Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

Resumo

Culturas organotypic tridimensional do utrículo murino e cóclea em opticamente clara colágeno eu geles preservar tecido inata morfologia, permitam a estimulação mecânica através do ajuste da rigidez da matriz e permitam a entrega de genes mediada por vírus.

Resumo

Os órgãos sensoriais do ouvido interno estão desafiando a estudar em mamíferos devido a sua inacessibilidade à óptica observação e manipulação experimental. Além disso, apesar de técnicas de cultura existentes permitem que as perturbações bioquímicas, esses métodos não fornecem um meio para estudar os efeitos da força mecânica e a rigidez do tecido durante o desenvolvimento dos órgãos sensoriais ouvido interno. Aqui nós descrevemos um método para a cultura de organotypic tridimensionais da cóclea que supera essas limitações e utrículo murino intacto. A técnica para o ajuste de uma rigidez de matriz tridimensional descrita aqui permite a manipulação da força elástica contra o crescimento do tecido. Portanto, esse método pode ser usado para estudar o papel das forças mecânicas durante o desenvolvimento do ouvido interno. Além disso, as culturas permitem a entrega de genes mediada por vírus, que pode ser usada para experiências de ganho e perda-de-função. Este método de cultura preserva inata de células ciliadas e apoiar as células e serve como uma alternativa potencialmente superior à tradicional cultura bidimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares.

Introdução

O estudo de quase todos os aspectos de desenvolvimento de mamíferos órgão tem sido facilitado pelos sistemas em vitro . Dois métodos principais são usados agora para a cultura de órgãos sensoriais vestibulares: flutuante¹ e aderente² preparações. Ambos os métodos permitem a investigação de cabelo célula vulnerabilidades³ e regeneração^1,4 em vitro. Além disso, as funções do desenvolvimento do entalhe^5,6, Wnt^7,8, fator de crescimento epidérmico do receptor (EGFR)^9,10 , sinalizando cascatas no ouvido interno e têm foi estabelecido, em parte, através do uso de culturas em vitro de epitélios sensoriais. No entanto, diferenciação e crescimento celular são controlados, não só através de sinalização por morphogens, mas também através de sinais físicos e mecânicos como contatos intercelulares, a rigidez da matriz extracelular e mecânicos de alongamento ou constrição. O papel de tais estímulos mecânicos é um desafio para investigar no ouvido interno em desenvolvimento em vivo. Além disso, métodos de cultura livre-flutuante e aderente existentes não são adequados para tais estudos in vitro. Aqui nós descrevemos um método de cultura de organotypic tridimensionais de colágeno géis de rigidez diferentes. Esse método amplamente preserva a arquitetura na vivo dos órgãos sensoriais vestibulares e cocleares e permite a investigação dos efeitos da força mecânica em crescimento e diferenciação¹¹.

Porque os estímulos mecânicos são conhecidos para ativar eventos moleculares a jusante, tais como o hipopótamo sinalização via^12,13,14,15, é importante ser capaz de combinar a estimulação mecânica com manipulações genéticas e bioquímicas. O método de cultura descrito aqui permite a entrega de genes mediada por vírus e, portanto, pode ser usado para estudar a sinalização da mecânica e molecular durante a orelha interna desenvolvimento¹¹.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Rockefeller University e da University of Southern California.

1. (opcional) preparação de colágeno solução de tendões Mouse-tail

Nota: Colágeno soluções estão disponíveis comercialmente. Siga as instruções do fabricante para preparação do gel.

1. Eutanásia em 5-10 ratos de jovem adulto (3-5 semanas de idade) de qualquer estirpe de tipo selvagem com dióxido de carbono em conformidade com o protocolo aprovado pelo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização relevantes¹⁶. Recolher as caudas e desinfectar os submergindo em etanol a 70% por um período mínimo de 4 h à temperatura ambiente.
   Nota: Incubação por mais de 48 h deve ser evitada, pois resulta em desidratação excessiva de tecido e dificulta o processo de extração do tendão.
2. Retire a pele de cada cauda apresentando um corte longitudinal com uma lâmina de bisturi e retraindo a pele inteira com fórceps. Transferi as caudas de pele para um prato de Petri de 100mm preenchido com etanol a 70% limpa e corte-as em segmentos de 10 mm.
   Nota: Descarte as partes mais finas das caudas, que são difíceis de manipular.
3. Usando fórceps, fixe cada segmento da cauda para o fundo da caixa de Petri e usar um segundo par de pinças bem para extrair os tendões da cauda um de cada vez. As fibras do tendão individual devem surgir com resistência mínima.
   Nota: Velha e chata #5 pinças funcionam bem para esta etapa.
4. Preparar 100 mL de uma solução de 0,1% (em volume) de ácido acético em água estéril, a nível molecular e adicionar 10 mL de solução para uma placa de Petri estéril-100mm. Os tendões de transferência para o prato de Petri e deixe por 1h à temperatura de desnaturação do colágeno eu.
5. Use uma tesoura esterilizada de bisturi ou iridectomy com pontas rombas, curvas para picar o tendão em fragmentos de 1-2 mm. Transferir os tendões picados para um tubo estéril de 50 mL e adicionar 0,1% de ácido acético para trazer o volume para 50 mL.
   Nota: Utilizar quatro ou cinco caudas para cada 50 mL de ácido para alcançar um colágeno concentração de 2.0-2.5 mg/mL.
6. Refrigere o colágeno a 4 ° C por um período mínimo de 48 h para facilitar a desnaturação da proteína completa. Vórtice com um vórtice do tabletop, definido como a velocidade máxima durante 1 min duas vezes por dia.
7. Medir a concentração de proteína da solução usando o ensaio de ácido bicinchoninic, ajustar o colágeno concentração de 2.0-2.5 mg/mL, adicionando solução de 0,1% de ácido acético e loja a 4 ° C.
   Nota: Colágeno solução pode ser armazenada por um a dois anos.
8. (Opcional) Centrifugue o colágeno solução a 2.000 x g, durante 1 h a 4 ° C e uso a fração superior translúcida (cerca de metade do volume), para alcançar o colágeno opticamente claro coagula na secção 4.

2. dissecação de órgãos vestibulares e auditivos

1. Eutanásia em ratos grávidos de toda a tensão com dióxido de carbono em conformidade com o protocolo aprovado pelo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização relevantes¹⁶. Extrair e decapitar os embriões.
   Nota: Lfng-CreER^T2/tdTomato ratos podem ser usados para permitir a rotulagem permanente das células após a exposição a 4-hydroxytamoxifen¹⁷de apoio.
2. Esterilize todas as superfícies de trabalho e instrumentos de dissecção, incluindo dois pares de pinças #5 e um cabelo faca¹⁸, limpando-os com etanol a 70%.
3. Dividi cada cabeça em duas metades, introduzindo um corte longitudinal com uma lâmina de bisturi estéril ou usando dois pares de pinças #5. Extrair os ossos temporais, que contêm o ouvido interno¹⁹e colocá-los em 15 mL de solução salina equilibrada gelado do Hank (HBSS) em uma placa de Petri 60mm. Mantenha o prato no gelo.
   Nota: Embriões em uma variedade de estágios de E13.5 de E18.5 têm sido utilizados com sucesso.
4. (Opcional) Lavar o ouvido interno agitando-os delicadamente em um tubo cônico de 50 mL, contendo 30 mL gelada HBSS e substituindo o HBSS três ou quatro vezes. Mantenha o tubo no gelo.
   Nota: Esta etapa limita eventual contaminação da cultura de tecidos e traz rapidamente a temperatura de 4 ° C, o que impede a morte de degradação e células do tecido.
5. Usando dois pares de fina #5 pinças, separar o ouvido interno do osso temporal e transferir as orelhas, três ou quatro de cada vez, em um prato de Petri 60mm preenchido com HBSS gelada.
6. Disse os órgãos sensoriais vestibulares.
   1. Orientar o lado medial orelhas acima e localize o utrículo. Com dois pares de pinças #5, remova a cartilagem que cercam os órgãos vestibulares. Delicadamente cortar o nervo vestibular, a conexão entre o utrículo e saccule e os canais semicirculares, como mostrado na Figura 1. Puxe delicadamente o utrículo e as anexado ampolas dos canais semicirculares superiores e horizontais na orelha.
      Nota: Esse método pode ser usado no ouvido interno dos estágios E16.5 - E18.5. Preserve os fragmentos de cartilagem para a seção 3 abaixo.
7. Disse a cóclea.
   1. Remova o tecido cartilaginoso envolvendo o órgão da audição com dois pares de pinças #5. Delicadamente, cortar a conexão entre a base coclear e o saccule conforme mostrado na Figura 1.
      Nota: Para estágios E13.5 - E14.5, suavizam a cartilagem antes da dissecação, tratando o interior das orelhas com colagenase 0,25% eu em solução tampão fosfato salino (PBS) durante 5 min à temperatura ambiente. Preserve os fragmentos de cartilagem para a seção 3 abaixo.
8. Usar uma pipeta de 200 µ l equipado com uma ponta larga antiaderente, transferir o utricles e cochleae para um prato de Petri de 30mm preenchido com meio de cultura composto por DMEM/F12 suplementadas com 33mm Dglucose, bicarbonato de sódio de 19 mM, 15 mM, 4(2hydroxyethyl)- ácido 1piperazineethanesulfonic (HEPES), glutamina 1 mM, 1 mM nicotinamida, 20 mg/L fator de crescimento epidérmico, 20 mg/L fator de crescimento, insulina 10 mg/L, transferrina 5,5 mg/L e Selenito de sódio 5 µ g/L.
9. Manter os preparativos do utrículo para até 3 h a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono para permitir a cicatrização dos cortes no epitélio introduzida durante a dissecção. Preparações de cóclea devem ser transferidas para o gel de colágeno 10 min após a dissecação.
   Nota: Porque a dissecação é realizada em HBSS gelada, não há nenhuma necessidade para pré-aquecer o meio de crescimento de 37 ° C.

3. (opcional) ajustar o colágeno rigidez do Gel com a adição de diferentes concentrações de condrócitos

Nota: O método para isolamento de condrócitos foi modificado de Gosset et al ²⁰

1. Preparar uma solução de 1% de colagenase em estéril de 1X PBS e loja alíquotas de µ l 100-200 a-80 ° C. Descongelar no gelo, quando necessário, evitando vários ciclos de congelamento e descongelamento.
2. Bem de uso de fórceps para recolher os pedaços de cartilagem que sobraram da dissecação dos órgãos vestibulares e auditivos de orelhas de 10-12. Tecidos conjuntivos e ouvido interno separados da cartilagem. Transferir a cartilagem para um prato de Petri de 30 mm e adicione 300 µ l de meio de cultura estéril.
3. Use uma tesoura de lâmina ou iridectomy de bisturi estéril com pontas curvas sem corte para cortar o tecido para conseguir peças de cartilagem aproximadamente 0,5 mm de comprimento.
4. Adicionar colagenase eu ao meio com cartilagem a obter uma concentração final de enzima de 0,25%. Transferi a cápsula para uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C, gaseados com 5% de dióxido de carbono. Pipeta vigorosamente, usando uma pipeta de 1.000 µ l de cada 20 min até pedaços de cartilagem se dissociam e já não são distinguíveis na solução, então incubar por um adicional de 20 min.
   Nota: No caso de preparações o utrículo, condrócito isolamento pode ser realizado durante a etapa de 2,9; demora cerca de 2 h (rodadas de pipetagem de 3-4).
5. Recolher a suspensão de células em um tubo cônico de 15 mL e ajustar o volume para 10ml com PBS 1x estéril. Centrifugar 800 x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS 1x estéril. Centrifugar a 800 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
   Nota: É fundamental lavar as células duas vezes; qualquer restante colagenase que digerirá o eu do gel de colágeno.
6. Usando uma pipeta de 200 µ l, adicione 100 µ l de meio de cultura para o centrifugado e pipeta suavemente para ressuspender. Contar as células usando um hemocytometer e mantê-las na prévia de gelo para usar.
7. Para aumentar a rigidez do gel, adicionar condrócitos para o colágeno neutralizado eu solução (seção 1) do gel e misture rapidamente para distribuir as células em todo o gel antes da solidificação.
   Nota: O módulo de elasticidade do colágeno eu gel (uma medida da rigidez), aumenta linearmente com o número de condrócitos adicionado¹¹. A relação é descrita pela função linear determinada experimentalmente E = 206· NC + 15, em que E é o módulo de elasticidade em Pascals e Nc é o número de condrócitos em milhões. Para um protocolo detalhado para gel medições de rigidez por favor consulte o original do artigo¹¹.

4. Coloque o órgão sensorial auditivo ou Vestibular em um eu do Gel de colágeno

1. Em um tubo estéril de 1,5 mL, preparar o colágeno solução de polimerização misturando 160 µ l de PBS de x 10 com indicador de pH vermelho de fenol, µ l 133 de 0,34 M de hidróxido de sódio, 70 µ l de bicarbonato de sódio de 0,9 M e 40 µ l de 1 M de HEPES. Mantenha o tubo no gelo.
   Nota: Esta receita fornece a solução de polimerização necessária para preparar 2 mL de colágeno eu do gel, mas pode ser dimensionado conforme necessário.
2. Mix 100 µ l de solução de polimerização e 400 µ l de colágeno solução no gelo pipetando delicadamente acima e para baixo em um tubo de 1,5 mL refrigerado. Para aumentar a rigidez do gel, adicionar 50 µ l de meio de cultura contendo condrócitos e misture suavemente, conforme descrito na seção 3.
3. Transferir 500 µ l do colágeno neutralizado solução para um prato de Petri 30mm refrigerados com uma pastilha de vidro de 10 mm-fundo ou para um poço de uma placa de quatro.
   Nota: É fundamental para manter todos os reagentes no gelo para evitar a polimerização rápida e irregular do colágeno eu.
4. Transferir o cochleae ou utricles, para o colágeno neutralizado solução e ajustar os órgãos para a sua posição desejada com um cabelo estéril faca¹⁸ ou um par de pinças bem.
   Nota: Colágeno polimerização torna-se perceptível após 1-2 min como a solução torna-se turva.
5. Depois que a solução ao redor do tecido tem polimerizado, coloque a placa de Petri ou placa de quatro por 20 min a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono para garantir a completa polimerização.
6. Adicione 3 mL de meio de cultura suplementado com 0,5% de soro fetal bovino (FBS) por placa de Petri ou 500 µ l do mesmo meio por alvéolo de uma placa de quatro. Manter a cultura a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono. Se desejado, completar o meio de crescimento com 10 µM 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) para rotular a proliferação de células.
   Nota: Altas concentrações de FBS podem ser usadas se desejado.

5. virais injeções em culturas tridimensionais de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

1. Degele o vírus desejado no gelo e misture com a solução de azul de Tripan em um tubo cônico de 0,5 mL, para obter uma concentração final de tintura de 0,05%. Use tintura de x de 10-20 para evitar substancial diluição do vírus. Manter-se no gelo.
   Nota: Adenovírus serótipo 5 funciona melhor para infectar células suportando o utrículo¹⁹, Considerando que o vírus adeno-associado Anc80 podem infectar tanto células ciliadas e apoiar as células no utrículo e a cóclea,²¹.
2. Quebre a ponta de uma agulha de vidro preparada em um extrator de micropipeta com pinça limpa bem enquanto observá-lo com a maior ampliação de um binóculo, microscópio de dissecção.
   Nota: É importante otimizar as configurações sobre o extrator de agulha. Agulhas com 9 - 12mm hastes e 20 - 30-µm aberturas funcionam melhor.
3. Remova uma órgão sensorial cultura da incubadora. Anexar a agulha para o microinjector e preenchê-lo com 2-3 µ l de mistura de corante e vírus. Avance a agulha para o órgão sensorial enquanto observa-lo sob o binóculo, microscópio de dissecção.
4. Dirigir suavemente a ponta da agulha através de camadas epiteliais e mesenquimais do telhado de uma cultura utricular tridimensional. Injete a mistura viral até as cavidades do utrículo e Ampollas preencher com o corante azul.
   Nota: Porque permite acesso fácil aos órgãos sensoriais, um prato de Petri de vidro de 10 mm-fundo é ideal para as injeções.
5. Incube a 37 ° C numa incubadora de tecido-cultura gaseados com 5% de dióxido de carbono.
   Nota: Quando a proteína fluorescente verde ou vermelha é usada na construção de viral, a fluorescência é aparente 24h após transdução viral.

Resultados

Órgãos sensoriais vestibulares e auditivos de orelhas embrionárias, cultivadas em 40-Pa colágeno géis imitando rigidez baixa condições embrionárias¹¹, reter relativamente normais estruturas tridimensionais (Figura 1) e manter as células ciliadas e apoiar as células (Figura 2 e Figura 3). Embora apoiando a densidade celular diminui por mais de 30% (teste t de...

Discussão

Os sinais moleculares que crescimento mediato e diferenciação na orelha interna durante o desenvolvimento foram extensivamente estudaram^5,6,7,8,9,10. No entanto, evidências obtidas a partir do sistema modelo utricular sugerem que pistas mecânicas, sentidas-se através de cruzamentos de celular e a ativação da sinalizaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Surgical Blades	Miltex	4-110
#5 Forceps	Dumont	11252-20
100 mm Petri dish	Sigma	P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips	USA Scientific	1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 well plate	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acetic acid	Sigma	537020
Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction	Invitrogen	A10262
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Bicinchoninic acid assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12	Gibco	11320033
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Fibroblast growth factor	Sigma	F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
Hemocytometer	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insulin	Sigma	I3536
Iridectomy scissors	Zepf Medical Instruments	08-1201-10
Microinjector	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7.4	Gibco	10010023
Phenol Red pH indicator	Sigma	P4633
Pure Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2716
RFP antibody	ChromoTek	5F8
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium hydroxide	Sigma	S8045
Sodium selenite	Sigma	S5261
Tabletop vortex	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan blue	Sigma	T6146