Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

Özet

Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.

Özet

İç kulak duyu organları deneysel manipülasyon ve optik gözlem için onların erişilememesi nedeniyle memelilerde çalışmaya zorlu. Ayrıca, mevcut kültür teknikleri biyokimyasal tedirginlikler olanak, ancak bu yöntemler mekanik kuvvet ve doku sertlik iç kulak duyu organları geliştirilmesi sırasında çalışması için bir yol sağlamaz. Burada olduğu gibi fare utricle ve bu sınırlamaların üstesinden koklea üç boyutlu organotypic kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan üç boyutlu matris sertlik düzeltilmesi için teknik manipülasyon doku büyüme karşı elastik kuvvet verir. Bu yöntem bu nedenle iç kulak geliştirme sırasında mekanik Kuvvetleri rolü eğitim için kullanılabilir. Ayrıca, kültürler kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu deneyler için kullanılan virüs-aracılı gen teslim izin verir. Bu kültür yöntemi doğuştan gelen saç hücreleri koruyan ve destekleyen hücreleri ve vestibüler ve işitme duyu organları geleneksel iki boyutlu kültür potansiyel olarak üstün bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Giriş

Pek çok yönden memeli organ gelişiminin incelenmesi, vitro sistemleri tarafından kolaylaştırılmış. İki temel yöntem şimdi vestibüler duyu organları kültürü için kullanılan: serbest yüzer¹ ve yapışık² hazırlıkları. Her iki yöntem saç hücre güvenlik açıkları³ ve rejenerasyon^1,4 içinde vitrosoruşturma izni. Buna ek olarak, çentik^5,6, Wnt^7,8ve iç kulak Cascade'lerde sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR)^9,10 gelişimsel rollere sahip , kısmen, duyu epiteli vitro kültürleri kullanımı ile kurulmuştur. Ancak, hücre büyümesi ve farklılaşma, değil sadece morfojenlerdeki, ama aynı zamanda aracılığıyla gibi hücreler arası kişiler, fiziksel ve mekanik yardımlar tarafından hücre dışı matriks, sertliği sinyal ve mekanik germe veya daralma ile kontrol edilir. Böyle mekanik uyaranlara içinde gelişmekte olan iç kulak içinde vivoaraştırmak için zorlu bir roldür. Ayrıca, varolan serbest yüzer ve yapışık kültür yöntemleri için bu tür çalışmalar içinde vitrouygun değildir. Burada bir yöntemi açıklamak için kollajen kültüründe üç boyutlu organotypic ben jelleri değişen sertlik. Bu yöntem büyük ölçüde vestibüler ve koklear duyu organları içinde vivo mimarisini korur ve mekanik kuvvet etkisi büyüme ve farklılaşma¹¹incelenmesi sağlar.

Mekanik stimülasyon birleştirmek önemli çünkü mekanik uyaranlara yolu^12,13,14,15, sinyal su aygırı gibi aşağı akım moleküler olayları etkinleştirmek bilinmektedir biyokimyasal ve genetik manipülasyon ile. Burada anlatılan kültür yöntemi virüs-aracılı gen teslim izin verir ve bu nedenle mekanik ve moleküler iç kulak geliştirme¹¹sırasında sinyal eğitim için kullanılabilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada Güney Kaliforniya Üniversitesi ve hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. (isteğe bağlı) kolajen hazırlanması ben eriyik--dan Mouse-tail tendonlar

Not: Kollajen ben ticari olarak kullanılabilir çözümlerdir. Jel hazırlık için üreticinin yönergelerini izleyin.

1. 5-10 Genç Yetişkin (3-5 hafta eski) fare ile karbon dioksit ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi¹⁶tarafından onaylanmış protokol uyarınca herhangi bir vahşi türü baskı ötenazi. Kuyrukları toplamak ve onları 4 h, oda sıcaklığında en az % 70 etanol içinde batış tarafından dezenfekte.
   Not: O aşırı doku dehydration içinde sonuçları ve tendon ayıklama işlemi engellemektedir kuluçka için 48 h üzerinden kaçınılmalıdır.
2. Cilt her kuyruk boyuna kesilmiş bir neşter bıçakla tanıtan ve tüm cilt forseps ile geri çeker çıkarın. Derisi yüzülmüş kuyrukları temiz % 70 etanol ile dolu ve 10 mm parça halinde kesin 100-mm Petri kabına aktarın.
   Not: İşlemek zor olan kuyrukları, en ince parçalarını atın.
3. Forseps kullanarak, her kesimi Petri kabına altına kuyruk güvenli ve iyi forseps ikinci bir çifti tendonlar kuyruk bir teker teker ayıklamak için kullanın. Bireysel tendon lifleri ile en az direnç ortaya.
   Not: Eski, sıkıcı #5 forseps iş de bu adım için.
4. 100 mL steril, moleküler düzeyde su asetik asit (cilt tarafından) bir % 0,1 çözeltisi hazırlamak ve bu çözüm 10 mL steril 100-mm Petri kabına için ekleyin. Tendon Petri kabına aktarın ve ben bırakın kollajen denatüre için oda sıcaklığında 1 h için.
5. Steril neşter ya da iridectomy makas künt, kavisli ipuçları ile 1-2 mm parçalara tendon kıyma için kullanın. Steril bir 50 mL tüp kıyılmış tendon transferi ve birim için 50 mL getirmek için % 0,1 asetik asit ekleyin.
   Not: Dört kullanın veya beş kuyrukları için her 50 mL asit bir kollajen ulaşmak için de ben 2.0-2.5 mg/mL konsantrasyonu.
6. Kollajen soğutmak ben çözüm tam protein denatürasyon kolaylaştırmak için 48 saat en az 4 ° C'de. Girdap masa üstü bir girdap ile günde iki kez 1 dk. için maksimal hıza ayarlayın.
7. Bicinchoninic asit tahlil kullanarak çözüm protein konsantrasyonu ölçmek, kollajen ayarlamak ben 4 ° C'de % 0,1 çözüm, asetik asit, mağaza ekleyerek 2.0-2.5 mg/ml konsantrasyonu
   Not: Kollajen ben çözüm bir iki yıl boyunca saklanabilir.
8. (İsteğe bağlı) Kollajen santrifüj kapasitesi ben 2.000 x g 1 h 4 ° C ve optik net kollajen ulaşmak için yarı saydam üst kesir (yaklaşık yarısı birimin), Bölüm 4'te jelleri kullanım için bir çözüm.

2. diseksiyon vestibüler ve işitme organları

1. Herhangi bir baskı ile ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi¹⁶tarafından onaylanmış protokol uyarınca karbon dioksit hamile fareler ötenazi. Hulâsa ve embriyoların başını kesmek.
   Not: Lfng-CreER^T2/tdTomato fareler kalıcı hücreleri maruz 4-hydroxytamoxifen¹⁷üzerine destekleme etiketleme izin vermek için kullanılabilir.
2. Tüm çalışma yüzeyleri ve diseksiyon aletleri, % 70 etanol ile temizleyerek #5 forseps ve bir saç bıçak¹⁸, iki çift de dahil olmak üzere sterilize.
3. İki yarım bir boyuna kesim bir steril neşter bıçakla tanıtan veya iki çift #5 forseps kullanarak her kafasından bölün. İç kulak¹⁹içeren, temporal kemik ayıklamak ve buz gibi Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 60 mm Petri kabına içinde 15 mL içine koyun. Buz üzerinde çanak tutmak.
   Not: Embriyo aşamalara E13.5 gelen E18.5 bir mesafeden başarıyla kullanılmaktadır.
4. (İsteğe bağlı) Yavaşça onları 30 mL içeren 50 mL konik tüp içinde sallayarak iç kulak yıkama buz gibi HBSS ve HBSS üç ya da dört kez değiştirme. Tüp buz üzerinde tutun.
   Not: Bu adım doku kültürü olası bulaşma sınırlar ve hızlı sıcaklık 4 ° C, doku bozulması ve hücre ölüm önleyen getiriyor.
5. İki çift iyi #5 forseps kullanarak, iç kulak şakak kemiğinden ayrı ve kulaklar, üç veya dört teker, 60 mm Petri kabına buz gibi HBSS ile dolu içine transfer.
6. Vestibüler duyu organları incelemek.
   1. Kadar kulakları medial tarafa yönlendirmek ve utricle bulun. #5 forseps iki çift ile vestibüler organları çevreleyen kıkırdak kaldırın. Yavaşça vestibular sinir, utricle ve saccule ve semisirküler kanallar arasında bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever. Utricle ve üstün ve yatay semisirküler kanallar kulağından ekli ampullae yavaşça çekin.
      Not: Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış iç kulaklara Etap E16.5 - E18.5. Kıkırdak parçaları aşağıda bölüm 3 için korumak.
7. Koklea incelemek.
   1. #5 forseps iki çift ile işitme organı çevreleyen kıkırdak dokuyu. Yavaşça koklear Bankası ve saccule arasındaki bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever.
      Not: İç davranarak aşamaları E13.5 - E14.5, kıkırdak diseksiyon önce yumuşatmak için kulaklar %0.25 collagenase ile ben fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm için oda sıcaklığında 5 dk içinde. Kıkırdak parçaları aşağıda bölüm 3 için korumak.
8. 200-µL damlalıklı kullanarak geniş yapışmaz bir ucu ile donatılmış, utricles ve cochleae DMEM/F12 33 mM Dglucose, 19 mM sodyum bikarbonat, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - ile desteklenmiş oluşan büyüme orta dolu 30 mm Petri kabına aktarın 1piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM glutamin, 1 mM nikotinamid, 20 mg/L epidermal büyüme faktörü, 20 mg/L fibroblast büyüme faktörü, 10 mg/L insülin, 5.5 mg/L transferrin ve 5 µg/L Sodyum selenit.
9. Kesim sırasında diseksiyon tanıttı epitel içinde şifa izin vermek için en fazla 3 saat % 5 karbon dioksit ile benzin bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de utricle hazırlıkları korumak. Koklea hazırlıklar kollajen jel 10 dk sonra diseksiyon aktarılmalıdır.
   Not: Diseksiyon buz gibi HBSS gerçekleştirildiğinden, 37 ° c büyüme ortamına önceden ısıtmak için gerek yoktur

3. (isteğe bağlı) kolajen ayarlamak değişen kondrosit konsantrasyonları ekleyerek sertlik jel

Not: Kondrosit yalıtım için yöntem Gosset vd. güncellenmiştir ²⁰

1. Collagenase % 1 çözeltisi hazırlamak ben PBS ve mağaza 100-200 µL aliquots-80 ° C'de x steril 1 Gerektiğinde buza defrost, birden çok donma-çözülme çevrimleri kaçınarak.
2. Kullanım iyi forseps 10-12 kulakları vestibüler ve işitsel organ diseksiyon üzerinden kalan kıkırdak parçaları toplamak için. Ayrı bağ ve iç kulak dokulardan kıkırdak. Kıkırdak için 30 mm Petri kabına aktarmak ve steril büyüme ortamının 300 µL ekleyin.
3. Steril neşter bıçak veya iridectomy makas künt eğri ipuçları ile doku kıkırdak parçaları yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda ulaşmak için bin dereden su getirmek için kullanın.
4. Collagenase ekleyin ben son enzim konsantrasyonu % 0.25 ulaşmak için kıkırdak ile orta. Çanak doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de aktarın. Kıkırdak parçaları ayırmak ve artık çözümde ayırdedilebilir kadar şiddetle 1.000 µL damlalıklı her 20 dk kullanarak damlalıklı sonra bir ek 20 dk için kuluçkaya.
   Not: Utricle hazırlıkları durumunda, kondrosit yalıtım adım sırasında 2,9 gerçekleştirilebilir; yaklaşık 2 saat (3-4 pipetting mermi) alır.
5. 15 mL konik tüp hücre süspansiyon toplamak ve 10 ml steril 1 x PBS ile ses seviyesini. 4 ° C'de 5 min için 800 x g, santrifüj Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril 1 x PBS hücrelerde resuspend. Vasıl 800 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
   Not: Hücreleri iki kez yıkamak için önemlidir; kalan herhangi bir collagenase ben jel kollajen sindirmek.
6. 200-µL damlalıklı kullanarak, kültür ortamının 100 µL hücre Pelet ve damlalıklı yavaşça resuspend ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve kullanmadan buz önce üzerinde proje.
7. Jel sertlik artırmak için kondrosit jel çözüm (Bölüm 1) ve hızla karıştırın etkisiz kollajen için eklemek hücreleri katılaşma önce jel boyunca dağıtmak için.
   Not: Elastik modül kollajen (sertlik ölçümü) jel, kondrosit sayısı ile doğrusal olarak artar ekledi¹¹. İlişkinin deneysel olarak kararlı doğrusal fonksiyon E tarafından anlatılan 206· = NC + 15 E paskal ve Nc elastik modül olan, milyonlarca kondrosit sayısıdır. Jel için detaylı bir protokol sertlik ölçümleri lütfen Orijinal Makale¹¹' e bakın.

4. ben jel bir kollajen vestibüler veya işitme duyu organı yerleştirin

1. Steril bir 1.5 mL tüp içinde kollajen hazırlamak ben 10 x PBS fenol red pH göstergesi, 133 µL 0,34 M sodyum hidroksit, 70 µL 0.9 M sodyum bikarbonat ve 1 M HEPES 40 µL 160 µL karıştırma tarafından polimerizasyon çözüm. Tüp buz üzerinde tutun.
   Not: Bu tarifi 2 mL jel, ama gerektiği gibi ölçeklendirilebilir kollajen hazırlamak için gerekli olan polimerizasyon çözüm sağlar.
2. Mix 100 µL polimerizasyon çözüm ve kollajen 400 µL ben çözüm yavaşça yukarı ve aşağı bir soğutulmuş 1.5 mL tüp içinde pipetting tarafından buz üzerinde. Jel sertlik artırmak için büyüme ortamının kondrosit içeren 50 µL ve Bölüm 3'te açıklandığı gibi hafifçe karıştırın.
3. Etkisiz kollajen 500 µL aktarım ben çözüm soğutulmuş 30 mm Petri kabına 10 mm cam alt eklemek veya bir dört-şey plaka bir kuyu.
   Not: Hızlı ve düzensiz polimerizasyon kollajen önlemek için buz üzerinde tüm reaktifler tutmak için önemlidir ben.
4. Hızlı bir şekilde cochleae veya utricles etkisiz kollajen transfer ben çözüm ve istenen konumlarını bir steril saç bıçak¹⁸ ya da iyi forseps çifti ile organları ayarlayın.
   Not: Kollajen ben çözüm bulanık hale geldikçe polimerizasyon 1-2 dakika sonra fark olur.
5. Sonra doku etrafında çözüm polimerli, Petri kabına veya dört-şey plaka 20 min için bir doku kültürü kuluçka eksiksiz polimerizasyon sağlamak için % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de yerleştirin.
6. Petri kabına veya aynı orta iyi bir dört-şey plaka başına 500 µL % 0.5 fetal Sığır serum ile (FBS) takıma büyüme orta 3 mL ekleyin. Kültür bir doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de korumak. İstenirse, büyüme orta ile 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) Proliferasyona hücreleri etiketlemek için ek.
   Not: Daha yüksek FBS konsantrasyonları istenirse kullanılabilir.

5. viral enjeksiyonları vestibüler ve işitme duyu organları üç boyutlu kültürleri

1. Buz üzerinde istenen virüs defrost ve trypan mavi çözüm % 0.05 son boya konsantrasyon elde etmek için bir 0.5 mL konik tüp ile karıştırın. 10-20 x boya önemli seyreltme virüs önlemek için kullanın. Buz üstünde tutun.
   Not: Adenovirus serotip 5 işleri en iyi virüs Anc80 adeno ilişkili her iki saç hücreleri enfekte olabilir, ancak utricle¹⁹, destek hücreleri bulaşmasını ve utricle ve koklea²¹hücreleri desteklemek.
2. Bir micropipette çektirmenin bir binoküler mikroskop dissekan en yüksek büyütme oranında kesilmediğini gözleyerek temiz iyi forseps ile hazırlanan cam iğne ucu kır.
   Not: İğne çektirme ayarları optimize etmek önemlidir. 9 - 12 mm shanks iğne ve 20 - 30 µm açıklıklar en iyi çalışır.
3. Bir organ duyusal kültür kuluçka makinesi kaldırın. İğne için microinjector ekleyin ve 2-3 µL boya ve virüs karışımı ile doldurun. İğne duyusal organ binoküler mikroskop dissekan altında kesilmediğini gözleyerek ilerlemek.
4. Yavaşça iğne ucu üç boyutlu bir utricular kültür çatı epitelyal ve mezenkimal katmanı üzerinden götürmek. Mavi boya ile utricle ve ampullae boşluklar doldurana kadar viral karışımı enjekte et.
   Not: Çünkü duyu organları kolay erişim sağlar, 10 mm cam alt Petri kabına enjeksiyonlar için en iyi yöntemdir.
5. Bir doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Kırmızı veya yeşil flüoresan protein viral yapı içinde kullanıldığında, floresans belirgin 24 saat sonra virüs iletim var.

Sonuçlar

Vestibüler ve işitme duyu organları embriyonik kulaklar, gelen kültürlü 40-Pa kolajen ben düşük sertlik embriyonik koşulları¹¹taklit jelleri, nispeten normal üç boyutlu yapılar (Şekil 1) korumak ve saç hücreleri korumak ve Destek hücreleri (Şekil 2 ve Şekil 3). Her ne kadar hücre yoğunluğu destekleyen üzerinden % 30 oranında azaltır (öğrenci t -...

Tartışmalar

Aracılık büyüme ve iç kulak farklılaşma Geliştirme sırasında olmuştur moleküler sinyaller kapsamlı^5,6,7,8,9,10okudu. Ancak, hücre kavşaklar ve su aygırı sinyal, harekete geçirmek ile hissedilen, mekanik yardımlar bu işlemleri^2,11'^, de ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Surgical Blades	Miltex	4-110
#5 Forceps	Dumont	11252-20
100 mm Petri dish	Sigma	P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips	USA Scientific	1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 well plate	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acetic acid	Sigma	537020
Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction	Invitrogen	A10262
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Bicinchoninic acid assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12	Gibco	11320033
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Fibroblast growth factor	Sigma	F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
Hemocytometer	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insulin	Sigma	I3536
Iridectomy scissors	Zepf Medical Instruments	08-1201-10
Microinjector	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7.4	Gibco	10010023
Phenol Red pH indicator	Sigma	P4633
Pure Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2716
RFP antibody	ChromoTek	5F8
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium hydroxide	Sigma	S8045
Sodium selenite	Sigma	S5261
Tabletop vortex	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan blue	Sigma	T6146