Grabaciones de Sensillum solo para langosta palpo Sensilla Basiconica

Resumen

Este papel describe un protocolo detallado y muy eficaz para las grabaciones de solo sensillum de la basiconica sensilla en los palpos de partes bucales de insectos.

Resumen

Los palpos de piezas bucales de la langosta se consideran órganos gustativos convencionales que juegan un papel importante en la selección de alimentos de una langosta, especialmente para la detección de señales químicas no volátil por sensilla chaetica (anteriormente llamado terminal sensilla o sensillo crested). Hay creciente evidencia de que estos palpos tienen también una función olfatoria. Un receptor odorante (LmigOR2) y una proteína odorante (LmigOBP1) han sido localizados en las neuronas y células de accesorio, respectivamente, en el basiconica sensilla de los palpos. Sensillum sola grabación (SSR) se utiliza para registrar las respuestas de las neuronas receptoras del olor, que es un método eficaz para la detección de ligandos activos sobre los receptores de olor específico. SSR se utiliza en estudios funcionales de receptores odorantes en sensillo palp. La estructura de la basiconica sensilla situado en la cúpula de los palpos difiere un poco de la estructura de los de las antenas. Por lo tanto, cuando se realiza un SSR provocada por olores, algunos consejos específicos pueden ser útil para la obtención de resultados óptimos. En este papel, se presenta un protocolo detallado y altamente eficaz para un SSR de insectos palpo sensilla basiconica.

Introducción

Los animales han desarrollado una serie de órganos quimiosensoriales que detecta señales químicas exógenas. En los insectos, los órganos quimiosensoriales más importantes son las antenas y los palpos. En estos órganos, varios tipos de pelos quimiosensoriales, llamados chemosensory sensilla, están inervados por neuronas quimiosensoriales (CSNs) dentro de los pelos. CSNs en sensilla chemosensory reconocen señales químicas específicas a través de la transducción de estímulos químicos a potenciales eléctricos que posteriormente se transfieren hasta el sistema nervioso central^1,2,3 .

CSNs expresan receptores quimiosensoriales varios [p. ej., receptores de olor (ORs)], ionotrópicos (IRs) de los receptores y los receptores gustativos (GRs) en sus membranas, que codifican señales químicos exógenos asociados con diferentes tipos de chemosensation ^4,5,6. La caracterización de CSNs es clave para el esclarecimiento de los mecanismos celulares y moleculares de insectos quimiorrecepción. Ahora solo sensillum grabación (SSR) es una técnica ampliamente utilizada para la caracterización de insecto CSNs en la sensilla antenal de muchos insectos, incluyendo moscas⁷,⁸de polillas, escarabajos de⁹,¹⁰de áfidos, langostas¹¹, y las hormigas¹². Sin embargo, pocos estudios han aplicado un SSR a palpos insectos^{13,14,15,16,17}, ya que las estructuras particulares de su sensillo un grabación electrofisiológica difícil¹⁸.

Enjambres de langostas (Orthoptera) a menudo causan graves daños y pérdidas económicas¹⁹. Los palpos se creen que juegan un papel importante en la selección del alimento de langosta^{20,21,22,23,24}. Dos tipos de chemosensory sensilla son investigados por un microscopio electrónico de barrido (SEM). Generalmente, se observan en cada cúpula de langosta palpos¹⁸350 sensilla chaetica y sensilla basiconica de 7-8. Chaetica sensillo son sensillo gustativo que detecta señales químicas no volátil, mientras que sensillo basiconica tienen una función olfativa, detección de señales químicas volátiles.

En palpos de la langosta, los diámetros de las tomas del pelo de la basiconica de la sensilla (ca. 12 μm), son mucho mayores que los de sensilla chaetica (ca. 8 μm)^18,25. La pared cuticular de la basiconica sensilla en los palpos es mucho más gruesa que el de sensillo antenal¹⁸. Además, la cúpula de la palpo tiene líquido contenido dentro de una cutícula flexible. Estas características significan que una penetración con un microelectrodo y adquisición de señales electrofisiológicas buena es más difícil que para sensillo antenal. En este documento, un protocolo SSR detallado y altamente eficaz para langosta palpo sensilla basiconica se presenta con un video.

Protocolo

1. preparación de instrumentos y del insecto

1. Preparación de tungsteno electrodos y estímulos soluciones
   1. Fijar un nuevo alambre de tungsteno (0,125 mm de diámetro, longitud de 75 mm) en un micromanipulador y afilar en una solución de nitrito (NaNO₂) de sodio 10% (p/v) en una jeringa de 10 V proporcionado por una fuente de alimentación para 1 min. bajo un estereomicroscopio (aumento de X 40).
   2. Sumerja el alambre de tungsteno afilada repetidamente en la NaNO₂ solución al 10%, aproximadamente de 4 mm a 5 V en < 1 minuto (figura 1A).
   3. Examinar el diámetro de la punta de tungsteno afilada con frecuencia bajo el estereomicroscopio hasta que esté lo suficientemente fina para penetrar la cutícula de un sensillum olfativa del palpo de langostas (figura 1B).
   4. Preparar las soluciones de estímulo. Diluir cada uno de la sustancia de estímulo químico en aceite mineral. Diluir 1-nonanol y ácido nonanoico en diluciones de 10%. Diluir E-2-hexenal y hexanal en 10^-2, 10^-3, 10^-4y 10^-5.
   5. Preparar Pasteur los tubos que llevan los estímulos: Inserte las tiras de papel de filtro (de 2 cm de largo, de 0,5 cm de ancho) en los tubos de Pasteur, agregar las soluciones diluidas de estímulo (cada 10 μl) a las tiras de papel de filtro y luego conecte los tubos de Pasteur con pipetas (1 ml).
2. Preparar el insecto
   1. Posterior las langostas (Locusta migratoria) con plántulas de trigo fresco bajo condiciones de hacinamiento en una humedad relativa de 60%, una temperatura de 28-30 ° C y un fotoperíodo de 18:6 h (luz: oscuridad). Elija de 1 a 3 días de edad: 5^º instar ninfas de langosta y quitar las antenas con tijeras finas para evitar cualquier interferencia durante la grabación.
3. Preparar el soporte del palpo maxilar langosta
   1. Utilizar un portaobjeto (25 x 75 mm) como la base del soporte del palpo maxilar (MPH). Póngale un trozo de plástico (1 mm de altura, 10 mm de ancho, 35 mm de longitud) en una esquina de la diapositiva de cristal con cinta adhesiva de doble cara y finalmente fijar un cubierta de vidrio (18 mm x 18 mm) encima de la pieza de plástico con cinta adhesiva de doble cara. Coloque un pedazo pequeño de cinta de goma roja en la cubierta de vidrio como una capa de antideslizante. La pieza de plástico y el vidrio de la cubierta constituyen la plataforma para el palpo de langosta. La altura de la plataforma es de aproximadamente 1,5 mm.
   2. Instalar un alambre de tungsteno (diámetro de 0,125 mm, 36 mm de longitud) a una distancia de 1,5 mm paralelo al interior borde de la plataforma. Fijar los dos extremos del cable a la plataforma con cinta adhesiva de doble cara.

2. preparación de palpos maxilares de langosta

1. Cortar un tubo de centrífuga (1.5 ml) verticalmente por la mitad y cortar la parte inferior. Ponga la langosta en el tubo preparado. Salir de la región ventral y la cabeza de la langosta expuesta. Fijar el conjunto a la diapositiva de cristal con cinta adhesiva de doble cara (figura 2A).
2. Tire el palpo maxilar derecho en la plataforma.
3. Poner el alambre de tungsteno en el cuarto segmento de la palpo. Coloque masilla adhesiva a cada lado del alambre de tungsteno, unos 2 mm de la palpo maxilar (figura 2A y 2B).

3. solo Sensillum grabaciones

1. Colocar la preparación de langosta palpo maxilar bajo un microscopio a bajo aumento (100 X). Ajuste la posición de la preparación hasta que el palpo es perpendicular al electrodo de la grabación (Figura 3A).
2. Insertar el electrodo de referencia (electrodo de tungsteno) en el ojo de la langosta mediante un micromanipulador. Mover el electrodo de la grabación (electrodo de tungsteno) cerca el palpo maxilar con el instrumental quirúrgico (figura 3B y 3C).
3. Ajuste el dispositivo de entrega de olor a aproximadamente 1 cm desde el palpo maxilar (figura 3B).
4. Abra el software de grabación Auto punto 32. Configurar los parámetros de grabación como sigue: la escala de grabación 500 μV; el alta corte del filtro de 300 Hz, el límite baja a 200 Hz; y pretrigger en 10 s.
5. Conectar el electrodo de la grabación a un 10 x amplificador de AC/DC universal.
6. Interruptor del microscopio a un aumento alto de (500 X). Insertar el electrodo de registro en la base de un sensillum de basiconic en el palpo maxilar y delicadamente ajustar el electrodo de la grabación para obtener buena picos espontáneos (figura 3D).
7. Abra el controlador de estímulo para entregar una corriente de aire continua a 20 ml/s. establecer el tiempo de estimulación 1 señales de registro s. para 10 s, a partir de 10 s antes de la aparición del pulso del estímulo.
8. Utilice un amplificador de AC/DC universal de 10 x para amplificar las señales. Alimentan las señales de los 4 de IDAC. Analizar las señales con el software Auto punto 32. Señales de CA son band-pass filtrada entre 200 a 300 Hz. uso Auto punto 32 para distinguir las amplitudes pico a través de ruidos. Calcular las respuestas de las neuronas como los aumentos en la frecuencia del potencial de acción (espigas por segundo) sobre las frecuencias espontáneas. Realizar un análisis estadístico utilizando GraphPad Prisma 7.

Resultados

Se identifican dos subtipos sensilla (pb1 y pb2) en el palpo maxilar de langosta basado en dinámica de respuesta a olores químicos (10% 1-nonanol y 10% de ácido nonanoico). Las neuronas en pb1 producen significativamente más picos 1-nonanol de ácido nonanoico mientras las neuronas en pb2 son significativamente que menos activa 1-nonanol comparado con ácido nonanoico (figura 4). Hexanal y E-2-Hexenal pueden evocar un palpo langosta apertura respuesta (PO...

Discusión

Insectos dependen de palpos para detectar olores de alimentos y los palpos se creen que juegan un papel importante en la especiación^13,27. Los palpos son órganos olfativos simples y están recibiendo una atención creciente como un modelo atractivo para la exploración de la neuromolecular redes subyacentes chemosensation²⁸.

Insectos labellar y palpo SSRs se han realizado con éxito en Drosophila melanogas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten wire	ADVENT	W559504	Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2	Sigma-aldrich	563218-25G	Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply	Syntech	A2-70	Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope	Motic	SMZ-163	Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope	Olympus	W-51	Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller	Syntech	IDAC-4	Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller	Syntech	CS-55	Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator	C.M.D.T	CFT-8301D	Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator	Narishige	MN-151	Used for minor movement of the reference electrode
Speaker	EDIFIER	R101T06	Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base	PDOK	PD-101	Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table	TianHe	HAP-100-1208	Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide	CITOGLAS	ZBP-407	Used for making the base for the MPH
Blu-tack	Bostik	Blu-tack-45g	Fixing the tungsten wire
Pasteur tube	YARE	WITEG	Placing the filter paper containing stimuli solutions