che tutti gli alloggiamenti sono raccogliendo attività. Come gli animali erano appena iniettati, è molto probabile che gli animali si spostano abbastanza per essere rilevato dai raggi infrarossi.
   1. Se non viene rilevata alcuna attività, provare a spostare la gabbia del mouse manualmente per garantire che le travi ritirare il movimento. Continuare la risoluzione o spostare in una camera di lavoro, se l'attività non è ancora registrata.
      Nota: Eseguire l'esperimento, non appena le iniezioni sono finite.
6. Coprire gli schermi di computer con una copertura opaca per bloccare la luce. Coprire le luci lampeggianti sul misuratore di attività.
7. Eseguire l'esperimento per 24 h.
   Nota: A causa del tempo necessario per eseguire le iniezioni, non sarà un pieno 24 h. Le iniezioni devono essere eseguite allo stesso tempo ogni giorno. Sonno non deve essere registrato durante le iniezioni.
8. Il giorno seguente, al momento delle iniezioni, fare clic esperimento | Interrompere per terminare la registrazione. Fare clic su File | Esportare | Generare il soggetto CSVs per raccogliere i dati grezzi per ogni mouse.
   Nota: Può prendere qualche tempo da esportare, quindi farlo immediatamente e quindi procedere alle iniezioni, mentre il computer sta elaborando.
9. Fare clic su File | Esportare | Sonno per esportare il file di sonno per ogni esperimento aprendo il raw. File di dati di DDAT su qualsiasi computer che ha installato il software.
   1. In Origine di attività di rilevamento parametri, verifica che siano selezionate sia l'asse x e asse y caselle.
   2. In Epoche di soglia dormire, assicurarsi che siano selezionate 4 epoche.
   3. Sotto Soglia di attività soglia dormire, assicurarsi che siano selezionati 0 conteggi.
   4. Sotto Ciclo luce/buio, controllare il tempo appropriato per il ciclo luce/buio.
   5. Sotto la Finestra di analisi, selezionare l'ora desiderata per l'analisi. Nel caso di studi di iniezione, lasciare il giorno come predefinito. Impostare l' ora di inizio come ExpSTART. Impostare la durata come 24:00 per 24 h. analisi utilizzando che il software può essere fatto per un massimo di 72 ore.
   6. Salvare la configurazione per risparmiare tempo per l'esportazione di dati.
   7. Fare clic su Aggiorna.
   8. Fare clic su Genera File CSV e salvare il file nella posizione desiderata.

6. analisi dei dati

1. Per ogni sessione di registrazione, aprire il file di sonno. Per assegnare l'ID di oggetto, aprire il file CSV individuale per ogni camera determinare l'ID di oggetto. Registrare il TOT sonno HH.mm.SS per sia la luce e le fasi di scure per tutti gli animali.
   1. Controllare il file CSV soggetto individuale per le incoerenze che indica il fallimento della registrazione. Se abbaglianti conteggi vengono rilevati in un piano, ma nessun conteggi sono osservato su altro aereo, ciò indica un errore di larghezza.
      Nota: Il "% dormire" per le fasi di luce e buia è calcolato durante il periodo di registrazione complessiva, che comprende fasi sia chiaro e scure. Per cicli di luce/buio di 12 h, moltiplicare questo numero per 2 per ottenere il sonno di"%" nella fase scura o 12 ore di luce. Dato che gli studi di iniezione non è andato per un pieno 24 h, calcolato "% dormire" non è preciso. Per generare la corretta "% dormono", dividere il "TOT dormire HH.mm.SS" per il "tempo trascorso esperimento: HH.mm.SS," moltiplicare per 2 e poi moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale. Se le iniezioni sono state effettuate nella fase di luce, quindi solo la fase della luce deve essere regolata in questo modo.
2. Poiché fasi e diversi giorni vengono confrontati con gli altri, analizzare la durata del sonno per cento per ogni fase e ogni giorno.

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Risultati

Per determinare l'effetto delle iniezioni quotidiane su sonno e se gli animali habituate alle iniezioni, abbiamo effettuato le iniezioni quotidiane di IP per 14 giorni consecutivi alle 9:00 (ciclo di luce iniziò alle 6:00) e durata del sonno ha registrato nei 12 Fmr1 KO C57Bl/6J. Abbiamo usato all'interno di design degli oggetti, iniettando ogni animale con soluzione salina normale per 4 giorni consecutivi (giorni 1-4) e poi il 30% ciclodestrina per i seguenti dieci giorni conse...

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Discussione

Qui, presentiamo un metodo non invasivo, ad alta produttività per la determinazione della durata del sonno basata sul monitoraggio delle attività nella casa-gabbia. Questo metodo di valutazione del tempo totale di sonno è stato convalidato contro EEG studi³. Monitoraggio basato su attività di home-gabbia è semplice, non invadente e applicabile per gli studi di popolazione in gran numero di animali. È limitato in quanto non può dare informazioni dettagliate riguardanti il sonno (ad esempio d...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Equipment and software to analyze sleep duration
Captisol Research Grade	Captisol	RC-0C7-100	Captisol for dissolving hydrophobic compounds
30 G BD Needle 1/2 inch	BD	305106	Needle for injections
BD Disposable Syringes	Fisher	14-823-30	Syringes for injections
B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Labs	3025	Fmr1 KO mice
Super Mouse 750 Mouse Cage	Lab Products, Inc.		Homecages for the mice
SANI-Chips Bedding	PJ Murphys		Bedding for the mice