נחישותם לא פולשנית, תפוקה גבוהה של משך השינה בחולדות

Summary

אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה של מדידת שינה באמצעות פיקוח הביתה כלוב מבוסס-פעילות. שיטה זו מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות מבוססות-EEG. זה טוב מאומת מצפני משך השינה הכולל והוא יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לפקח על שינה במודלים מכרסם של מחלות אנושיות.

Abstract

באופן מסורתי, שינה נמצא בפיקוח של העוויתיים (EEG). EEG מחקרים בחולדות דורשים ניתוח ההשתלה של האלקטרודות ואחריו תקופת החלמה ארוכה. כדי לבצע הקלטת EEG, החיה מחובר למקלט, יצירת הקשר לא טבעי הראש ההר. ניטור EEG הוא זמן רב, נושאת סיכונים לבעל-החיים, היא לא הגדרה טבעית לחלוטין עבור המידה של שינה. שיטות אלטרנטיביות כדי לזהות שינה, במיוחד באופן תפוקה גבוהה, במידה רבה מראש בתחום מחקר השינה. כאן, אנו מתארים שיטה המאומת לגילוי שינה דרך פיקוח הביתה כלוב מבוסס-פעילות. מחקרים קודמים הראו כי שינה העריך באמצעות שיטה זו יש רמה גבוהה של הסכם שהוגדר על-ידי אמצעים מסורתיים מבוססי EEG בשינה. ואילו בשיטה זו תאומת זמן שינה הכולל, חשוב לציין כי משך לגבי השינה צריכה להיות מוערך על ידי אא שבו יש יותר רזולוציה טמפורלית. א. ג יכול להבדיל גם תנועות עיניים מהירות (REM), ראם שינה, לתת יותר פרטים על האופי המדויק של שינה. למרות זאת, שינה מבוססי פעילות נחישות יכול לשמש כדי לנתח ימים מרובים של שינה ללא הפרעה, ולהעריך שינה כתגובה לאירוע חריפה (כמו מתח). כאן, אנו מראים את העוצמה של מערכת זו כדי לזהות את התגובה של עכברים כדי זריקות יומיות בקרום הבטן.

Introduction

שינה יש פונקציות חשובות לשיקום בעקבות הנטל היומי של ערות¹במוח ובגוף. הוכח כי שינה ממלאת תפקיד שימור זיכרון ו- פלסטיות המוח כללי¹. א. ג הוא תקן זהב כדי לזהות שינה². בחולדות, ניטור EEG דורשת השתלה כירורגית של אלקטרודות למוט הר-הראש, לאחר מכן החיה צריך פרק זמן להתאושש². לאחר ההתאוששות, החיה מחובר למכשיר הקלטה, ניתנת עוד תקופת habituation². בגלל אלה תקופות הכרחי יחלים ויחזור habituation, EEG היא זמן רב ולא מייגעת, אין אפשרות לבצע באופן סביר בקנה מידה גדול. בנוסף, הליך כירורגי של אלקטרודה השרשה נושא סיכון הטמון לחיה. לבסוף, ניתוח הנתונים עבור ניקוד שינה במחקרים EEG היא גם מייגע מאוד. חלופה, שיטה לא פולשנית, תפוקה גבוהה של שינה ניטור לסייע מאוד מחקר השינה מכרסמים.

מבוסס על פעילות בית-כלוב ניטור מערכת המשמשים לזיהוי שינה מטפל המגבלות של מחקרים EEG. ההנחה פשוטה הוא חיים לא פעיל הוא כנראה חיה מגורים. הוכח כי 40 s של חוסר פעילות רציפה (מנופה ב שהשרתים s 10) הוא מדד אמין של שינה כפי שנמדד עם EEG (הראו שיש הסכם 88-94%)³. מערכות ניטור כלוב הבית יכול לשמש כדי לחקור קבוצות גדולות של בעלי חיים זמן הכיוונון מינימלי. אנחנו הראו כי זה לוקח חיות כ יום אחד habituate לדיור בודדים הבית-כלוב ניטור מערכת⁴ בניגוד השבועות של שחזור לצורך לימודי אא ג². בנוסף, כמה setups יכול גם לזהות פרמטרים פיזיולוגיים כגון טמפרטורת הגוף, קצב הלב, פעילות, האכלה. טמפרטורה וקצב הלב נחושים מכל ההשתלה של משדר קטן. פרמטרים אלה יכולים לספק מידע נוסף אודות העכבר, ניתן להשתמש במקביל ההקלטה שינה כדי להוסיף עוד יותר את ההבנה שלנו של שינה ואת ההשפעה עליו.

אמנם זה כלי רב עוצמה, ישנן כמה מגבלות על סוגי נתונים שניתן לרכוש מבוססי פעילות הבית-כלוב ניטור. EEG מחקרים באפשרותך להבדיל בין REM ללא ראם שינה, אשר עשוי להיות חשוב להבנה עמוקה יותר של שינה אדריכלות. מבוסס על פעילות מערכות ניטור כלוב בית יכול לספק רק נתונים משך השינה הכולל. בנוסף, למרות הפלט לניטור הבית-כלוב מבוססי פעילות נותן מידע על משך התקף שינה, אנחנו לא במדויק להעריך משך התקף בגלל המגבלה הטבועה של s 40 במרווחים³. למרות מגבלות אלו, כלוב בית ניטור של משך השינה מספק מדד ביולוגי חשוב שעשוי להשפיע על גורמים רבים במורד הזרם, כולל התנהגות⁵ובריאות של החיה.

מבוסס על פעילות בית-כלוב ניטור שימש כדי לזהות שינה במחקרים רבים המציין צדדיות שלה. אנו מצטטים מדגם של אלה מחקרים^{4,6,7,8,9,10,11,12}. בנוסף השיטה שהוצגו, יש גם שיטות אחרות של זיהוי שינה דרך פיקוח מבוסס-פעילות, המכילים כל אחד מגבלות משלו,^13,14. חלק ממחקרים אלה לבחון תקופות ארוכות של שינה ללא הפרעה (72 h) בעוד כמה לבחון שינה בבלוקים של 24 שעות. במחקר זה, אנו מציגים שינה ניתוח עבור כל תקופת 24 שעות לאחר התגובה זריקות יומיות (IP) בקרום הבטן, כלוב תקופתיים שינויים במודל של עכברים של שביר X תסמונת (Fmr1 KO עכברים). בחרנו Fmr1 KO עכברים כי הם צמצמו שינה⁴ היא שממוצע hyper-תגובתי מידע חושי¹⁵. הנתונים שלנו להדגיש את היכולת לזהות שינויים בדפוסי שינה בתגובה לאירוע מלחיץ. שיטה זו היא אידיאלית עבור קבלת מידע כללי על שינה בכל קוהורטות גדולות של עכברים. השיטה יכולה להיות שימושית להבנת השפעת ספציפי שינויים גנטיים על שינה, ההשפעות של טיפול תרופתי, או התגובות אירועים, כגון יותר מלחיץ. בנוסף, השיטה מספקת אמצעי הקרנה לתגובה לפני ביצוע מחקרים מעורב יותר פשוטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים היו אושרה על ידי לאומי המכון של הנפש החיה שירותי הבריאות ועדת שימוש וביצע בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות להנחיות על טיפוח ועל השימוש של בעלי חיים.

1. הגדרת יחידות הזיהוי לישון

1. לרכוש מספר יחידות ותוכנה הרצוי.
2. בצע את ההוראות כדי להגדיר את מערכות ניטור.
   1. יישר גלאי מול פולט. ודא קרני אינפרא אדום פונות פנימה מיושרות באותו גובה.
   2. השתמש את הברגים שסופקו כדי למקם את גלאי ואת הפולטים בגובה הרצוי על הדוכן מתכת. הגובה הזה צריך להיות מותאם כך המצעים של הכלוב נמצא מתחת לרמה של הקורות אינפרא-אדום, אבל הקרן הוא הגובה המתאים כדי לזהות הפעילות של החיה. זה יוצר שטח פנימי של 27 ס"מ × 32 ס"מ (10.625 ב × ב 12.75).
      1. אם נדרשים ברגים, קניה יותר בחומרה לאחסן (¼ 6-32 ב פאן ראש הבורג).
3. התחבר כל גלאי כל פולט. להתחבר פולט ה-hub שסופקו מקושר עם המקלט. בצע זה ה-x וגם המטוסים y. חזור על שלב זה עבור כל הכיוונונים.
4. לחבר את המקלט מחשב עם רכזת ה-USB שסופק.

2. תוכנת ההתקנה

1. להתקין את תוכנת ניתוח ובחר את קובץ התצורה של החומרה סיפק כברירת המחדל. יש רק לשנות את קובץ התצורה של החומרה על ידי החברה.
2. לחץ על קובץ | פתחו תצורה ניסוי. פתח את תצורת ברירת המחדל של הניסוי.
3. לחץ על הניסוי | מאפייני.
4. לחץ על הכרטיסיה לסרוק לשנות את קצב סריקה עד 10 s.
5. לחץ על הכרטיסיה פעילות לשנות את קצב הדגימה פעילות 10 s.
6. לחץ על קובץ | שמור ניסוי בשם כדי לשמור את הגדרות תצורה אלה לניסויים עתידיים.

3. בעלי חיים ההתקנה

1. ביחידים בית העכברים בכלובים נקי כי הם 31 ס"מ (12.25 ב) ו- 16.5 ס"מ (ב 6.5). כדי למנוע את העכבר מ לבנות את המצעים ומשבית את הקורות, השתמש מצעים בעומק של 3 מ מ. אינם מספקים חומר הקינון נוסף עבור העכברים.
2. העכברים לספק גישה למזון ומים ad libitum באמצעות מזין חוט זה מונח בחלק העליון של הכלוב. הזז הקורות. במידת הצורך, למלא את האוכל ולשנות את בקבוקי מים כאשר הכלובים מוחלפים מדי 3-5 ימים בכל משך זמן של המחקר.
3. יישר את כלוב עכבר בתוך קרן אינפרא אדום להגדיר, ולהבטיח כי היא נחה באמצע הקורות כיסוי מלא.
4. ודא את האור מחזור אפלה של החדר מוגדר המראה את מחזור כהה האור של העכברים תנאי דיור נורמלי, או לשנות לפי הצורך בהתבסס על הניסוי.

4. תרופות זריקות והכנה

1. להשיג מים סטריליים, cyclodextrin סטרילי.
2. עבור כל זריקות, השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט תת-עורית 25.5-30.5 גרם. מזרק עם מחט סטרילית חדשה צריך לשמש עבור כל עכבר.
3. כדי לצמצם את הזמן בין זריקות, להרכיב מזרקים כל מראש.
4. לזריקות cyclodextrin: להכין cyclodextrin פתרון על-ידי הוספת דור 3 של cyclodextrin 10 מ"ל של מים כדי ליצור פתרון cyclodextrin 30%.
5. לנהל 0.3 מ של תמיסת מלח או cyclodextrin באמצעות הזרקת ה-IP.

5. תוכנה רשומה לשינה

1. פתח את קובץ התצורה של החומרה המוגדר כברירת מחדל.
2. לחץ על קובץ | פתחו תצורה ניסוי. פתח את הרצוי או ברירת מחדל תצורת הניסוי.
3. לחץ על הניסוי | ההתקנה.
   1. לייעד את המיקום לשמירת קובץ הנתונים, כמו גם מיקום לשמירת קובץ הגיבוי. התוכנה דורשת כי קובץ הנתונים ניתן לאחסן את קבצי תוכנית תחת התיקיה בתוכנית מסוימת.
      הערה: לאור העובדה מחשבים מסוימים להציג את קבצי התוכנית כאדם רגיש, גישה לקובץ הנתונים לא ייתכן שניתן לאחר הניסוי. לכן, מומלץ לשמור את קובץ הגיבוי לאזור אחר, בלתי רגיש במחשב המקומי.
   2. לייעד את החיה מזהה לישון כל קאמרית והזן את המשקל של החיה במקרה הצורך. אם תא אינו בשימוש לניסוי, ביטול הסימון בתיבת ינטרל את החדר הזה. לאחר הזנת את פרטי הזיהוי, לחץ על לעשות.
4. לחץ על קובץ | שמור ניסוי בשם כדי לשמור את התצורה הנוכחית של הניסוי תחת שם הקובץ הרצוי.
5. לחץ על הניסוי | לרוץ או F5 כדי להתחיל בהקלטה. המתן אפוק s 10 כדי לוודא כי כל התאים קולטים פעילות. כמו בעלי החיים רק הוזרקו, סביר מאוד כי החיות העברת מספיק שהוא זוהה על ידי הקורות אינפרא-אדום.
   1. אם אין פעילות מזוהה, לנסות להזיז את כלוב עכבר ידנית על מנת להבטיח שהקורות לאסוף את התנועה. לעבור לחדר עבודה אם הפעילות עדיין אינו נרשם או להמשיך בפתרון הבעיות.
      הערה: הפעל את הניסוי, ברגע שתסיים את הזריקות.
6. מכסים את מסכי מחשב עם מכסה אטום כדי לחסום את האור. מכסים את האורות מהבהבים על המונה פעילות.
7. הפעל את הניסוי במשך 24 שעות ביממה.
   הערה: בגלל הזמן הדרוש כדי לבצע את הזריקות, זה לא יהיה מלא 24 שעות ביממה. הזריקות צריכה להתבצע במקביל מדי יום. לא צריך להיות שנרשם שינה במהלך זריקות.
8. למחרת, בזמנו של זריקות, לחץ על הניסוי | לעצור את כדי לסיים את ההקלטה. לחץ על קובץ | ייצוא | ליצור נושא CSVs כדי לאסוף את הנתונים הגולמיים עבור כל עכבר.
   הערה: זה עשוי לקחת קצת זמן כדי לייצא, אז לעשות את זה באופן מיידי ולאחר מכן המשך כדי זריקות בזמן שהמחשב מעבד.
9. לחץ על קובץ | ייצוא | שינה לייצא את הקובץ שינה עבור ניסוי על-ידי פתיחה של raw. CDTA קובץ הנתונים בכל מחשב שבו יש את התוכנות המותקנות.
   1. תחת זיהוי הפרמטרים פעילות מקור, ודא כי הן ציר ה-x וציר ה-y תיבות מסומנות.
   2. תחת לישון שהשרתים הסף, לוודא שהשרתים 4 נבחרות.
   3. תחת הסף פעילות הסף לישון, ודא כי 0 סעיפים נבחרים.
   4. תחת מחזור/כהה, בדוק את הזמן המתאים המחזור/כהה.
   5. תחת החלון ניתוח, בחר הזמן המבוקש לניתוח. במקרה של המחקרים הזרקה, עוזבים היום כברירת מחדל. הגדר את שעת התחלה ExpSTART. הגדר את משך 24:00 24h. ניתוח באמצעות שהתוכנה ניתן לעשות לכל היותר 72 h.
   6. לשמור את התצורה כדי לחסוך זמן עבור ייצוא נתונים.
   7. לחץ על עדכן.
   8. לחץ על צור קובץ CSV ולשמור את הקובץ למיקום הרצוי.

6. ניתוח נתונים

1. עבור כל מושב הקלטה, פתח את הקובץ שינה. כדי להקצות את מזהה נושא, פתח את קובץ ה-CSV נפרדים עבור כל תא לקבוע את מזהה נושא להקליט את TOT שינה hh:mm:ss הן לאור ומופעי כהה עבור כל בעלי החיים.
   1. בדוק את קובץ ה-CSV נושא בודדים עבור חוסר עקביות המציין את הכשל של הקלטה. אם קרן גבוהה ספירות מאותרים במישור אחד, אך אין סעיפים הם נצפו על המטוס אחרים, הדבר מעיד על כשל קרן.
      הערה: "% ישן" עבור שלבי כהה מחושב מעל תקופת ההקלטה הכולל, אשר כוללת שלבים אור וחושך. 12 h מחזורים/כהה, להכפיל את המספר הזה 2 לקבלת "% השינה" אור 12 h או שלב כהה. נתון כי המחקרים הזרקה לא הלך עבודה מלא 24 שעות ביממה, המחושבים "% ישן" אינה מדויקת. כדי להפיק את הנכונות "% ישן", לחלק את "TOT לישון hh:mm:ss" ב- "ניסוי זמן שחלף: hh:mm:ss," הכפילו ב- 2 ולאחר מכן להכפיל ב- 100 כדי לקבל את האחוז. אם זריקות בוצעו בשלב האור, ואז רק שלב האור צריך להיות מותאם באופן זה.
2. מאחר וימי -שלבים שונים מושווים להיות אחד עם השני, לנתח את משך השינה אחוז עבור כל שלב, בכל יום.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לקבוע את ההשפעה של זריקות יומיות על שינה, אם חיות habituate כדי הזריקות, ביצענו זריקות IP יומי למשך 14 ימים רצופים ב־9: 00 (מחזור אור החל ב־6: 00) והקליט משך השינה בעכברים Fmr1 KO C57Bl/6J 12. היינו תוך העיצוב של הנבדקים, הזרקת כל חיה עם תמיסת 4 ימים רצופים (ימים 1-4) ולאחר מכן 30% cyclodextrin הב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה לא פולשנית, תפוקה גבוהה עבור קביעת משך השינה בהתבסס על ניטור פעילות הבית-כלוב. שיטה זו של הערכת זמן שינה הכולל אומתה נגד לימודי אא ג³. פיקוח הביתה כלוב מבוסס-פעילות היא פשוטה, לא פולשנית, החלים על לימודי אוכלוסיה במספר גדול של בעלי חיים. זה מוגבל כי הוא לא יוכ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Equipment and software to analyze sleep duration
Captisol Research Grade	Captisol	RC-0C7-100	Captisol for dissolving hydrophobic compounds
30 G BD Needle 1/2 inch	BD	305106	Needle for injections
BD Disposable Syringes	Fisher	14-823-30	Syringes for injections
B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Labs	3025	Fmr1 KO mice
Super Mouse 750 Mouse Cage	Lab Products, Inc.		Homecages for the mice
SANI-Chips Bedding	PJ Murphys		Bedding for the mice