JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью протокола является показать продольной прижизненной слежение в реальном времени тимоцитов, лазерной сканирующей микроскопии в тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Прозрачность роговицы и васкуляризация трансплантат позволяет непрерывно записывать прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выхода.

Аннотация

Представлен метод призвана показать, в первый раз, пересадка новорожденных thymi в передней глаз палаты isogenic взрослых мышей в vivo продольной реального времени мониторинга динамики thymocytes´ в пределах васкуляризированной Тимус сегмент. После трансплантации лазерной сканирующей микроскопии (МИС) через роговицу позволяет в vivo неинвазивной повторяющихся изображений на уровне клеточных резолюции. Важно отметить, что подход добавляет предыдущих прижизненной созревание Т-клеток, визуализации модели возможность непрерывного прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выход записи в то же самое животное. Дополнительные преимущества системы являются прозрачность привитые области, позволяющие макроскопических быстрого мониторинга имплантированных ткани, и доступность для имплантации, позволяя для локализованных в дополнение к системной терапии. Основным ограничением является объем ткани, вписывается в ограниченном пространстве глаз камеры, которая требует для обрезки лепестка. Целостности органа максимизируется путем рассечения тимуса лопастями в шаблоны, ранее показанный функциональным для зрелых Т-клеток производства. Техника потенциально подходит допросить окружение медицински соответствующих вопросов, связанных с тимуса функции, которые включают аутоиммунные заболевания, приобретенного иммунодефицита и центральной толерантности; процессы, которые остаются механистически плохо определены. Тонкой рассечение руководящих тимоцитов миграции, дифференциация и выбор механизмов должно привести к Роман терапевтические стратегии ориентации развивающихся Т-клеток.

Введение

Intrathymic Т-клеточная дифференцировка и выбор субпопуляции Т-клеток являются ключевых процессов для развития и поддержания клеточного иммунитета в позвоночных1. Этот процесс включает в себя сложные последовательности плотно организованных мероприятий, включая вербовку прародителей от крови, пролиферации и миграции, дифференциальной выражение мембранных белков, и массивные запрограммированная смерть клетки для подмножества выбор. Результатом является освобождение зрелых Т-клетки реагируют на большой спектр иностранных антигены во время отображения свернутого ответы на self пептиды, которые конца вверх колонизировать периферических лимфоидных органов отдельных2,3. Аберрантное тимоцитов выбор репертуара αβTCR приводит к аутоиммунным заболеванием или иммунных дисбаланс4 , которые главным образом являются производными от дефектов во время процесса отбора положительное или отрицательное прекурсоров, соответственно.

Направления миграции тимоцитов через тимуса является неотъемлемой частью всех стадий созревания Т-клеток и это предусмотрено как серию одновременное или последовательное несколько стимулов, включая chemokines, клей, и снять клей внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия протеина3,5. Изучение фиксированных тканей оказывает крайне необходимую информацию о характере выражения для мигрирующих подсказки тимоцитов в определенных тимуса микросреды5,6, в то время как ex vivo исследований выявил два распространенных мигрирующие поведение тимоцитов в два гистологически различных областях органа: медленный Стохастический движений в коре и быстрый, ограничивается подвижность в продолговатого мозга-7,-8,9,10 , 11 , 12 , 13. увеличение миграционных ставки коррелируют с тимуса позитивного выбора13 и негативный выбор связан с поддерживая гипотезу, что кинетика путешествие через тимуса определяет правильное поведение при обходе созревания тимоцитов. Несмотря на их актуальности топология взаимодействия тимоцитов стромальных клеток и динамика тимоцитов моторики через орган микросреды во время созревания Т-клеток остаются плохо определены.

Большинство ex vivo исследования на сегодняшний день включают плода или reaggregate тимуса орган культур14,15, кусочки ткани или эксплантов нетронутыми доли тимуса, где тимоцитов движений визуализируются два фотона лазерного сканирования микроскопия (TPLSM)8, прижизненные изображения технику с ограниченным максимальное рабочее расстояние и визуализации глубиной 1 мм в соответствии с ткани изучены16. В отличие от кропотливого тимуса орган культур, которые зависят от расширенной инкубации раз в виде 3D-структуры, предварительно помечены как, тимуса ломтик технику, так и нетронутыми доли тимуса подход разрешение контроль введения определенных подмножеств тимоцитов в среду архитектуры родной ткани. Однако, так как поток крови отсутствует в этих моделях, они явно ограничены для изучения процесса набора персонала, урегулирования прародителями (ОТУ) тимуса паренхиме или динамика тимуса egression зрелых Т-лимфоцитов тимуса.

В естественных условиях модели для изучения тимуса Т-клеточной физиологии созревания в мышах включают графтов фрагментов или весь орган лопастями, размещены либо внутри почек капсула17 или intradermally18. Хотя эти варианты показал их полезности допросить системного функционального приживления ткани, позиция тимуса графтов глубоко внутри животного или охваченных слоев непрозрачной ткани ограничивает их использование для экспертизы в vivo имплантатов TPLSM.

Передней камеры глаза обеспечивает легкодоступными пространство для непосредственного мониторинга любых привитые ткани благодаря прозрачности роговицы слоя. Преимущество основание камеры, образованной радужки богат кровеносных сосудов и вегетативной нервных окончаний, позволяя быстрое реваскуляризации и Реиннервация графтов19,20. Д-р Caicedo успешно использовал это анатомические пространство для поддержания и продольной исследование панкреатических островков в прошлом21. Здесь мы показываем, что эта стратегия не только представляет собой допустимый подход к изучению тимоцитов динамика в структуре родной орган, но также однозначно разрешает продлить в vivo продольной записи к изучению прародитель вербовки и зрелых Т-клеточной egression шаги в мыши.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты согласно рекомендациям IACUC одобрил институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Майами.

1. изоляция и обрезки новорожденных Thymi

  1. Подготовьте все реагенты и инструменты автоклавирования или других методов, обеспечение стерильных условий.
  2. Чтобы свести к минимуму загрязнений, выполняют все хирургические вмешательства под капотом ламинарного потока.
  3. До euthanizing доноров мышей, заполнить 60 мм стерильные блюдо с стерильных prechilled 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4) и поместите его на льду. Он будет использоваться для промывки и хранения подакцизным thymi от доноров мышей до трансплантации.
  4. Перейти к усыпить доноров новорожденных мышей, обезглавливание, в соответствии с руководящими принципами этики.
  5. Поместите курсор мыши на стерильные абсорбирующие бумажные полотенца в спинной вертикальном положении и спрей и позднее wipe, брюшко мыши с 70% этиловом спирте.
  6. Разоблачить грудной полости, делая поверхностный V-образный разрез на уровне нижней части живота и вырезать кожу с парой прямых 10 см, рассекает ножницы после вентральной срединной оставить отверстие около 0,5-1 см на уровне груди. Сложите кожи над каждой стороне груди подвергать грудной полости.
  7. Сделать два глубже 0,5-1 см боковые разрезы через диафрагму и грудную клетку с тем же типом ножницы для доступа к превосходной средостения в передней грудной полости. Тимуса должен появиться как два бледно лопастями прямо над сердцем.
  8. Место набор Изогнутый пинцет под тимуса и тянуть вертикально для извлечения полного орган. Предотвратить foldback грудной клетки с парой щипцов. При необходимости, использовать тонкой щипцами осторожно разорвать соединительной ткани, окружающие орган не нарушая капсулу перед извлечением орган.
    Примечание: Этот шаг облегчается с использованием рассечения области.
  9. Погружаться изолированных тимуса в холодного стерильного ПБС (рН 7,4) ранее отображается в стерильную посуду 60 мм и вырезать соединительной перешейка с помощью скальпеля отделить тимуса лопастями. Удалите любые инородные тела из блюдо не повреждая капсулу. Чтобы свести к минимуму время, подвергаются thymi, обрезать тимьян лопастями прямо перед имплантата.
    Примечание: Обычно каждый изолированных новорожденных тимуса окажет шесть сегментов около 1 мм в ширину, максимум три узла мышей при получении имплантатов в обоих глазах.
  10. Повторите шаги с 1,4-1,9 для каждой мыши доноров. Чтобы свести к минимуму время, подвергаются thymi, изолируйте один тимуса одновременно.

2. тимуса имплантации в переднюю камеру глаза

  1. До трансплантации тегов и весят каждого получателя мыши.
  2. Используйте дозу между 1-2% isofluorane паров чтобы анестезировать получателя мыши. Обеспечение надлежащего анестезии отсутствие рефлекс следующие мыс крайнем случае перед началом хирургической процедуры.
  3. Продолжите трансплантации тимуса сегментов следующим образом:
    1. Поместите курсор мыши в сторону боковое положение лежа так что один глаз вверх непосредственно подвержены объектив рассечения сферы.
    2. Акцизный один из изолированных тимуса лопастями, лежа в холодной ПБС (рН 7,4)-заполнены 60 мм блюдо на куски толщиной до 1 мм для имплантата. Следуйте шаблон Зиг заг, чтобы гарантировать, что каждый сегмент содержит тимуса коры и мозгового вещества. Использование беззаботными ножницы для обрезки согласно рекомендации, представленные на рисунке 1A.
      Примечание: Обрезка тимуса должно быть сделано прямо перед имплантат для оптимизации приживления ткани.
    3. Начиная с основания роговицы, соответствующий зоне хирургические, ввести кончик иглы 40 мм G18 сделать небольшой надрез в слои внешние роговицы, так, что кончик рассечения ножницы могут быть введены.
    4. Сделайте 5-10 мм фланка разрез непосредственно вокруг основания роговицы с помощью ножниц беззаботными удерживая роговицы открытия твердо для предотвращения запечатывания. Используйте щипцы с плоскими концами, чтобы избежать повреждения тканей.
    5. Возьмите отрезока эпителия роговицы и разоблачить открытия, удерживая толкая тимуса сегмент путем открытия роговицы, с парой плоским, закончившийся щипцов. Влажные глаза с стерильных 1 x PBS (рН 7,4) или искусственные слезы, необходимых для предотвращения высыхания ткани до завершения манипуляции.
    6. Нажмите мягко на поверхности глаза скользить сегмент представлен ткани на боковой позиции в отношении ученика для сохранения функции eye´s. Убедитесь, что трансплантат лежит на месте напротив глаза открытия для предотвращения задняя помехи изображений, Дедовщина.
    7. С помощью плоских щипцов, нажмите твердо, для около 3-5 s, обе стороны роговицы открытия против друг друга, содействовать самоуплотняющийся. Операции не требуют каких-либо сшивание или шитья.
  4. Если пересадки выполняются на обоих глазах, переверните мышь противоположной боковой разоблачить второй глаз для рассечения объектива микроскопа и повторите шаги 2.3.2-2.3.7 напрямую.
  5. После завершения операции, вернуть пустой клетке разогретую с тепла лампы мышь.
  6. Убедитесь, что каждый пересаженных мыши восстанавливает полную мобильность и сознание перед его размещением в клетке, совместно с другими животными. Это обычно происходит в течение 1 ч после операции.
  7. После пересадки лечить мышей с болеутоляющие, при необходимости и обеспечивают мышей с ацетаминофена в концентрации 1,6 мг/мл в питьевой воде.
  8. Повторите шаги с 2,2-2,9 для каждого получателя мыши.
  9. Послеоперационные животных на мониторе, а также вид имплантированных глаз для выявления потенциальных осложнений.

3. конфокальная томография имплантированных Thymi с использованием 3D один фотон флуоресценции Confocal микроскопии

  1. Анестезировать получателя мыши с помощью дозы 1-2% isofluorane паров. Обеспечение надлежащего анестезии отсутствие рефлекс следующие мыс крайнем случае перед началом процедуры обработки изображений
  2. Поместите курсор мыши на платформе фиксированной Этап микроскопа в стороне боковой лежачем положении, так что один глаз вверх. Площадку тепла помещается на платформе микроскоп для обеспечения постоянной тела температуры мышей во время записи.
    Примечание: Подробная информация приведена дополнительная цифра 1 .
  3. Вставьте головку мыши в стереотаксического headholder и отрегулируйте ручку удержать голову мыши на боковой позиции, позволяя прямой доступ Микроскоп цели для глаз, держа тимуса трансплантата.
  4. Место мыши мордой в противогаз, чтобы сохранить животных, под наркозом на протяжении всей процедуры. Это позволяет регулировать isofluorane паров при необходимости.
  5. Для содействия стабилизации глаза во время записи избегая Ретракция век, тянуть обратно веки пока держащ глаза на периферии роговицы с парой пинцет, которые имеют их советы, охватываемых полиэтиленовые трубки, которые прилагаются к Усть-2 твердых Карданное соединение. Этот механизм позволяет устойчивый фиксации головы и глаз и обеспечивает гибкость без нарушения потока крови в глаза, как описано выше22.
    Примечание: Дополнительные цифры 1B, C показывают полную сборку.
  6. Добавьте несколько капель стерильным физиологическим или искусственные слезы как погружения жидкости между роговицы и хрусталика, перед размещением Микроскоп цель на мышь глаз.
    Примечание: дополнительные капли обойтись на потребность во всей процедуре держать путь микроскоп и предотвращения высыхания глаз.
  7. Сначала используйте малое увеличение (5 X) объектив для поиска тимуса в поле микроскопа. Затем переключиться на более погружения в воду (10, 20 и 40 X) окунать целей с большим рабочим расстоянием. Избегайте LSM фотоповреждения и отбеливания тимуса имплантата путем применения минимальной лазерной энергии и сократить время сканирования как можно больше. Это достигается с помощью резонансный сканер микроскопа.
    Примечание: Конфокального микроскопа, мы используем оснащен резонансного сканирования зеркала, способных сбора изображений на 25 кадров/сек. Другие бренды имеют свои собственные Микроскопы с резонансной сканеров.
  8. Выберите режим приобретения с помощью микроскопа программного обеспечения и начать режим резонансный сканер. Затем выберите режим визуализации XYZT и настройте параметры приобретения следующим образом:
    1. Включите Аргонового лазера и отрегулировать мощность до 30% для возбуждения флуоресценции.
    2. Выберите линию лазерного возбуждения и задайте Акусто оптический луч (AOBS) разделителя для выбросов различных длинах волн. Кроме того для выявления обратного рассеяния и разграничить структуры тканей, обнаружения отражение одновременно.
      Примечание: При выборе набора цветов для возбуждения (GFP и ППП), AOBS автоматически программируется направлять эти линии возбуждения на образец и передавать выбросов между ними. Например, для GFP и ППП, мы используем отражения узких полос для возбуждения свет около 488 нм и 561 Нм, соответственно. Это оставляет широкие полосы для коллекции Фотоны испускаемого флуоресценции, таким образом уменьшая потребность для лазерной энергии и приобретение время. В режиме отражения AOBS используется как равного пучка сплиттер для изображения отраженного света в любого волны от тех, которые используются для флуоресценции обнаружения выбросов.
    3. Собирать выбросов на выбранной длине волны, а затем выберите разрешение 512 × 512 пикселей и начать жить изображений, нажав на кнопку Live , регулируя уровни усиления, при необходимости (типичный прирост составляет около 600 V).
    4. Определить начало и конец z-стека, сосредоточив внимание на вершине тимуса имплантата и выберите начать, а затем перейти к последнему плоскость, которая может быть направлена в имплантированных тимуса и выберите конец. Используйте размер z шаг 5 мкм. Программное обеспечение автоматически рассчитает количество конфокальный самолетов.
    5. Выберите временной интервал для приобретения каждого z-стека (обычно 1,5 до 2 секунд) и выберите опцию приобрести до остановки для непрерывной обработки изображений.
  9. Нажмите кнопку Пуск для инициализации.
  10. Неоднократно изображения графтов в разное время от же животное, повторив шаги 3.1-3.9.
    Примечание: Если животное держит графтов на обоих глазах, записи из обоих глаз может принять, повторив шаги 3.2-3.9 после переключения вертикальном положении стороне мыши головы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Тимус от новорожденных мышей были изолированы от B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Жас мышей, как описано в настоящем Протоколе (шаги 1,1-1,9). В этих трансгенных мышей промоутер актина курица бета направляет выражение Красного флуоресцирующего белка вариант DsRed. MST под влиянием цито?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Ввиду важности процесса созревания Т-клеток для индивидуальной иммунной компетентности4 и предполагаемого воздействия прекурсоров клеток динамики на зрелых Т-клетки, производимые тимуса2,3инвестировали значительные усилия разработать ал?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH грантов R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) и R21ES025673 (AC) и лучшие/2015/043 Грант (Consellería де Educació, cultura я киберспорта, Женералитата valenciana, Валенсия, Испания) (ЭО). Авторы благодарят команду отправлено в Universidad Católica де Валенсия Сан Висенте Мартир, Валенсия, Испания и Альберто Эрнандес в Centro de Investigación Принсипе Фелипе, Валенсия, Испания, за их помощь с видео съемки и редактирования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Isofluorane vaporizer w/isofluoraneKent Scientific CorpVetFlo-1215
Dissecting scope w/light sourceZeissStemi 305
Fine dissection forcepsWPI500455
Medium dissection forcepsWPI501252
Curved tip fine dissection forcepsWPI15917
Vannas scissorsWPI503371
Dissecting scissorsWPI503243
ScalpelWPI500353
40 mm 18G needlesBD304622
Disposable transfer pipetteThermofisher201C
Heat pad and heat lampKent Scientific CorpInfrarred
Ethanol 70%VWR83,813,360
60 mm sterile dishSIGMACLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)Thermofisher10010023
Sterile wipesKimberly-ClarkLD004
Drugs for pain managementSigma-AldrichA3035-1VL
Saline solution or ViscotearsNovartisN/A
StereomicroscopeLeicaMZ FLIII
Head-holding adapterNarishigeSG-4N-S
Gas maskNarishigeGM-4_S
Confocal microscopeLeicaTCS SP5 II
Laminar flow hoodTelstarBIO IIA

Ссылки

  1. Boehm, T., Hess, I., & Swann, J.B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-35 (2006).
  3. Dzhagalov, I., & Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-82 (2012).
  4. James, K.D., Jenkinson, W.E &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. [Epub ahead of print] (2018).
  5. Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D.A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., & Villa-Verde, D.M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-61 (2004).
  6. Petrie, H.T., & Zúñiga-Pflücker, J.C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-79 (2007).
  7. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., & Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  8. Ladi, E., Herzmark, P., & Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
  9. Bhakta, N.R., Oh, D.Y., & Lewis, R.S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
  10. Ehrlich, L.I., Oh, D.Y., Weissman, I.L., & Lewis, R.S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  11. Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y.F., Chakraborty, A.K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
  12. Sanos, S.L., Nowak, J., Fallet, M., & Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
  13. Witt, C.M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A.K., & Robey, E.A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
  14. Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J.C., & Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
  15. White, A., Jenkinson, E., & Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
  16. Dunn, K.W., & Sutton, T.A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
  17. Caetano, S.S., Teixeira, T., & Tadokoro, C.E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
  18. Li, J., Iwanami, N., Hoa, V.Q., Furutani-Seiki, M., & Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-15 (2007).
  19. Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459, (1998).
  20. Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
  21. Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I.B., & Berggren, P.O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-86 (2008).
  22. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14(5), 574-8 (2008).
  23. Morillon, Y.M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., & Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
  24. Liu, L.L., Du, X.M., Wang, Z., Wu, B.J., Jin, M., Xin, B. et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-7 (2012).
  25. Manna, S., & Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-9 (2016).
  26. Abdulreda, M.H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108(31), 12863-8 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены