Único Sensillum gravações para Locust palpo sensilas Basiconica

Resumo

Este artigo descreve um protocolo detalhado e altamente eficaz para gravações de único sensillum do basiconica de sensilas sobre os palpos de peças bucais de insetos.

Resumo

Os palpos das peças bucais locust são considerados órgãos gustativos convencionais que desempenham um papel importante na seleção de alimentos de um gafanhoto, especialmente para a detecção de não-volátil sugestões químicas através de sensilas chaetica (anteriormente denominado terminais sensilas ou crista sensilas). Há crescente evidência de que estes palpos também têm uma função olfativa. Um receptor de odorante (LmigOR2) e uma proteína ligadora de odorante (LmigOBP1) foram localizadas nos neurônios e células de acessório, respectivamente, na basiconica de sensilas dos palpos. Sensillum única gravação (SSR) é usado para gravar as respostas dos neurônios receptores de odorante, que é um método eficaz para ligantes ativos sobre os receptores específicos odorante de triagem. SSR é usado em estudos funcionais de receptores de odorante no sensilas palpo. A estrutura do basiconica de sensilas localizado na cúpula dos palpos difere um pouco da estrutura das pessoas sobre as antenas. Portanto, ao realizar um SSR eliciado odorantes, alguns conselhos específicos podem ser útil para a obtenção de melhores resultados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo detalhado e altamente eficaz para um SSR de inseto palpo sensilas basiconica.

Introdução

Animais têm evoluído de uma gama de órgãos chemosensory que detetam sugestões químicas exógenas. Em insetos, os mais importantes órgãos de chemosensory são as antenas e os palpos. Nestes órgãos, diversos tipos de cabelos chemosensory, chamados chemosensory sensilas, são inervados pelos neurônios chemosensory (CSNs) dentro os pelos. CSNs em chemosensory sensilas reconhecem sugestões químicas específicas através de transdução de sinal de estímulos químicos para potenciais eléctricos que posteriormente são transferidos até o sistema nervoso central^1,2,3 .

CSNs expressam vários receptores chemosensory [por exemplo, receptores de odorante (ORs)], geleificação receptores (IRs) e receptores gustativos (GRs) em suas membranas, que codificam exógenas sugestões químicas associadas com diferentes tipos de chemosensation ^4,5,6. A caracterização da CSNs é a chave para a elucidação dos mecanismos celulares e moleculares de inseto quimiorecepção. Agora gravação única sensillum (SSR) é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização de insecto CSNs nos sensilas antenais de muitos insetos, incluindo moscas⁷, traça⁸, besouros⁹, pulgões¹⁰, gafanhotos,¹¹, e formigas,¹². No entanto, poucos estudos têm aplicado um SSR a inseto palpos^{13,14,15,16,17}, porque as estruturas particulares da suas sensilas fazem um gravação eletrofisiológicas difícil¹⁸.

Enxames de gafanhotos (Orthoptera) muitas vezes causam danos à lavoura grave e perda econômica¹⁹. Os palpos são acreditados para jogar um papel importante na seleção alimentar de gafanhotos^{20,21,22,23,24}. Dois tipos de sensilas chemosensory são investigados por um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Geralmente, chaetica 350 sensilas e 7-8 sensilas basiconica são observados em cada cúpula dos locust palpos¹⁸. Chaetica de sensilas são sensilas gustativas que detetam sugestões químicas não-volátil, enquanto sensilas basiconica têm uma função olfativa, sensoriamento sugestões químicas voláteis.

Em palpos de locust, os diâmetros das tomadas de cabelo da basiconica de sensilas (ca. 12 µm), são muito maiores do que aqueles de sensilas chaetica (ca. 8 µm)^18,25. A parede cuticular do basiconica de sensilas sobre os palpos é muito mais espessa do que a de sensilas antenais¹⁸. Além disso, a cúpula do palpo tem conteúdo líquido dentro de uma cutícula altamente flexível. Estas características significam que uma penetração com um microeléctrodo e uma aquisição de sinais eletrofisiológicos boas é mais difícil do que para sensilas antenais. Neste trabalho, um protocolo SSR detalhado e altamente eficaz para locust palpo sensilas basiconica é apresentado com um vídeo.

Protocolo

1. preparação dos instrumentos e inseto

1. Preparando o tungstênio soluções eletrodos e estímulos
   1. Fixar um novo fio de tungstênio (diâmetro de 0,125 mm, comprimento de 75 mm) em um micromanipulador e apontá-lo em uma solução de nitrito (NaNO₂) de sódio 10% (p/v) em uma seringa de 10 V fornecida por uma fonte de alimentação por cerca de 1 min sob um estereomicroscópio (ampliação de 40 X).
   2. Mergulhe o fio de tungstênio afiada repetidamente em solução 10% NaNO₂ , cerca de 4 mm em 5 V em < 1 min (figura 1A).
   3. Examine o diâmetro da ponta afiada tungstênio frequentemente sob o microscópio estereoscópico até é fino o suficiente penetrar a cutícula de um sensillum de olfativo locust ao toque (figura 1B).
   4. Prepare as soluções de estímulo. Dilua cada um da substância química estímulo em óleo mineral. Dilua 1-nonanol e ácido nonanoico em diluições de 10%. Dilua E-2-hexenal e hexanal em 10^-2, 10^-3, 10^-4e 10^-5.
   5. Preparar Pasteur tubos carregando os estímulos: inserir as tiras de papel de filtro (de 2 cm de comprimento, largura de 0,5 cm) para os tubos de Pasteur, adicione as soluções diluídas de estímulo (cada 10 µ l) para as tiras de papel de filtro e em seguida, conecte os tubos de Pasteur com pontas de pipetas (1 ml).
2. Preparar o inseto
   1. Gafanhotos traseiros (Locusta migratoria) com mudas de trigo fresco sob condições de superlotação em um fotoperíodo de 18:6 h (luz: escuro), uma temperatura de 28-30 ° C e uma humidade relativa de 60%. Escolha 1 de 3-dias de idade 5^th ínstar ninfas de gafanhoto e remover as antenas com uma tesoura bem para evitar qualquer interferência durante a gravação.
3. Preparando o titular do palpo maxilar locust
   1. Use uma lâmina de vidro (25 x 75 mm) como a base do titular do palpo maxilar (MPH). Prenda um pedaço de plástico (1 mm de altura, 10 mm de largura, 35 mm de comprimento) para um canto do vidro slide com fita adesiva dupla-face e finalmente corrigir um tampa de vidro (18 x 18 mm) em cima do pedaço de plástico com fita adesiva dupla-face. Coloque um pequeno pedaço de fita vermelha de borracha sobre o vidro de cobertura como uma camada anti-derrapante. A peça de plástico e o vidro de cobertura constituem a plataforma para o palpo locust. A altura da plataforma é de aproximadamente 1,5 mm.
   2. Instalar um fio de tungstênio (diâmetro de 0,125 mm, comprimento de 36 mm) a uma distância de 1,5 mm paralelo ao interior borda da plataforma. Fixe as duas extremidades do fio até a plataforma com fita adesiva dupla-face.

2. preparação de Locust palpos maxilares

1. Corte um tubo de centrifugação (1,5 ml) verticalmente ao meio e corte o fundo. Coloque o gafanhoto dentro do tubo preparado. Deixe a região ventral e a cabeça dos locust exposto. Corrigi o assembly para a lâmina de vidro com fita adesiva de dupla face (Figura 2A).
2. Puxe o maxilar bem palpável para a plataforma.
3. Coloque o fio de tungstênio no segmento quarto do palpo. Coloque a massa adesiva em cada lado do fio de tungstênio, cerca de 2 mm do palpo maxilar (Figura 2A e 2B).

3. único Sensillum gravações

1. Coloque a preparação de palpo maxilar locust sob um microscópio em um pequeno aumento (100 X). Ajuste a posição da preparação até o palpo é perpendicular ao eléctrodo de gravação (Figura 3A).
2. Introduza o eléctrodo de referência (eletrodo de tungstênio) o olho de gafanhoto usando um micromanipulador. Mova o eletrodo de gravação (eletrodo de tungstênio) perto o palpo maxilar com o micromanipulador (Figura 3B e 3C).
3. Ajuste o dispositivo de entrega de odor para cerca de 1 cm do palpo maxilar (Figura 3B).
4. Abra o software de gravação automática Spike 32. Defina os parâmetros de gravação como segue: a escala de gravação em 500 mV; o alto corte do filtro em 300 Hz, o corte baixo em 200 Hz; e o pretrigger em 10 s.
5. Conecte o eletrodo gravação um 10 x universal AC/DC amplificador.
6. Alterne o microscópio para uma alta ampliação (500 X). Insira o eletrodo gravação na base de um sensillum de basiconic sobre o palpo maxilar e ajustar delicadamente o eléctrodo de gravação para obter boas picos espontâneos (Figura 3D).
7. Abra o controlador de estímulo para fornecer um fluxo contínuo de ar a 20 ml/s. o tempo de estimulação para 1 s. sinais de registro por 10 s, começando 10 s antes do início do pulso estímulo.
8. Use um amplificador de AC/DC 10 x universal para amplificar os sinais. Alimente os sinais em 4 o IDAC. Analise os sinais com o software Auto Spike 32. Sinais de AC são band-pass filtrado entre 200 a 300 Hz. uso Auto Spike 32 para distinguir amplitudes pico-de-cocho de ruídos. Calcule as respostas dos neurônios como os aumentos nas frequências do potencial de ação (picos por segundo) sobre as frequências espontâneas. Realizar uma análise estatística utilizando GraphPad Prism 7.

Resultados

Dois subtipos de sensilas (pb1 e pb2) sobre o palpo maxilar locust são identificados com base em dinâmica de resposta diferente de químicos odorantes (10% 1-nonanol e ácido nonanoico de 10%). Os neurônios no pb1 produzem significativamente mais picos de até 1-nonanol do ácido nonanoico enquanto os neurônios em pb2 são significativamente que menos ativado por 1-nonanol comparado com ácido nonanoico (Figura 4). Hexanal e E-2-Hexenal podem evocar um pa...

Discussão

Insetos dependem de palpos para detectar odores de comida, e seus palpos são acreditados para jogar um papel importante na especiação^13,27. Os palpos são simples órgãos olfativos e estão recebendo crescente atenção como um atraente modelo de exploração da neuromolecular redes subjacente chemosensation²⁸.

Inseto labellar e palpo SSRs foram realizados com sucesso em Drosophila melanogaster,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten wire	ADVENT	W559504	Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2	Sigma-aldrich	563218-25G	Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply	Syntech	A2-70	Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope	Motic	SMZ-163	Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope	Olympus	W-51	Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller	Syntech	IDAC-4	Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller	Syntech	CS-55	Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator	C.M.D.T	CFT-8301D	Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator	Narishige	MN-151	Used for minor movement of the reference electrode
Speaker	EDIFIER	R101T06	Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base	PDOK	PD-101	Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table	TianHe	HAP-100-1208	Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide	CITOGLAS	ZBP-407	Used for making the base for the MPH
Blu-tack	Bostik	Blu-tack-45g	Fixing the tungsten wire
Pasteur tube	YARE	WITEG	Placing the filter paper containing stimuli solutions