Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per un ex vivo del polmone cancro modello che imita le fasi della progressione del tumore e aiuta a isolare un tumore primario, fare circolare le cellule del tumore e le lesioni metastatiche.

Abstract

È difficile isolare le cellule del tumore in diversi punti della progressione del tumore. Abbiamo creato un ex vivo modello del polmone che può mostrare l'interazione delle cellule del tumore con una matrice naturale e continuo flusso di sostanze nutritive, così come un modello che mostra l'interazione delle cellule del tumore con componenti cellulari normali e una matrice naturale. Isolando un blocco cuore-polmoni del ratto e rimuovendo tutte le celle utilizzando il processo di decellularizzazione viene creato il modello di polmone acellulare ex vivo . Il bronco principale destro è legato al largo e le cellule del tumore sono collocate nella trachea di una siringa. Le cellule muovono e popolano il polmone di sinistra. Il polmone viene poi collocato in un bioreattore dove l'arteria polmonare riceve un flusso continuo di media in un circuito chiuso. Il tumore cresciuto il polmone di sinistra è il tumore primario. Le cellule del tumore che sono isolate nei mezzi circolanti sono in circolazione le cellule del tumore e le cellule del tumore nel polmone di destra sono lesioni metastatiche. Saltando il processo di decellularizzazione viene creato il modello di polmone cellulare ex vivo . Ogni modello consente di rispondere alle domande di ricerca differenti.

Introduzione

Metastasi del cancro è il colpevole dietro la maggior parte delle morti legate al cancro e la sfida finale nel tentativo di combattere il cancro. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare un protocollo per una coltura quadridimensionale (4D) cellulare che ha una dimensione di flusso, oltre alla crescita di cellula tridimensionale (3D). Rappresenta le tre fasi del processo di metastasi [cioè, il tumore primario, fare circolare le cellule del tumore (CTCs) e le lesioni metastatiche].

Negli ultimi tre decenni, gli scienziati di tutto il mondo hanno reso un'ineguagliabile ricchezza di informazioni per comprendere i meccanismi alla base della progressione metastatica in diversi tipi di cancro che ha migliorato la prospettiva di una cura o la sopravvivenza libera da progressione. La gestione clinica di alcuni tumori, come il cancro al seno, è migliorato significativamente¹; Tuttavia, alcuni tipi di cancro, come il cancro del polmone, hanno ancora una scarsa sopravvivenza². Modelli animali in vitro e in vivo sono stati strumentali nel generare nuove visioni dei meccanismi che sottendono lo sviluppo della malattia. Negli ultimi anni, cella linea-derivato xenotrapianti (CDX) e paziente-derivato xenotrapianti (PDX) sono stati di maggiore interesse come conservano molte caratteristiche rilevanti del tumore umano primario³, come la cinetica di crescita, le caratteristiche istologiche, comportamentale caratteristiche e la risposta alla terapia. Tuttavia, ogni modello ha i suoi limiti per comprendere il meccanismo di formazione di CTC e la metastasi ad un organo distante^4,5,6.

Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di cancro del polmone 4D ex vivo utilizzando il concetto di organo reengineering e coltura cellulare basato su aspersione. Imita la crescita del cancro del polmone umano formando noduli del tumore perfusable che crescono nel tempo con un essere umano simile cancro-secernuto proteina produzione⁷. Rappresenta la firma di espressione genica che predice la sopravvivenza difficile in pazienti con cancro e Mostra una risposta terapeutica di regressione del tumore su cisplatino trattamento^8,9. Il modello del polmone è stato ulteriormente modificato in modo che può formare le lesioni metastatiche. Il CTCs sviluppare da un tumore primario e intravasate nel sistema vascolare e importante nel polmone controlaterale per formare le lesioni metastatiche¹⁰. Studi di espressione genica suggeriscono un profilo di espressione distinta del tumore primario, il CTCs e le lesioni metastatiche e il upregulation del sottoinsieme dei geni richiesti per il fenotipo¹⁰. Questo processo metastatico si verifica a causa della presenza di condizioni biologiche visto in pazienti con cancro. Il vantaggio di questo modello è la presenza di una matrice naturale e architettura e una perfusione di nutrienti che porta alla formazione di noduli del tumore. Inoltre, fornisce anche l'opportunità di studiare gli effetti delle diverse componenti del microambiente tumorale o farmaci sulla progressione del tumore nel tempo. Questo modello può essere utilizzato per crescere una gamma di cellule tumorali (cancro al polmone, cancro al seno, sarcoma ecc.) in un set-up di laboratorio.

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Protocollo

I protocolli per gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso il Methodist Research Institute di Houston e istituzionali Animal Care ed effettuati secondo tutte le norme, leggi, linee guida e politiche.

1. ratto polmone Harvest

1. Anestetizzare un ratto Sprague-Dawley maschio a 6-week-old 4 tramite un'iniezione intraperitoneale (IP) di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) nel suo fianco. Garantire l'anestesia controllando per un'assenza di movimento quando la punta dell'arto viene pizzicata con il forcipe.
2. Dopo 10 min, radere il torace e l'addome e pulire la pelle con un batuffolo di clorexidina.
3. Togliere la pelle raccoglierlo con il forcipe e incidendo esso con un bisturi monouso. Dopo l'apertura della cavità toracica di incisione con bisturi, eseguire una toracotomia bilaterale tagliando il lato anteriore della gabbia toracica a sinistra e destra del diaframma con le forbici.
   Nota: Questo è un intervento chirurgico non-sopravvivenza.
4. Tenere la gabbia toracica e iniettare 2 mL di eparina (1.000 unità/mL) nel ventricolo destro del cuore usando un ago da 27 G.
   Nota: Questo impedirà qualsiasi formazione di coaguli di sangue nel polmone.
5. Completamente rimuovere la gabbia toracica con le forbici e inserire un ago da 18 G nel ventricolo sinistro come uno sfogo, fino a quando esce il sangue. Quindi, iniettare 15 mL di tampone fosfato soluzione fisiologica eparinizzata (12,5 unità/mL; eparinizzata PBS) nel ventricolo di destra usando un ago 25 G.
6. Taglio inferiore e superiore della vena cava, due grandi vene sul lato destro del cuore e svuotare i polmoni con un ulteriore 10 mL di PBS eparinizzata nel ventricolo di destra utilizzando un ago da 27 G.
   Nota: La vena cava inferiore è visualizzata sotto il fondo del cuore come un grande vaso pieno di sangue rosso. Allo stesso modo, la vena cava superiore è visualizzata nella parte superiore del cuore come una grande nave.
7. Tagliare la trachea alla base della tiroide. Rimuovere con cautela l'aorta discendente a livello della vena emiazygos e rami dell'aorta all'arco.
8. Estrarre il blocco cuore-polmoni dalla cavità toracica e il resto del corpo del ratto.
9. Eseguire ventriculotomy tagliando la metà dei ventricoli destro e sinistro e inserire una cannula di ago in acciaio inox su misura preriempita di 18 G attraverso il ventricolo destro nell'arteria polmonare principale (PA).
10. Fissare la cannula con una cravatta di seta 2-0 e attentamente esporre il ventricolo destro e l'atrio.
11. Posizionare una paratia Luer femmina nel ventricolo sinistro e fissarlo con una cravatta di seta 2-0.
12. Svuotare il blocco cuore-polmoni con 20 mL di PBS eparinizzata attraverso la cannula di PA e metterlo in una provetta da 50 mL contenenti terreni di coltura o PBS eparinizzata.
    Nota: Per un modello di cellulare, andare al punto 3.1 per impostare il bioreattore. Per un modello acellulare, procedere al punto 2.1 per il decellularizzati.

2. polmone decellularizzazione

1. Preparazione dell'unità decellularizzazione
   1. Preparare ogni camera/bottiglia di decellularizzazione piercing due fori nel tappo della bottiglia e facendo scattare un Luer femmina nei fori (Figura 1A e 1B). Fissarlo con un anello di nylon nero sul lato opposto. Allo stesso modo, un foro singolo in un altro tappo di bottiglia per il fissaggio set endovenoso (Figura 1).
      Nota: Figura 1A e 1B sono lo stessa di tappi di bottiglia da due lati diversi. Figura 1 è di un tappo diversi con un unico foro come indicato sopra al punto 2.1.1.
   2. Fissare un tubo di 0,5 pollici (all'arteria polmonare o alla fine di PA) e tubi di 6 pollici (Figura 1J) un raccordo luer femmina da dentro i tappi di bottiglia (Figura 1A e 1B) e un maschio Luer lock alle estremità. Impostare il blocco con una bottiglia di 500 mL come la camera di decellularizzazione/bottiglia.
   3. Collegare un'estremità dei due tubi 2 ft (che sono collegati con un maschio Luer lock) a entrambe le estremità del tubo pompa (Figura 1 H), che è attaccato alla testa della pompa (Figura 1E e 1F) da una cartuccia (Figura 1) con un raccordo Luer blocco (Figura 1I).
   4. Collegare le altre estremità dei 2 ft tubi (dal punto 2.1.3) ciascuna per una testa femminile di Luer lock sul cappuccio decellularizzazione camera/bottiglia (Figura 1 L).
   5. Impostare un 250ml eparinizzato bottiglia di PBS (con 200 mL di PBS) appendendo una bottiglia rovesciata su un supporto con l'estremità prossimale di un set per via endovenosa (Figura 1) inserito nel tappo della bottiglia e l'estremità distale, sostituire il tubo di 2 ft collegato alla c di decellularizzazione hamber/bottiglia alla fine PA (Figura 1B). Collegare questo tubo di 2 ft alla bottiglia di scartare.
      Nota: Le bottiglie sono impostate in cartone, come mostrato in Figura 1 K. I tubi endovenosa vengono fuori le bottiglie di impiccagione di dispensare i reagenti nell'impalcatura del polmone.
2. Processo di decellularizzazione di polmone
   1. Eseguire il PBS eparinizzato ad una pressione di aspersione fisiologica di 30 mm Hg (Figura 1 K) fino a quando non scorre liberamente in decellularizzazione camera/bottiglia e, quindi, collegare il blocco cuore-polmoni fino alla fine di PA attraverso la cannula di PA.
   2. Mantenere continuamente, in funzione la pompa in modo che qualsiasi soluzione/tampone in eccesso all'interno della camera/bottiglia di decellularizzazione ottiene scartato.
   3. Eseguire il PBS eparinizzato attraverso il PA per 15 min a una pressione di aspersione di 30 mm Hg per il lavaggio iniziale (Figura 1 K).
   4. Sostituire la bottiglia eparinizzata PBS con 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) in acqua deionizzata e irrorare il polmone per 2 h per il decellularizzati.
   5. Dopo il decellularizzazione, irrorare acqua deionizzata in autoclave attraverso l'impalcatura del polmone per 15 min.
   6. Quindi, irrorare il detergente non ionico 1% in acqua deionizzata per 10 min.
   7. Sostituire la camera/bottiglia di decellularizzazione con 500 mL di PBS in autoclave completati con antibiotici di x 1 (penicillina-streptomicina amfotericina), mantenendo intatto con il tappo del polmone appeso all'interno della bottiglia.
   8. Gettare il dispositivo di venipunzione insieme, messo il tubo 2 ft attaccato al contenitore scartando alla fine della sezione decellularizzazione, arteria polmonare e far funzionare la pompa a 6 mL/min (Figura 1 L).
   9. Irrorare i polmoni per 72 h e mantenere cambiando il PBS con antibiotici ogni 12 h.
      Nota: Il polmone acellulare è pronto per l'uso immediato. Esso può essere conservato a-80 ˚ fino a quando necessario. Se macchie rosa o coaguli di sangue può essere visualizzati chiaramente nei lobi del polmone, scartare il polmone. È possibile testare in modo casuale per DNA o l'istopatologia. Un polmone completo acellulare non mostrerà le cellule e il 99,9% del DNA saranno lavati.
      Nota: Quando si lavora con un modello cellulare del polmone, saltare il decellularizzati. Il polmone raccolto (passaggio 1) impostabile direttamente nel bioreattore.

3. bioreattore set-up

1. Preparare la bottiglia di bioreattore e gli elementi necessari per il set-up.
   1. Praticare tre fori in un tappo di bottiglia 500 mL a uguale distanza e difficoltà un Luer femmina in tutti e tre i fori, utilizzando anelli di nylon nero (Figura 2A e 2B).
      Nota: Nei due fori, Luer lock finisce volto all'esterno, mentre un'estremità sia rivolto verso l'interno della bottiglia.
   2. Tagliare un 6 nel tubo della pompa, un 2 in tubo, un 6 in tubo, un tubo di 1,5 ft, un tubo di 2 ft e un tubo di 10 ft ossigenatore a bioreattore.
   3. Tagliare un ago da 18 G in acciaio inox e, ancora una volta, collegare le estremità con tubo biocompatibile per una cannula trachea.
   4. Avvolgere il tubo di ossigenatore, con connettori Luer lock alle estremità, su una rete metallica solenoide utilizzando nastri autoclave (Figura 2).
   5. Autoclave le suddette voci e tenerli in UV luce per 10 min.
2. Impostare la pompa all'interno dell'incubatrice di cultura delle cellule regolari (37 ° C, 5% CO₂) con la corretta spaziatura tra i vassoi per adattarsi facilmente una bottiglia da 500 mL.
3. Spruzzare etanolo al 70% della cartuccia della pompa e collegare il tubo della pompa con connettori di tipo Luer femminile su entrambe le estremità della pompa.
4. Impostare l'ossigenatore avvolto intorno il solenoide metallica all'interno dell'incubatrice di cultura cellulare collegando un'estremità (il deflusso) dell'ossigenatore per il tubo della pompa e l'altra estremità con il tubo di 1,5 ft nel bioreattore.
5. Impostare la bottiglia di bioreattore in una biosicurezza armadietto con condizioni asettiche.
   1. Collegare un rubinetto a 3 vie (giallo) alla testa di uno del luer femmina per controllare il flusso attraverso il PA.
   2. Collegare un rubinetto d'arresto unidirezionale (blu) a un'altra paratia di blocco Luer femmina per semina attraverso la trachea (Figura 2F) cellulare.
   3. Collegare 2 in tubazione all'esterno (bianco) e 6 in tubi all'interno della bottiglia per far circolare i mezzi fuori. Montare un maschio Luer lock per un tubo di 2 ft e associare uno stile di aletta Luer femmina Tee per fornire accessibilità per aggiungere o rimuovere nulla.
   4. Collegare un rubinetto unidirezionale a una delle aperture del tre vie connettore (Luer aletta stile femminile Tee).
   5. Allegare un Luer lock maschio e una femmina Luer lock per tubi 2 ft.
   6. Aggiungere 200 mL di RPMI1640 con 10% FBS e 1% antibiotici mezzo di coltura cellulare (varia secondo il requisito di cella) e trasferire il bioreattore per l'incubatrice. Collegare il tubo di ossigenatore a due estremità aperte (rubinetto unidirezionale e raccordo a t) per renderlo un bioreattore a circuito chiuso.
6. Pre-eseguire la pompa a 6 mL/min all'interno dell'incubatrice di cultura cellulare con terreni di coltura cellulare per riempire l'ossigenatore e tubi, in modo che bolle d'aria non presenti nella tubazione.
7. Una volta che i tubi sono riempiti di media, chiudere il rubinetto e rimuovere la bottiglia di bioreattore dall'incubatrice scollegando gli ossigenatori da entrambe le estremità della bottiglia bioreattore.
8. Mettere la bottiglia di bioreattore nella biosicurezza mobile, passare i contenuti multimediali di cultura attraverso il rubinetto di arresto e collegare la cannula di PA dell'impalcatura del polmone (acellulare o cellulare) al rubinetto attraverso il connettore Luer maschio.
   Nota: Qui è possibile utilizzare il modello acellulare (seguendo il processo di decellularizzazione) o un blocco cuore-polmoni appena raccolte (cioè, il modello di cellulare, come esso mantiene le cellule di ratto nativo).
9. Passare i contenuti multimediali di cultura attraverso un rubinetto unidirezionale per eliminare l'aria e legare la cannula trachea da un filo di seta alla trachea.
10. Assicurarsi di evitare qualsiasi torsione della PA e della trachea. Nelle vicinanze il tappo del flacone di bioreattore con il polmone dell'impalcatura all'interno e, ancora una volta, asetticamente trasferire il bioreattore per l'incubatore e avviare la pompa ad una velocità di 6 mL/min.
11. Mezzi di coltura per 10-15 min per assicurarsi di eseguire tutti i lobi ottenere gonfiati e polmone sembra in buona forma (Figura 2).

4. metastasi modello e semina delle cellule

Nota: Procedere alla cella semina con il modello precedente del polmone per uno studio di crescita del tumore primario. Modificare l'impalcatura del polmone (acellulare o cellulare) come indicato di seguito per il modello metastatico.

1. Estrarre il bioreattore con l'impalcatura del polmone dall'incubatrice e metterlo nella biosicurezza armadietto.
2. Utilizzare una siringa Luer lock per passare 5 mL di terreno di coltura attraverso la trachea e aprire il tappo del bioreattore con l'impiccagione dell'impalcatura del polmone (Figura 2F).
3. A questo punto, una persona in più è necessaria per aiutare nella modifica del polmone ad un modello metastatico.
4. Ottenere la seta 2-0 pronto e utilizzare pinze angolari per fare un passaggio attraverso la trachea sul punto di biforcazione.
5. Legare la trachea fara ' il polmone di destra nel punto di biforcazione e controllare il libero flusso dei media attraverso la trachea per il polmone di sinistra passando terreni di coltura.
   Nota: Una volta la trachea è legata al punto di biforcazione, cellule seminate attraverso la trachea automaticamente saranno diretto alle sementi ai lobi sinistro. Può essere testato prima della semina delle cellule di coltura che spinge attraverso la trachea. Nel modello metastatico, i media si sposterà i lobi sinistro solo, che si gonfiano, e non i lobi destro¹⁰.
6. Impostare una siringa da 20 mL Luer lock in cima la cannula trachea e aggiungere le cellule di cancro del polmone ATCC (A549, H1299) in 50 mL di RPMI1640 completa di coltura (Figura 2F).
7. Eseguire la semina nella biosicurezza di cellulare. Aggiungere 15 mL di cellule nella siringa e farlo passare attraverso i lobi del polmone dalla forza di gravità. Aggiungere il resto delle cellule prima che eventuali bolle d'aria di passare attraverso.
8. Nella semina del polmone acellulare, raccogliere i media irrorati colano in bottiglia bioreattore e farlo passare attraverso la trachea nuovamente 3x.
   Nota: I media irrorato ha a volte le cellule tumorali senza semi. Pertanto, per il seeding efficiente, rimettere i media nella trachea attraverso la siringa.
9. Una volta seminato, rimuovere la siringa, aspettare 15 minuti, aggiungere media fresco e tornare il bioreattore in un'incubatrice. Rimuovere eventuali bolle d'aria nel tubo.
10. Avviare la pompa per irrorare i media a 6 mL/min.

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Risultati

Il polmone raccolto da rat mantiene intatto sistema vascolare e gli alveoli¹¹ (Figura 3A e 3B). Al momento di decellularizzazione, i componenti della matrice extracellulare di un polmone acellulare, quali collagene, fibronectina ed elastina, sono conservati¹¹ (Figura 3, 3D, 3Ee 3F). Il decellularizzazione conduce ad...

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Discussione

Il polmone di 4D ex vivo fornisce un'opportunità per studiare la crescita del tumore e metastasi in un setup del laboratorio. Una matrice di polmone nativo è un sistema complesso che fornisce il supporto al tessuto normale e mantiene le interazioni cellula-cellula, interazioni cellula-matrice, differenziazione cellulare e organizzazione del tessuto. Fornisce l'opportunità di aggiungere qualsiasi componente del microambiente del tumore per studiare gli effetti sulla crescita del tumore e l'interazione con altr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula