Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

Resumen

Culturas organotypic tridimensional del utrículo murino y cóclea en ópticamente claro colágeno geles preservar tejido natural morfología, permiten estimulación mecánica mediante ajuste de la rigidez de la matriz y permitan de genes mediada por virus.

Resumen

Los órganos sensoriales del oído interno son desafiantes para estudiar en los mamíferos debido a su inaccesibilidad a la manipulación experimental y observación óptica. Por otra parte, aunque las técnicas de cultivo existentes permiten perturbaciones bioquímicas, estos métodos no proporcionan un medio para estudiar los efectos de fuerza mecánica y rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. Aquí se describe un método de cultura organotypic tridimensional del utrículo murino intacto y cóclea que supera estas limitaciones. La técnica para el ajuste de una rigidez de la matriz tridimensional que se describe aquí permite la manipulación de la fuerza elástica contra crecimiento del tejido. Por lo tanto, este método puede utilizarse para estudiar el papel de las fuerzas mecánicas durante el desarrollo del oído interno. Además, las culturas permiten entrega de genes mediada por virus, que puede ser utilizada para experimentos de ganancia y pérdida de función. Este método de cultivo conserva innata de las células ciliadas y las células y sirve como una alternativa potencialmente superior a la tradicional cultura bidimensional de órganos sensoriales vestibulares y auditivos.

Introducción

El estudio de la mayoría de los aspectos del desarrollo del órgano de los mamíferos ha sido facilitado por sistemas in vitro . Ahora se utilizan dos métodos principales para el cultivo de órganos sensoriales vestibulares: flotante¹ y adherente² preparados. Ambos métodos permiten la investigación de la célula de pelo vulnerabilidades³ regeneración^1,4 y in vitro. Además, el papel del desarrollo de la muesca^5,67,de Wnt⁸y factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR)^9,10 señalización cascadas en el oído interno tiene se ha establecido, en parte, mediante el uso de cultivos en vitro de epitelio sensorial. Sin embargo, se controlan la diferenciación y crecimiento celular, no sólo a través de la señalización por morfógenos, sino también a través de estímulos físicos y mecánicos como contactos intercelulares, la rigidez de la matriz extracelular y mecánicos de estiramiento o constricción. El papel de tales estímulos mecánicos es un desafío para investigar en el desarrollo del oído interno en vivo. Por otra parte, los métodos existentes de cultura libre-flotación y adherentes no son adecuados para estos estudios in vitro. Aquí describimos un método de cultura organotypic tridimensional de colágeno geles de rigidez variable. En gran parte, este método conserva la arquitectura en vivo de los órganos sensoriales vestibulares y cocleares y permite la investigación de los efectos de la fuerza mecánica en el crecimiento y la diferenciación¹¹.

Debido a estímulos mecánicos son conocidos para activar eventos moleculares posteriores, como el hipopótamo señalización vía^12,13,14,15, es importante ser capaz de combinar la estimulación mecánica con manipulaciones bioquímicas y genéticas. El método de cultivo que se describe aquí permite la entrega de genes mediada por virus y puede ser utilizado para el estudio de mecánicos y moleculares de señalización durante el desarrollo de oído interno¹¹.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y comités de uso de la Universidad de Rockefeller y de la Universidad de California del sur.

1. (opcional) preparación del colágeno I solución de tendones Mouse-tail

Nota: Colágeno las soluciones están disponibles comercialmente. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del gel.

1. Eutanasia a ratones del adulto joven (3-5 semanas) de 5-10 de cualquier cepa de tipo salvaje con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes¹⁶. Recoger las colas y desinfectar sumergiendo en etanol al 70% durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente.
   Nota: Incubación por más de 48 h debe evitarse, ya que resulta en deshidratación excesiva del tejido y dificulta el proceso de extracción del tendón.
2. Retire la piel de cada cola introduciendo un corte longitudinal con una hoja de bisturí y retrayendo la piel todo con pinzas. Transferencia de las colas sin piel en un plato de Petri de 100 mm lleno de etanol al 70% limpio y cortado en segmentos de 10 mm.
   Nota: Desechar las partes más finas de las colas, que son difíciles de manipular.
3. Con unas pinzas, Asegure cada segmento de la cola a la parte inferior de la caja Petri y usar un segundo par de Pinzas finas para extraer los tendones de la cola una a la vez. Las fibras individuales del tendón deberán surgir con resistencia mínima.
   Nota: Fórceps #5 viejo, sordo funcionan bien para este paso.
4. Preparar 100 mL de una solución al 0.1% (por volumen) de ácido acético en agua estéril grado molecular y añadir 10 mL de esta solución a un plato de Petri de 100 mm estériles. Transferir los tendones a la placa de Petri y dejar durante 1 hora a temperatura ambiente para desnaturalizar el colágeno I.
5. Utilice una tijera estéril de bisturí o iridectomía con puntas romas, curva para picar el tendón en fragmentos de 1-2 mm. Transferir los tendones picaditos a un tubo estéril de 50 mL y Añadir ácido acético al 0.1% para llevar el volumen a 50 mL.
   Nota: Utilice cuatro o cinco colas por cada 50 mL de ácido para lograr un colágeno concentración de 2.0-2.5 mg/mL.
6. Refrigere el colágeno solución a 4 ° C durante un mínimo de 48 h para facilitar la desnaturalización de la proteína completa. Vortex con un vórtex mesa situado a la máxima velocidad durante 1 minuto dos veces al día.
7. Medir la concentración de la solución usando el análisis de ácido bicinchoninic, ajustar el colágeno I concentración a 2.0-2.5 mg/mL mediante la adición de solución al 0.1% de ácido acético y almacenar a 4 ° C.
   Nota: Colágeno solución se puede conservar por uno o dos años.
8. (Opcional) Centrifugue el colágeno solución a 2.000 x g durante 1 h a 4 ° C y usar geles de la fracción superior translúcida (aproximadamente de la mitad del volumen), para conseguir colágeno ópticamente claro en la sección 4.

2. disección de los órganos vestibulares y auditivas

1. Eutanasia a ratones embarazadas de cualquier tensión con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes¹⁶. Extraer y decapitar a los embriones.
   Nota: Lfng CreER^T2/tdTomato ratones pueden usarse para permitir el etiquetado permanente de apoyar a las células a la exposición 4-hydroxytamoxifen¹⁷.
2. Esterilizar todos los superficies de trabajo e instrumentos de disección, incluyendo dos pares de #5 pinzas y cuchillo pelo¹⁸, limpiar con etanol al 70%.
3. Dividir cada cabeza en dos mitades mediante la introducción de un corte longitudinal con una hoja de bisturí estéril o con dos pares de pinzas #5. Extraer los huesos temporales, que contienen los oídos interno¹⁹y colocarlos en 15 mL de solución salina equilibrada fría de Hank (HBSS) en caja Petri de 60 mm. Mantener el plato en el hielo.
   Nota: Embriones en una serie de etapas desde E13.5 E18.5 se han utilizado con éxito.
4. (Opcional) Lavar los oídos interno agitando suavemente les en un tubo cónico de 50 mL que contenga 30 mL helado HBSS y reemplazar la HBSS tres o cuatro veces. Mantenga el tubo en hielo.
   Nota: Este paso limita la posible contaminación de la cultura de tejido y lleva rápidamente la temperatura a 4 ° C, que impide que el tejido la degradación y la muerte celular.
5. Usando dos pares de Pinzas finas para #5, separar las orejas del interior del hueso temporal y transferir las orejas, tres o cuatro a la vez, en un plato de Petri de 60 mm con HBSS helada.
6. Disecar los órganos sensoriales vestibulares.
   1. Orientar el lado medial de la orejas para arriba y busque el utrículo. Con dos pares de pinzas #5, quitar el cartílago que rodea los órganos vestibulares. Suavemente separa el nervio vestibular, la conexión entre el utrículo y el sáculo y los canales semicirculares, como se muestra en la figura 1. Tire el utrículo y el ámpula adjunta de los canales semicirculares superiores y horizontales de la oreja.
      Nota: Este método puede utilizarse en interior de etapas E16.5 - E18.5. Preservar los fragmentos de cartílago para la sección 3 más abajo.
7. Diseccionar la cóclea.
   1. Retire el tejido cartilaginoso que rodea el órgano de la audición con dos pares de pinzas #5. Suavemente separa la conexión entre la base coclear y el sáculo, como se muestra en la figura 1.
      Nota: Para etapas E13.5 - E14.5, suavizan el cartílago antes de la disección por el tratamiento interno oídos con colagenasa 0.25% I en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por 5 min a temperatura ambiente. Preservar los fragmentos de cartílago para la sección 3 más abajo.
8. Utilizando una pipeta de 200 μL cabido con una punta ancha antiadherente, transferir a un plato de Petri de 30 mm con medio de cultivo compuesto por DMEM/F12 suplementado con 33 mM DGlucosa, bicarbonato de sodio de 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - el utricles y cócleas 1piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), glutamina 1 mM, nicotinamida de 1 mM, 20 mg/L factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico de 20 mg/L, 10 mg/L insulina, transferrina de 5.5 mg/L y selenito de sodio de 5 μg/L.
9. Mantener los preparativos del utrículo de hasta 3 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono para permitir la cicatrización de los cortes en el epitelio introducidas durante la disección. Preparaciones de cóclea deben ser transferidas al gel de colágeno 10 min después de la disección.
   Nota: Ya que la disección se realiza en HBSS helada, no hay ninguna necesidad de precalentar el medio de cultivo a 37 ° C.

3. (opcional) ajuste colágeno Gel rigidez mediante la adición de concentraciones variables de condrocitos

Nota: Fue modificado el método para el aislamiento de condrocitos de Gosset et al. ²⁰

1. Preparar una solución de 1% de colagenasa en estéril 1 x PBS y tienda 100-200 μL partes alícuotas a-80 ° C. Descongela el hielo cuando sea necesario, evitando múltiples ciclos de hielo-deshielo.
2. Uso finas pinzas para recoger los pedazos de cartílago de la disección de los órganos vestibulares y auditivos de 10-12 orejas. Tejidos conectivos y del oído interno separados del cartílago. El cartílago de la transferencia a un plato de Petri de 30 mm y añadir 300 μL de medio de cultivo estéril.
3. Utilice unas tijeras de hoja o iridectomía estéril de bisturí con puntas romas y curvadas para picar el tejido para lograr piezas de cartílago aproximadamente 0,5 mm de longitud.
4. Añadir colagenasa I al medio con cartílago para lograr una concentración de la enzima final del 0,25%. Transferir el plato a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C gas 5% dióxido de carbono. Pipeta vigorosamente utilizando una pipeta de 1000 μl cada 20 min hasta pedazos de cartílago se disocian y no son distinguibles en la solución, luego incubar un 20 minutos adicionales.
   Nota: En el caso de las preparaciones del utrículo, aislamiento de condrocitos se puede realizar en el paso 2.9; tarda aproximadamente 2 horas (3-4 rondas de pipeteo).
5. Recoge la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y ajustar el volumen a 10 mL con PBS estéril 1 x. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS estéril 1 x. Centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
   Nota: Es importante lavar las células dos veces; cualquier restante colagenasa que digiero el colágeno que gel.
6. Utilizando una pipeta de 200 μL, añada 100 μl de medio de cultivo al pellet celular y pipetee suavemente para resuspender. Contar las células usando un hemocitómetro y mantenerlas en antes hielo.
7. Para aumentar la rigidez del gel, agregar condrocitos para el colágeno neutralizado gel solución (sección 1) y mezclar rápidamente para distribuir las células en el gel antes de la solidificación.
   Nota: El módulo de elasticidad del colágeno (una medida de la rigidez) del gel, aumenta linealmente con el número de condrocitos agregó¹¹. La relación es descrita por la función lineal determinada experimentalmente E = 206· NC + 15, en la que E es el módulo elástico en pascales y Nc es el número de condrocitos en millones. Para un protocolo detallado para gel medidas de rigidez consulte el original artículo¹¹.

4. Coloque el órgano sensorial Vestibular o auditivo en un colágeno que gel

1. En un tubo de 1,5 mL estéril, preparación de colágeno I solución de polimerización mediante la mezcla de 160 μl de PBS de x 10 con indicador de pH rojo de fenol, 133 μl 0,34 M de hidróxido de sodio, 70 μl 0,9 M de bicarbonato de sodio y 40 μl de 1 M HEPES. Mantenga el tubo en hielo.
   Nota: Esta receta proporciona la solución de polimerización necesaria para preparar 2 mL de colágeno gel, pero puede ampliarse según sea necesario.
2. Mezclar 100 μl de solución de polimerización y 400 μL de colágeno I solución sobre hielo transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo en un tubo de 1,5 mL refrigerado. Para aumentar la rigidez del gel, agregar 50 μl de medio de cultivo que contiene condrocitos y mezclar suavemente como se describe en la sección 3.
3. Transferir 500 μl del colágeno neutralizado solución a un plato de Petri de 30 mm enfriada con un relleno de fondo de cristal de 10 mm o a un pozo de una placa de la pozo cuatro.
   Nota: Es fundamental guardar todos los reactivos en el hielo para evitar una polimerización rápida y desigual del colágeno I.
4. Transferir rápidamente las cócleas o utricles al colágeno neutralizado solución y ajustar los órganos a la posición deseada con un pelo estéril cuchillo¹⁸ o un par de Pinzas finas.
   Nota: Colágeno la polimerización se hace perceptible después de 1-2 min como la solución se vuelve turbia.
5. Después de la solución alrededor del tejido ha polimerizado, coloque el plato de Petri o la placa de la pozo cuatro por 20 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono para asegurar la polimerización completa.
6. Añadir 3 mL de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 0,5% por caja de Petri o 500 μl del mismo medio por pozo de una placa de la pozo cuatro. Mantener el cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono. Si lo desea, complementar el medio de cultivo con 10 μm 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) para etiquetar las células proliferantes.
   Nota: Concentraciones más altas de FBS se pueden utilizar si se desea.

5. virales inyecciones en cultivos tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivos

1. Descongelar el virus deseado en el hielo y mezclar con solución de azul tripán en un tubo cónico de 0,5 mL para alcanzar una concentración del tinte final de 0.05%. Utilizar tintura de 10-20 x para evitar la dilución sustancial del virus. Mantener en hielo.
   Nota: Adenovirus serotipo 5 trabajos mejores para infectar células de soporte en el utrículo¹⁹, mientras que virus adeno-asociado Anc80 puede infectar las células de pelo y células de apoyo en el utrículo y la cóclea²¹.
2. Romper la punta de una aguja de vidrio preparada en un tirador de la micropipeta con pinzas limpias bien observando en el máximo aumento de un binocular microscopio de disección.
   Nota: Es importante optimizar la configuración del extractor de aguja. Agujas con caña del 9 - 12 mm y 20 - 30 μm aberturas funcionan mejor.
3. Eliminar la cultura de una órgano sensorial de la incubadora. Conecte la aguja a la microinyectora y rellene con 2-3 μl de mezcla de tinte y virus. Avanzar la aguja en el órgano sensorial mientras observa con binoculares microscopio de disección.
4. Conduce suavemente la punta de la aguja a través de capas epiteliales y mesenquimales de la azotea de una cultura utricular tridimensional. Inyectar la mezcla viral hasta llenan las cavidades del utrículo y ámpula con colorante azul.
   Nota: Ya que permite fácil acceso a los órganos sensoriales, un plato de Petri de fondo de cristal de 10 mm es óptimo para las inyecciones.
5. Incubar a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono.
   Nota: Cuando la proteína fluorescente verde o roja es utilizada en la estructura viral, la fluorescencia es evidente 24 h después de transducción viral.

Resultados

Órganos sensoriales vestibulares y auditivos de oídos embrionarios, cultivadas en 40 Pa colágeno geles mímico rigidez bajo condiciones embrionarias¹¹, retener relativamente normales estructuras tridimensionales (figura 1) y mantener las células de pelo y apoyo a las células (figura 2 y figura 3). Aunque apoyo la densidad celular disminuye en más del 30% (prueba t

Discusión

Las señales moleculares que medie crecimiento y la diferenciación en el oído interno durante el desarrollo se han estudiaron extensivamente^5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la evidencia obtenida desde el sistema utricular modelo sugiere que señales mecánicas, detectados a través de uniones celulares y la activación de la señ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Surgical Blades	Miltex	4-110
#5 Forceps	Dumont	11252-20
100 mm Petri dish	Sigma	P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips	USA Scientific	1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 well plate	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acetic acid	Sigma	537020
Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction	Invitrogen	A10262
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Bicinchoninic acid assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12	Gibco	11320033
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Fibroblast growth factor	Sigma	F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
Hemocytometer	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insulin	Sigma	I3536
Iridectomy scissors	Zepf Medical Instruments	08-1201-10
Microinjector	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7.4	Gibco	10010023
Phenol Red pH indicator	Sigma	P4633
Pure Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2716
RFP antibody	ChromoTek	5F8
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium hydroxide	Sigma	S8045
Sodium selenite	Sigma	S5261
Tabletop vortex	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan blue	Sigma	T6146