Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

Resumen

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

Resumen

El propósito del método presentado es mostrar, por primera vez, el trasplante de thymi recién en la cámara anterior del ojo de ratones adultos isogénicas para en vivo longitudinal seguimiento en tiempo real de la dinámica de thymocytes´ dentro de un vascularizado segmento de timo. Después del trasplante, láser, microscopía (LSM) a través de la córnea permite que en vivo no invasor proyección de imagen repetida a nivel celular de resolución. Lo importante es el enfoque agrega a maduración de células T intravital anterior imagen modelos la posibilidad de reclutamiento de células progenitoras continua y grabaciones de salida de células T maduras en el mismo animal. Ventajas adicionales del sistema son la transparencia de la zona injertada, permitiendo monitoreo rápido macroscópica del tejido implantado, y la accesibilidad al implante que permite localiza además de tratamientos sistémicos. La principal limitación es el volumen del tejido se ajusta en el reducido espacio de la cámara de ojo que exige para el ajuste del lóbulo. Se maximiza la integridad del órgano por disección lóbulos del timo en los patrones previamente demostrados ser funcionales para la producción de células T madura. La técnica es potencialmente adecuada para interrogar a un entorno de médicamente relevantes cuestiones relacionadas con la función del timo que incluyen autoinmunidad, inmunodeficiencia y tolerancia central; procesos que siguen siendo mecánico mal definidos. La disección fina de mecanismos rectores thymocyte migración, diferenciación y selección debe conducir a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a células T en desarrollo.

Introducción

Diferenciación intratímica de células T y células T subpoblación selección constituyen procesos claves para el desarrollo y mantenimiento de la inmunidad mediada por células en vertebrados¹. Este proceso implica una compleja secuencia de eventos firmemente organizados incluyendo el reclutamiento de progenitores de sangre, proliferación celular y migración, expresión diferencial de proteínas de la membrana y muerte celular programada masiva para subconjuntos selección. El resultado es la liberación de células T maduras reactivas a un amplio espectro de antígenos extraños mientras se muestra minimizado las respuestas para auto-péptidos, que final-hasta colonizar los órganos linfoides periféricos de los^2,3. Selección de timocitos aberrante del repertorio αβTCR conduce a enfermedades autoinmunes o desequilibrio inmune⁴ que derivan principalmente de defectos durante los procesos de selección de precursor positiva o negativa, respectivamente.

La migración direccional de los timocitos en el timo es intrínseca a todas las etapas de maduración de la célula de T y es concebido como una serie de simultáneas o secuenciales múltiples estímulos, como quimioquinas, adhesivo, y pegamento de la matriz extracelular (ECM) proteína las interacciones^3,5. El estudio de los tejidos fijos ha prestado información crítica con respecto a los patrones de expresión para señales migratorias thymocyte en microambientes tímicos definido^5,6, mientras que los estudios ex vivo ha revelado dos frecuentes comportamientos migratorios de los timocitos en dos áreas histológico del órgano: lentos movimientos estocásticos en la corteza y la movilidad rápida, confinada en la médula^{7,8,9,10 , 11 , 12 , 13}. aumento tasas migratorias correlacionan con selección positiva tímica¹³ y selección negativa se asocia con comportamientos rastreros apoyan la hipótesis de que la cinética de la travesía por el timo determina apropiado maduración de los timocitos. A pesar de su importancia, la topología de las interacciones de células estromales de timocitos y la dinámica de movilidad de timocitos en microambientes del órgano durante la maduración de células T siendo mal definida.

Mayoría ex vivo de los estudios realizados hasta la fecha incluyen fetales o reagregarse timo órgano culturas^14,15, rebanadas de tejido o explantes lóbulo tímico intacta donde se visualizan los movimientos anti-thymocyte por escaneo láser de dos fotones microscopia (TPLSM)⁸, una técnica con un máximo restringido distancia y profundidad de 1 mm según el tejido de imágenes intravital examinó¹⁶. En contraste con las culturas de órgano timo laboriosa en tiempos de incubación extendido para formar estructuras de 3D, tanto la técnica de slice tímico y la introducción de permiso de control de enfoque lóbulo tímico intacto de subconjuntos particulares de la etiqueta timocitos en un entorno de arquitectura de tejido propio. Sin embargo, puesto que el flujo sanguíneo está ausente en estos modelos, están claramente limitados para estudiar el proceso de contratación de timo colocar progenitores (TSPs) el parénquima del timo o la dinámica de egression timo de células T maduras.

Modelos in vivo para el estudio de la fisiología de maduración de células T tímico en ratones son los injertos de fragmentos o lóbulos del órgano entero colocados ya sea dentro de la cápsula renal¹⁷ o por vía intradérmica¹⁸. Aunque estas opciones demostraron su utilidad para interrogar sistémico funcional engraftment del tejido, la posición de los injertos tímicos profundos dentro del animal o cubiertos por capas de tejido opaco restringe su uso en vivo examen de implantes por TPLSM.

La cámara anterior del ojo proporciona un espacio de fácil acceso para monitoreo directo de los tejidos injertados en virtud de la transparencia de las capas corneales. De ventaja, la base de la cámara formada por el iris es rica en vasos sanguíneos y las terminaciones nerviosas autonómicas, lo que permite la rápida revascularización y reinervación de los injertos^19,20. Dr. Caicedo ha utilizado este espacio anatómico para el mantenimiento y el estudio longitudinal de islotes pancreáticos en los últimos²¹. Aquí, mostramos que esta estrategia no sólo constituye un enfoque válido para estudiar la dinámica de timocitos dentro de la estructura del órgano nativo, pero también únicamente permite extender el en vivo grabaciones longitudinales para el estudio del reclutamiento del progenitor y pasos de egression células T madurados en ratón.

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Protocolo

El cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los experimentos según las pautas IACUC.

1. aislamiento y corte de recién nacido Thymi

1. Preparar todos los reactivos y los instrumentos por autoclave u otros métodos, asegurando las condiciones de esterilidad.
2. Para minimizar la contaminación, realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo campana de flujo laminar.
3. Antes euthanizing ratones donantes, llene un recipiente estéril de 60 mm con 1 prechilled estéril x solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y coloque en hielo. Se utilizará para aclarar y almacenar el thymi suprimido de los ratones del donante antes del trasplante.
4. Proceder a la eutanasia a ratones recién nacidos de donante por decapitación, con arreglo a directrices éticas.
5. Coloque el ratón sobre toallas de papel absorbente estéril en posición vertical dorsal y spray y limpiar más adelante, el abdomen de ratón con etanol al 70%.
6. Exponer la cavidad torácica haciendo una incisión superficial en forma de V a nivel de abdomen inferior y cortar la piel con un par de recto 10 cm disección tijera siguiendo una línea media ventral dejar una abertura de aproximadamente 0.5-1 cm a la altura del pecho. Doblar la piel sobre cada lado del pecho para exponer la cavidad torácica.
7. Hacer dos más 0.5-1 cm incisiones laterales a través del diafragma y caja torácica con el mismo tipo de tijeras a mediastino superior en la cavidad torácica anterior. El timo debe aparecer como dos lóbulos pálidos sobre el corazón.
8. Lugar una serie de fórceps curvos por debajo de la timo y tirar verticalmente para extraer el órgano completo. Prevenir el foldback de la caja torácica con un par de pinzas. Si es necesario, usar pinzas finas cuidadosamente desgarrando el tejido conectivo que rodea el órgano sin interrumpir la cápsula antes de extraer el órgano.
   Nota: Este paso se facilita mediante el uso de un ámbito de disección.
9. Sumerja el timo aislado en frío estéril de 1 x PBS (pH 7.4) previamente muestra en un recipiente estéril de 60 mm y cortar el istmo conectivo con bisturí para separar los lóbulos tímicos. Quite los desechos del plato sin dañar la cápsula. Para minimizar el tiempo exponen thymi, recortar lóbulos de tomillo antes de implante.
   Nota: Cada timo recién aislado normalmente hará seis segmentos de aproximadamente 1 mm de ancho por un máximo de tres ratones de host al recibir implantes en ambos ojos.
10. Repita los pasos 1.4-1.9 para cada ratón donante. Para minimizar el tiempo exponen thymi, aislar un timo a la vez.

2. timo implantación en la cámara Anterior del ojo

1. Antes del trasplante, la etiqueta y pesar cada ratón receptor.
2. Usar una dosis entre 1-2% de los vapores de isofluorane para anestesiar el ratón receptor. Anestesia adecuada para asegurar la ausencia de reflejo pellizco del dedo del pie siguiente antes de iniciar el procedimiento quirúrgico.
3. Proceder con el trasplante de timo segmentos como sigue:
   1. Coloque el ratón en una posición decúbito lateral para un ojo quede hacia arriba expuestos directamente a la lente del telescopio disección.
   2. Suprimir uno de los lóbulos tímicos aislados en frío 1 x PBS (pH 7.4)-lleno plato 60 mm en piezas de hasta 1 mm de ancho para el implante. Siguen un patrón de zig-zag para asegurar que cada segmento contiene médula y la corteza tímica. Utilizar tijeras de vannas para recortar según lineamientos en la figura 1A.
      Nota: Ajuste del timo debe hacerse justo antes de implante para optimizar el injerto de tejido.
   3. A partir de la base de la córnea correspondiente al área quirúrgico, introduzca la punta de una aguja de 40 mm G18 para hacer una pequeña incisión en las capas externas de la córnea para que se pueda introducir la punta de tijera de disección.
   4. Hacer un 5-10 mm flanco incisión directamente alrededor de la base de la córnea usando tijeras de vannas manteniendo la apertura de córnea firmemente para evitar que cierre. Utilizar pinzas con puntas planas para evitar daño a los tejidos.
   5. Sujete el epitelio córneo cortado y exponer la apertura mediante la celebración de la córnea con un par de pinzas de punta plana mientras empuja un timo segmento a través de la abertura. Moje el ojo con estéril de 1 x PBS (pH 7.4) o lágrimas artificiales según sea necesario para evitar la desecación del tejido hasta la manipulación.
   6. Presione suavemente sobre la superficie del ojo para el segmento de tejido introducidos a una posición lateral con respecto a la pupila para preservar la función de eye´s. Asegúrese de que el injerto se encuentra en una ubicación frente a los ojos apertura para evitar las interferencias posteriores con la proyección de imagen por novatadas.
   7. Con la ayuda de pinzas planas, presione firmemente, por unos 3-5 s, los dos lados de la apertura corneal uno contra el otro para promover el cierre automático. La cirugía no requiere ningún grapar o coser.
4. Si los transplantes se realizan en ambos ojos, gire el ratón sobre el lado lateral opuesto directamente exponer el segundo ojo a la lente del microscopio de disección y repita los pasos 2.3.2-2.3.7.
5. Una vez finalizada la cirugía, devuelva el ratón a una jaula vacía precalentada con una lámpara de calor.
6. Asegúrese de que cada ratón trasplantado recupere movilidad completa y a conciencia antes de colocarlo en una jaula compartida con otros animales. Esto ocurre generalmente dentro de 1 h después de la cirugía.
7. Trasplante, tratar a los ratones con analgésicos según sea necesario y proporcionar los ratones con acetaminofén a una concentración de 1,6 mg/mL en el agua potable.
8. Repita los pasos 2.2-2.9 para cada ratón receptor.
9. Seguimiento postoperatorio actividad animal, así como la aparición de los ojos implantados para detectar posibles complicaciones de salud.

3. confocal imagen de Thymi implantado utilizando fotones 3D solo fluorescencia Microscopía Confocal

1. Anestesiar el ratón receptor usando una dosis entre 1-2% de los vapores de isofluorane. Asegurar adecuada anestesia por la ausencia de reflejo pellizco del dedo del pie siguiente antes de iniciar el procedimiento de proyección de imagen
2. Coloque el ratón sobre una plataforma de microscopio de escenario fijo en una posición decúbito lateral para un ojo quede hacia arriba. Se coloca una almohadilla de calor en la plataforma de microscopio para asegurar la temperatura del cuerpo constante de ratones durante grabaciones.
   Nota: Ver figura 1 complementaria para obtener más información.
3. Inserte la cabeza del ratón de un headholder estereotáctica y gire el mando para sujetar la cabeza del ratón en una posición de lado lateral que permite el acceso directo del objetivo del microscopio a la vista con el injerto de timo.
4. Colocar el hocico del ratón en una máscara de gas para mantener el animal anestesiado durante procedimiento. Esto permite el ajuste de isofluorane vapores según sea necesario.
5. Para facilitar la estabilización del ojo durante grabaciones evitando la retracción de los párpados, tire de los párpados manteniendo los ojos en el margen corneal con un par de pinzas que tienen sus puntas cubiertas por un tubo de polietileno que se unen a una UST-2 empalme universal del sólido. Este arreglo permite una fijación estable de la cabeza y el ojo y proporciona flexibilidad sin interrupción del flujo de sangre en el ojo, como se describió anteriormente²².
   Nota: Complementario figuras 1B, C mostrar el conjunto completo.
6. Añadir unas gotas de lágrimas artificiales o solución Salinas estériles como el líquido de inmersión entre la córnea y la lente, antes de colocar el objetivo del microscopio sobre el ojo de ratón.
   Nota: adicionales gotas se dispensan en necesidad durante todo el procedimiento a seguir el camino de microscopio y prevenir la resequedad del ojo.
7. Primer uso lente de poco aumento (5 X) para localizar el timo en el campo del microscopio. Luego cambiar a más alta resolución (10, 20 y 40 X) agua inmersión sumergir objetivos con distancia de trabajo larga. Evitar el fotoenvejecimiento LSM y blanqueo del implante tímico mediante la aplicación de energía mínima y reducir el tiempo de exploración tanto como sea posible. Esto se logra usando el explorador resonante del microscopio.
   Nota: El microscopio confocal que utilizamos está equipado con espejos de exploración resonantes capaces de recoger imágenes en 25 cuadros/s. Otras marcas tienen sus propios microscopios con escáneres de resonancias.
8. Seleccione el modo de adquisición mediante el software del microscopio e iniciar el modo de escáner resonante. Seleccione el modo imagen XYZT y configurar los parámetros de adquisición de la siguiente manera:
   1. Encienda el láser de argón y ajustar la potencia al 30% para la excitación de fluorescencia.
   2. Elija una línea láser de excitación y ajuste el control de splitter (AOBS) viga acusto-óptico para longitudes de onda de emisión diferentes. Además, para detectar rayos y delinear la estructura del tejido, utilizar la detección de la reflexión al mismo tiempo.
      Nota: Al seleccionar un conjunto de colores para la excitación (GFP y RFP), el AOBS automáticamente está programado para dirigir estas líneas de excitación sobre el espécimen y transmitir la emisión entre ellos. Por ejemplo, para la GFP y RFP, utilizamos bandas estrechas de la reflexión de luz de excitación alrededor de 488 nm y 561 nm, respectivamente. Esto deja grandes bandas para la colección de fotones fluorescencia emitida, reduciendo así la necesidad de tiempo de poder y adquisición del láser. En modo reflexión, el AOBS se utiliza como un divisor de viga de 50/50 para luz reflejada en cualquier longitud de onda de los utilizados para la detección de emisión de fluorescencia de imagen.
   3. Recoger la emisión a longitud de onda seleccionada, luego seleccione una resolución de 512 × 512 píxeles y empezar en la proyección de imagen presionando el botón de Live , ajustar los niveles de ganancia según sea necesario (ganancia típica es alrededor de 600 V).
   4. Definir el principio y al final de la pila de z, centrándose en la parte superior del implante tímico y seleccione comenzar, luego mover hasta el último plano que puede ser enfocado en el timo implantado y seleccione fin. Utilice un tamaño de paso z de 5 μm. El software automáticamente calcula el número de aviones confocales.
   5. Elegir el intervalo de tiempo para la adquisición de cada pila de z (normalmente de 1.5 a 2 segundos) y seleccione la opción de adquirir hasta para la proyección de imagen continua.
9. Pulse el botón Start para inicializar.
10. Los injertos imagen repetidamente en diferentes momentos del mismo animal repitiendo los pasos 3.1-3.9.
    Nota: Si el animal tiene injertos en ambos ojos, grabaciones de cualquiera de los dos ojos pueden tomarse repitiendo los pasos 3.2-3.9 después de cambiar el lado de la posición vertical de la cabeza de ratón.

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Resultados

Timo de ratones recién nacidos fueron aislados de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratones como se describe en este protocolo (pasos 1.1-1.9). En estos ratones transgénicos, el promotor de pollo beta actina dirige la expresión de la variante de la proteína fluorescente roja DsRed. MST bajo la influencia de la inmediata temprana potenciador del citomegalovirus (CMV) facilitando el seguimiento de los implantes.

Para...

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Discusión

Debido a la importancia de la maduración de células T para competencia inmune individual⁴ y el presunto impacto de precursor celular dinámica en células T maduras producidas por el timo^2,3, se han invertido grandes esfuerzos desarrollar alternativas al enfoque clásico tejido fijo instantánea.

Aunque claramente superiores en la reproducción de la arquitectura del tejido de monocapas o agregado órgano timo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA