Modelo de pulmón acelular y celular para el estudio de metástasis de Tumor

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para un ex vivo lung cáncer modelo que imita los pasos de progresión del tumor y ayuda a aislar un tumor primario, circulación de las células tumorales y las lesiones metastáticas.

Resumen

Es difícil aislar las células tumorales en diferentes puntos de progresión del tumor. Hemos creado un modelo ex vivo lung que puede mostrar la interacción de las células tumorales con la matriz natural y flujo continuo de nutrientes, así como un modelo que muestra la interacción de las células del tumor con componentes celulares normales y una matriz natural. El modelo de pulmón acelular ex vivo es creado por un bloque de corazón y pulmón de la rata de aislar y eliminar todas las células mediante el proceso de descelularización. El bronquio principal derecho se ligan y se colocan las células del tumor en la tráquea por una jeringa. Las células de moverán y llenar el pulmón izquierdo. El pulmón se coloca en un biorreactor donde la arteria pulmonar recibe un flujo continuo de medios de comunicación en circuito cerrado. El tumor en el pulmón izquierdo es el tumor primario. Las células del tumor que se aíslan en los medios de circulación circulan las células tumorales y las células del tumor en el pulmón derecho son lesiones metastásicas. El modelo de pulmón celular ex vivo es creado por saltarse el proceso de descelularización. Cada modelo puede utilizarse para responder a preguntas de investigación.

Introducción

Metástasis del cáncer es el culpable detrás de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer y representa el mayor desafío en los esfuerzos para combatir el cáncer. El objetivo general de este método es diseñar un protocolo para una cultura de cuatro dimensiones (4D) celular que tiene una dimensión de flujo, además del crecimiento de la célula (3D) tridimensional. Representa las tres fases distintas del proceso de metástasis [es decir, el tumor primario, circulación de las células tumorales (CTC) y lesiones metastásicas].

En las últimas tres décadas, los científicos alrededor del mundo rindieron una riqueza sin precedentes de información para entender los mecanismos subyacentes a la progresión metastásica en diferentes tipos de cáncer que mejoró la perspectiva de un cura o una supervivencia libre de progresión. El manejo clínico de algunos tipos de cáncer, como cáncer de mama, mejorado significativamente¹; sin embargo, algunos cánceres, como cáncer de pulmón, aún tienen una supervivencia pobre². Modelos animales in vitro e in vivo han sido fundamentales en la generación de nuevos conocimientos sobre los mecanismos que sustentan el desarrollo de la enfermedad. En los últimos años, derivado de línea xenoinjertos (CDX) de la célula y xenoinjertos derivados del paciente (PDX) han sido de mayor interés como conservan muchas características relevantes del tumor humano primario³, como la cinética de crecimiento, características histológicas, comportamiento características y la respuesta al tratamiento. Sin embargo, cada modelo tiene sus limitaciones para entender el mecanismo de formación de CTC y metástasis en un órgano distante^4,5,6.

Recientemente, hemos desarrollado un modelo 4-D ex vivo lung Cáncer utilizando el concepto de reingeniería de órgano y de cultivo celular basada en perfusión. Imita el crecimiento de cáncer de pulmón humano mediante la formación de nódulos de tumor perfusable que crecen en el tiempo con un parecido humano secretada cáncer proteína producción⁷. Representa la firma de expresión de gen que predice supervivencia pobre en pacientes con cáncer y también muestra una respuesta terapéutica por regresión del tumor al cisplatino tratamiento^8,9. El modelo de pulmón más fue modificado para que pueda formar las lesiones metastáticas. El CTC se convierten de un tumor primario y intravasate en la vasculatura y extravasate en el pulmón contralateral para formar lesiones metastáticas¹⁰. Estudios de expresión génica sugieren un perfil de expresión distinta del tumor primario, la CTC y las lesiones metastáticas y la regulación al alza del subconjunto de genes para el fenotipo¹⁰. Este proceso metastásico se produce debido a la presencia de condiciones biológicas en pacientes con cáncer. La ventaja de este modelo es la presencia de una matriz natural y arquitectura y una perfusión de nutrientes que conduce a la formación de nódulos del tumor. Además, también proporciona una oportunidad para estudiar los efectos de diversos componentes del microambiente tumoral o medicamentos en la progresión del tumor con el tiempo. Este modelo puede utilizarse para cultivar una variedad de células de cáncer (cáncer de pulmón, cáncer de mama, sarcoma, etc.) en un montaje de laboratorio.

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Protocolo

Los protocolos para los experimentos en animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en el Instituto Metodista de Houston y llevado a cabo con arreglo a las normas, leyes, directrices y políticas.

1. rata pulmón cosecha

1. Anestesiar una rata Sprague-Dawley macho de 4 a 6 semanas de edad por una inyección intraperitoneal (IP) de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en su flanco. Asegúrese de que la anestesia comprobando la ausencia de movimiento cuando el dedo de extremidades que se pellizque con el fórceps.
2. Después de 10 min, afeitarse el pecho y el abdomen y limpie la piel con una esponja de clorhexidina.
3. Retirar la piel por cogerlo con pinzas y por incisión con un bisturí desechable. Después de abrir la cavidad torácica mediante la incisión con bisturí, realizar una toracotomía bilateral mediante la reducción de la parte anterior de las costillas de la izquierda y la derecha de la membrana con tijeras.
   Nota: Esta es una cirugía no supervivencia.
4. Sostener la caja torácica e inyecte 2 mL de heparina (1000 unidades/mL) en el ventrículo derecho del corazón mediante una aguja de 27 G.
   Nota: Esto evitará que cualquier formación de coágulos de sangre en el pulmón.
5. Completamente quitar la caja torácica con las tijeras y colocar una aguja de 18 G en el ventrículo izquierdo como una abertura, hasta que salga la sangre. Luego, inyecta 15 mL de solución de tampón fosfato salino heparinizado (12,5 unidades/mL; PBS heparinizada) en el ventrículo derecho con una aguja de 25 G.
6. Cortar el inferior y superior de la vena cava, dos venas grandes en el lado derecho del corazón y vacíe los pulmones con un adicional 10 mL de PBS heparinizada en el ventrículo derecho con una aguja de 27 G.
   Nota: La vena cava inferior se visualiza bajo el fondo del corazón como un gran recipiente lleno de rojos de la sangre. Del mismo modo, la vena cava superior se visualiza en la parte superior del corazón como un vaso grande.
7. Cortar la tráquea en la base de la tiroides. Retire con cuidado la aorta descendente a nivel de la vena de los hemiazygos y ramas de la aorta en el arco.
8. Sacar el bloque de corazón y pulmón de la cavidad torácica y el resto del cuerpo de la rata.
9. Realizar ventriculotomy cortando la mitad de los ventrículos derecho e izquierdos y coloque una cánula de acero inoxidable aguja 18 G precargada por encargo a través del ventrículo derecho la arteria pulmonar principal (PA).
10. Fijar la cánula con una corbata de seda de 2-0 y exponer cuidadosamente el ventrículo derecho y aurícula.
11. Coloque un cierre Luer hembra en el ventrículo izquierdo y fijarlo con una corbata de seda de 2-0.
12. Limpie el bloque de corazón y pulmón con 20 mL de PBS heparinizada a través de la cánula de PA y colocar en un tubo de 50 mL que contienen medios de cultivo o PBS heparinizada.
    Nota: Para un modelo de celular, vaya al paso 3.1 configurar el biorreactor. Modelo acelular, proceda al paso 2.1 para la descelularización.

2. pulmón descelularización

1. Preparación de la unidad de descelularización
   1. Preparar cada cámara/botella de descelularización perforar dos agujeros en la tapa de la botella y ajustar un Luer hembra en los orificios (figura 1A y 1B). Asegúrelo con un anillo de nylon negro en el otro lado. Del mismo modo, perfore un orificio único en otra tapa de la botella para el accesorio set intravenoso (figura 1).
      Nota: Figura 1A y 1B son de los mismo tapones de botellas de dos lados diferentes. Figura 1 es de un diverso casquillo con un agujero como se indicó anteriormente en el paso 2.1.1.
   2. Fije tubos de 6 pulgadas (Figura 1J) y un tubo de 0,5 pulgadas (en la arteria pulmonar o al final de PA) a un Luer hembra del interior de los tapones de botellas (figura 1A y 1B) y un conector Luer lock macho en los extremos. Ajuste el cerrojo con una botella de 500 mL la descelularización cámara/botella.
   3. Conecte un extremo de dos tubos de 2 pies (que están conectados con un conector Luer lock macho) en ambos extremos del tubo de la bomba (figura 1 H), que se une a la cabeza de la bomba (Figura 1E y 1F) por un cartucho (figura 1) con un Luer hembra cerradura (figura 1I).
   4. Conecte los otros extremos de los 2 pies tubos (en el paso 2.1.3) cada uno hacia una hembra Luer lock en la descelularización cámara/cápsula (figura 1 L).
   5. Configurar un 250 mL heparinizada botella de PBS (con 200 mL de PBS) colgando de una botella invertida sobre un soporte con el extremo proximal de un sistema intravenoso (figura 1) insertado en la tapa y el extremo distal reemplazando los 2 pies de tubo conectado a la descelularización c cámara/de la botella en el extremo de la PA (figura 1B). Conecte este 2 pies de tubo a la botella de descarte.
      Nota: Las botellas se establecen en la cartulina, como se muestra en la figura 1 K. Los tubos intravenosos salen las botellas colgantes para dispensar los reactivos en el andamio de pulmón.
2. Proceso de la descelularización de pulmón
   1. Ejecutar el PBS heparinizado a una presión de perfusión fisiológica de 30 mm Hg (figura 1 K) hasta que fluye libremente en la cámara/botella de descelularización y, a continuación, conecte el bloque de corazón y pulmón al PA a través de la cánula de PA.
   2. Mantener funcionando la bomba continuamente, para que cualquier exceso tampón dentro de la cámara/botella de descelularización obtiene descarta.
   3. Ejecute el PBS heparinizado a través del PA durante 15 min a una presión de perfusión de 30 mm Hg para el lavado inicial (figura 1 K).
   4. Sustituir la botella de PBS heparinizada con 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS) en agua desionizada y perfusión del pulmón por 2 h para la descelularización.
   5. Después de la descelularización, perfusión agua desionizada esterilizado por el andamio del pulmón durante 15 minutos.
   6. A continuación, perfusión 1% detergente no-iónico en agua desionizada durante 10 minutos.
   7. Reemplace la descelularización cámara/botella con 500 mL de autoclave PBS suplementado con antibióticos x 1 (penicilina-estreptomicina anfotericina), manteniendo el pulmón colgante intacto con la tapa dentro de la botella.
   8. Deseche la intravenosa establece, poner los 2 pies de tubo adjunto al recipiente hacia el final de la arteria pulmonar de la cámara de descelularización y haga funcionar la bomba a 6 mL/min (figura 1 L).
   9. Perfusión de los pulmones durante 72 h y seguir cambiando el PBS con antibióticos cada 12 h.
      Nota: El pulmón acelular está listo para su uso inmediato. Pueden ser almacenado a-80 ° c hasta que se necesite. Si manchas rosas o coágulos de sangre pueden visualizarse claramente en los lóbulos del pulmón, deseche el pulmón. Es posible probar al azar de ADN o histopatología. Un pulmón completo acelular no mostrará células y 99.9% del ADN serán lavado.
      Nota: Cuando se trabaja con un modelo de pulmón celular, omitir la descelularización. El pulmón cosechado (paso 1) puede ajustarse directamente en el biorreactor.

3. biorreactor configuración

1. Preparar la botella de biorreactor y los elementos necesarios para la puesta a punto.
   1. Perfore tres agujeros en una tapa de botella de 500 mL a la misma distancia y fijar un Luer hembra en los tres orificios, con anillos de nylon negro (figura 2A y 2B).
      Nota: En dos orificios, el luer-lock termina cara al exterior, mientras que el interior de la botella se enfrenta a uno de los extremos.
   2. Corte 6 en tubo de la bomba, un 2 en el tubo, un 6 en tubo, un tubo de 1,5 pies, un tubo de 2 pies y un tubo oxigenador de 10 pies por biorreactor.
   3. Corte una aguja de acero inoxidable de 18 G y, otra vez, conectar los extremos con tubería biocompatible para una cánula traqueal.
   4. Envuelva el tubo del oxigenador, con conectores de tipo Luer lock en los extremos, en una malla de alambre del solenoide con cintas de autoclave (figura 2).
   5. Autoclave de los mencionados artículos y mantener en UV luz durante 10 minutos.
2. Configurar la bomba dentro de la incubadora de la cultura de la célula normal (37 ° C, 5% CO₂) con espacio adecuado entre las bandejas para adaptarse fácilmente a una botella de 500 mL.
3. Rociar etanol al 70% en el cartucho de la bomba y conectar el tubo de bomba con conectores de bloqueo Luer hembra en ambos extremos a la bomba.
4. Configurar el oxigenador envuelto alrededor de la malla de alambre del solenoide dentro de la incubadora de cultivo celular conectando un extremo (la salida) del oxigenador para el tubo de la bomba y el otro extremo con el 1,5 pies de tubo en el biorreactor.
5. Configurar la botella de biorreactor en una bioseguridad con condiciones asépticas.
   1. Coloque una llave de 3 vías (amarillo) a la cabeza de uno de la luer hembra para controlar el flujo a través de el PA
   2. Conecte una llave de paso unidireccional (azul) a otra hembra Luer lock tabique hermético para siembra a través de la tráquea (figura 2F) de la célula.
   3. Conectar 2 tubos en el exterior (blanco) y 6 en tubo en el interior de la botella para hacer circular los medios de comunicación hacia fuera. Coloque un conector Luer lock macho a un tubo de 2 pies y fije un estilo de terminal Luer hembra Tee para proporcionar accesibilidad para añadir o quitar nada.
   4. Coloque una llave de paso unidireccional a uno de los orificios del conector de tres vías (hembra Luer estirón estilo Tee).
   5. Conecte un conector Luer lock macho y un conector Luer lock hembra para tubos de 2 pies.
   6. Añadir 200 mL de RPMI1640 con 10% FBS y 1% antibióticos medio de cultivo celular (varía según el requisito de la célula) y transferir el biorreactor a la incubadora. Conecte el tubo del oxigenador a los dos extremos abiertos (llave de paso unidireccional y Tee conector) para convertirlo en un biorreactor de bucle cerrado.
6. Funcionamiento previo la bomba en 6 mL/min dentro de la incubadora de cultivo celular con medios de cultivo celular para llenar el oxigenador y tubos, para que no existan burbujas de aire en la tubería.
7. Una vez que los tubos se llenan con los medios de comunicación, cerrar la llave de paso y sacar la botella del biorreactor de la incubadora desconectando los oxigenadores de ambos extremos de la botella del biorreactor.
8. Poner la botella de biorreactor en la bioseguridad gabinete pasar medios de cultivo a través de la llave de paso y sujetar la cánula del PA del andamio del pulmón (acelular o celular) a la llave de paso a través del conector Luer macho.
   Nota: Aquí es posible utilizar el modelo acelular (siguiendo el proceso de descelularización) o un bloque de corazón y pulmón recién cosechados (es decir, el modelo de celular, ya que retiene las células de rata nativa).
9. Pasar los medios de cultivo a través de una llave de paso unidireccional para quitar cualquier aire y atar la cánula traqueal por un hilo de seda a la tráquea.
10. Asegúrese de evitar cualquier torsión de la PA y la tráquea. Cerca la tapa del biorreactor con el pulmón del andamio dentro de y, otra vez, asépticamente transferir el biorreactor a la incubadora y poner en marcha la bomba a una velocidad de 6 mL/min.
11. Funcionamiento de medios de cultivo para 10-15 minutos para asegurarse de que conseguirá inflados todos los lóbulos y el pulmón se ve en buena forma (figura 2).

4. metástasis modelo y siembra de células

Nota: Proceder a la siembra con el anterior modelo de pulmón para un estudio de crecimiento del tumor primario de la célula. Modificar el andamio del pulmón (acelular o celular) como sigue para el modelo metastásico.

1. Saque el biorreactor con el andamio de pulmón de la incubadora y ponerlo en la seguridad de la biotecnología gabinete.
2. Utilizar una jeringa con cierre Luer para pasar 5 mL de medio de cultivo a través de la tráquea y abrir la tapa del biorreactor con el colgante andamio de pulmón (figura 2F).
3. En este paso, una persona más es necesaria para ayudar en la modificación del pulmón a un modelo de metástasis.
4. Obtener seda 2-0 punto y utilizar pinzas angulares para hacer un paso a través de la tráquea en el punto de bifurcación.
5. Atar la tráquea va al pulmón derecho en el punto de bifurcación y controlar la libre circulación de los medios de comunicación a través de la tráquea al pulmón izquierdo pasando los medios de cultivo.
   Nota: Una vez que la tráquea se ata en el punto de bifurcación, las células sembradas a través de la tráquea serán automáticamente dirigidas a las semillas a los lóbulos izquierdos. Puede probarse antes de sembrar las células por el empuje de los medios de cultivo a través de la tráquea. En el modelo metastásico, los medios de comunicación se mueven a los lóbulos izquierdos solamente, que se inflan, y no a los lóbulos derecho¹⁰.
6. Establecer una jeringa de 20 mL Luer lock encima de la cánula traqueal y células de cáncer de pulmón ATCC (A549, H1299) en 50 mL RPMI1640 completado de medios de cultivo (figura 2F).
7. Llevar a cabo la célula siembra en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Añadir 15 mL de células en la jeringa y deje pasar a través de los lóbulos del pulmón por gravedad. Agregar el resto de las células antes de pasan burbujas de aire.
8. En el sembrador de pulmón acelular, recoger los medios perfundidos goteo hacia abajo en la botella del biorreactor y dejarlo pasar a través de la tráquea otra vez 3 x.
   Nota: Los medios de comunicación inundado a veces tienen las células de cáncer sembradas. Por lo tanto, para la siembra eficiente, devolver los medios de comunicación otra vez en la tráquea a través de la jeringa.
9. Una vez sembradas, retire la jeringa, espere 15 min, añadir medio fresco y regresar el biorreactor a una incubadora. Eliminar las posibles burbujas de aire en la tubería.
10. Arrancar la bomba para inundar los medios de comunicación en 6 mL/min.

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Resultados

El pulmón de rata mantiene el intacto vasculatura y alvéolos¹¹ (Figura 3A y 3B). A descelularización, los componentes de la matriz extracelular de un pulmón acelular, como colágeno, fibronectina y elastina, se conservan¹¹ (figura 3, 3D, 3Ey 3F). La descelularización conduce a un retiro completo de las células...

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Discusión

El pulmón ex vivo 4-D proporciona una oportunidad para estudiar el crecimiento del tumor y la metástasis en un montaje de laboratorio. Una matriz de pulmón nativo es un sistema complejo que provee soporte al tejido normal y mantiene interacciones célula-célula, las interacciones célula-matriz, diferenciación celular y la organización de tejido. Proporciona una oportunidad para añadir cualquier componentes del microambiente del tumor para estudiar sus efectos sobre el crecimiento tumoral y la interacció...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula