Aparato para la recolección de tejido Microcolumns

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la producción de la cosecha las agujas que pueden utilizarse para recoger tejidos de la piel de espesor total sin causar donantes sitio marcar con una cicatriz. Las agujas pueden combinarse con un sistema de recolección simple para lograr la recolección de gran volumen.

Resumen

Este manuscrito describe el proceso de producción de un aparato de laboratorio, componentes estándar, que puede utilizarse para recoger microcolumns del tejido cutáneo de espesor total. El tamaño pequeño de la microcolumns permite que los donantes sitios curar rápidamente sin causar sitio dispensador de aceite marcar con una cicatriz, mientras cosecha tejido de grosor total permite la incorporación de todos los componentes celulares y extracelulares del tejido de la piel, los incluidos asociados con regiones dérmicas más profundas y las estructuras anexiales de la piel, que todavía tienen que ser reproducido con éxito utilizando la técnicas de ingeniería convencional. El microcolumns puede ser aplicado directamente en las heridas de la piel para aumentar la sanación, o pueden utilizarse como fuente de tejido autólogo de la célula de otros enfoques de ingeniería de tejidos. Las agujas de cosecha se hacen modificando agujas hipodérmicas estándar, y puede ser usados solo para cosechar pequeñas cantidades de tejido o combinados con un sistema de simple colección basada en succión (también hecho de suministros de laboratorio comúnmente disponibles) para alto volumen de la cosecha para facilitar los estudios en modelos animales grandes.

Introducción

Injerto de piel autólogo es la base de la reparación de la herida, pero está limitado por la escasez de sitio donante y la morbilidad, llevando a los esfuerzos en las últimas décadas para desarrollar nuevas opciones terapéuticas para reemplazar convencionales injertos de piel^1,2 . Recientemente hemos desarrollado un método alternativo de recolección piel para aprovechar las ventajas del injerto de piel de grosor total reduciendo al mínimo morbosidad del sitio donante. Recogida de piel de grosor total en forma de pequeño (~0.5 mm de diámetro) "microcolumns", sitios dispensadores de aceite son capaces de sanar rápidamente y sin dejar cicatrices en circunstancias normales (para posibles excepciones, véase la sección discusión)³. Microcolumns puede ser aplicado directamente en camas de la herida para acelerar el cierre de la herida, reducir la contracción³y restaurar una amplia gama de tipos de células epidérmicas y dérmicas y las estructuras adnexal funcional⁴, muchos de los cuales carecen de injerto de piel del partir-grueso convencional o actual Bioingeniería de sustitutos de piel,⁵. La capacidad de microcolumns para aumentar la curación y de sus sitios de donantes a curar sin dejar cicatrices tanto sido independientemente validados por otros grupos de investigación^6,7.

Previamente hemos desarrollado un sistema de recolección de laboratorio para permitir la colección de microcolumns en escala de⁸; sin embargo, este sistema se compone de muchos componentes modificados para requisitos particulares que no están ampliamente disponibles. Aquí, describimos en detalle el proceso de recolección de agujas, así como sistemas de recolección simple, sobre todo componentes estándar, que puede utilizarse para lograr alto volumen cosecha produciendo. El aparato descrito en este manuscrito es conveniente para la vitro y el trabajo animal, pero no para el uso en seres humanos. Un dispositivo clínico con autorización de la FDA para la aplicación de esta técnica en seres humanos está disponible en el mercado pero no se discutirá en detalle aquí.

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Protocolo

Todo el trabajo con animales vivos y muestras de tejidos animales han sido aprobadas por el Massachusetts General Hospital institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).

1. producción de la cosecha de agujas

1. Configuración de la etapa de producción
   1. Asegure un conector luer hembra de cerradura en un poste y montar el post a un escenario de rotación para que la cerradura de luer está en el centro de la etapa (figura 1A).
   2. Esta primera etapa de la rotación de la posición vertical, montar y perpendicular a un escenario de segunda rotación horizontal (figura 1B).
   3. Montar la etapa horizontal de la rotación en una etapa de la traducción de dos ejes (figura 1B).
   4. Fije la combinación sobre una superficie estable, como una placa óptica.
   5. Por separado montar una herramienta giratoria sobre la misma placa, con la herramienta colocada en paralelo con la placa y en aproximadamente la misma altura que el conector de cierre luer en la etapa de combinación de rotación y traducción (figura 1C).
   6. Instalar dos discos de corte concéntrico en la herramienta rotatoria (un grano más pequeño, más bajo corte disco de diamante sobre un disco de piedra abrasivo de grano más grande, más alto) (figura 1D).
      Nota: Sobre una 9 mm es suficiente diferencia entre los diámetros de las dos ruedas.
   7. Posición de una luz cenital de la fuente con un brazo ajustable sobre la herramienta rotatoria, con la luz a las ruedas de corte.
   8. Para mejorar la visualización, coloque un microscopio de disección sobre la instalación de producción de modo que el ocular se enfoca en los discos de corte (figura 1C).
      Nota: Como alternativa, los usuarios pueden usar gafas de aumento.
2. Remodelación de la punta de la aguja
   1. Use gafas protectoras y una mascarilla quirúrgica para evitar que partículas metálicas en los ojos o vías respiratorias.
   2. Elegir el calibre de agujas hipodérmicas de la adecuada tamaño, basado en requisitos experimentales.
   3. Marque la longitud deseada en cada cosecha la aguja.
      Nota: Para la recolección de piel porcina, agujas de 8 mm son normalmente suficientes; Aunque la longitud puede variar en función de necesidades experimentales (e.g., espesor del tejido de la piel blanco, tamaño de calibre de la aguja). Generalmente, una aguja de calibre 19 funciona bien para la piel porcina.
   4. Baje la aguja perpendicular a la herramienta giratoria con el poder, utilizando el borde del disco de corte exterior que corte la longitud excesiva de la aguja, en el punto marcado en paso 1.2.3.
   5. Conecte la aguja acortada, Roma para el conector de cierre luer hembra en la etapa de producción.
   6. Ajustar la fase horizontal de la rotación para que la aguja esté en un ángulo de 12° paralelo a los discos de corte en la herramienta rotatoria (cambiando el ángulo de impacto la fuerza requerida para la inserción de la aguja).
   7. Encienda la luz cenital y ajustar su posición observando la aguja bajo aumento, hasta que la luz se refleja fuera de la línea media (longitudinal) de la aguja.
   8. Encienda la herramienta giratoria, después utiliza la etapa de la traducción para avanzar la aguja hacia el interior (diamante) corte disco (figura 2A).
   9. Mantener avanzando la aguja lentamente contra el disco de corte hasta que el disco alcanza aproximadamente la línea media de la aguja (según lo visualizado por la reflexión de la luz de arriba a lo largo de la línea media).
   10. Mueva lentamente la superficie de corte de la aguja desde el interior de la muela sobre la rueda exterior de piedra para terminar la superficie de corte de la aguja con un pulimento más fino (figura 2B).
   11. Retire la aguja del disco de corte.
   12. Con la etapa de rotación vertical, gire la aguja 180°.
   13. Repita los pasos 1.2.9-1.2.10 para cambiar la forma al otro lado de la aguja.
       Nota: La aguja debe tener ahora dos puntas de corte de aproximadamente igual longitud (figura 2 y 2D).
   14. Retire la aguja de la fase de producción.
   15. Limpiar el interior del alesaje con un alambre de metal es ligeramente más pequeño que el diámetro interno de la aguja.
   16. Usando un palo de madera afilado (e.g., partiendo del final del palo de madera pequeño en un aplicador de punta de algodón), elimine las rebabas que pueden estar todavía adheridas a los bordes de la aguja recién formado.
       Nota: Las agujas puede ser electropulido y esterilizado por autoclave si fuera necesario.

2. tejidos de la piel

1. Utilice las agujas cosecha para recoger la piel microcolumns de tejido ex vivo o animales vivos.
2. Para ex vivo piel tejido fino (especialmente de las muestras donde la grasa subcutánea está faltando o fue recortada a), sostenga el tejido de la blanco sobre la abertura de un tubo de centrífuga de 50 mL, o apilar dos piezas de tejido uno encima del otro, para evitar dañar el n eedle consejos por golpes contra superficies duras.
   Nota: Para la cosecha en vivo de animales vivos, se recomienda que la epinefrina y lidocaína local administrado por inyección intradérmica para la analgesia y reducir el sangrado.
3. Montar el aparato de recolección según la cantidad de microcolumns necesarios, como se describe a continuación.
4. Opción de volumen bajo-medio:
   1. Para cosechar pequeñas a medianas cantidades de microcolumns, simplemente llenar una jeringa estándar (10-20 mL jeringas generalmente funcionan bien) con solución salina normal y conéctela a la aguja de recolección.
   2. Completamente Inserte la aguja de recolección en la piel del donante, luego lo retraiga.
   3. Empuje el émbolo de la jeringa descarga la solución salina a través de la aguja de recolección y expulsar la microcolumna que está alojado en el agujero de la aguja.
   4. Para acelerar el proceso de cosechando, repita el paso 2.4.2 3 a 5 veces antes de expulsar el microcolumns paso 2.4.3.
      Nota: Normalmente es conveniente expulsar el microcolumns en un colador de célula estándar para facilitar la posterior colección de microcolumns.
   5. Si las agujas se atascan, aumentar la presión sobre el émbolo para expulsar el tejido pegado y eliminar la obstrucción. Si simplemente aumentando la presión es insuficiente, alesaje de insertar un alambre de metal a través de la abertura de la punta de aguja para limpiar la obstrucción de la aguja.
   6. No microcolumns sumergidos en solución salina o medio hasta su uso para evitar la desecación.
      Nota: Con un operador experimentado, puede utilizarse el método descrito anteriormente para la cosecha microcolumns a un ritmo de aproximadamente 1 microcolumna por segundo.
5. Opción de alto volumen:
   1. Crear un simple dispositivo de succión-asistida que puede ser construido para facilitar la recolección de grandes cantidades de microcolumns.
      Nota: El dispositivo consiste en una recolección aguja, jeringa de 20 mL con boquilla de cierre luer, adaptador aspiración típicamente utilizado para la liposucción (figura 3A) y frasco de aspiración estéril.
   2. Retire el émbolo de la jeringa de 20 mL.
   3. Conectar la jeringa a un adaptador de succión.
   4. Completar el montaje colocando una cosecha aguja a la jeringa (figura 3B).
   5. Utilice un trozo de tubo de aspiración estéril para conectar el adaptador de succión a un recipiente estéril de aspiración. Asegúrese de que el aparato de recolección es conectado a la entrada de cilindro que permite el líquido en el recipiente sin trabas (que puede requerir conexión a un puerto del cartucho que está marcado para la salida en lugar de afluencia).
   6. Conecte el aparato a una fuente de presión negativa.
      Nota: La presión necesaria depende de diámetro de la aguja y longitud, como se describió previamente⁸. Para el aparato descrito en este manuscrito, el sistema de aspiración en cuartos de funcionamiento típico es generalmente suficiente.
   7. Conecte una cosecha aguja a la jeringa.
   8. Cosecha el microcolumns insertando la recolección de la aguja en la piel.
      Nota: El microcolumns estará dibujado en la jeringa de succión, luego lavar en el tambor de succión.
   9. Sumerja intermitentemente la aguja de recolección en un contenedor de solución salina estéril durante el procedimiento de recolección para limpiar el sistema.
      Nota: Este rubor salino facilita el transporte de la microcolumna y asegura que hidratarse. Alternativamente, puede conectarse un adaptador luer MFF a la cerradura de luer de la jeringa y a través de un tubo de conexión, también con una bolsa de solución salina por goteo colgantes.
   10. Tenga a mano un alambre de metal, o más pequeño medidor de aguja, que es ligeramente más pequeña que el diámetro interno de la aguja de recolección. Si la aguja se obstruye, puede borrarse introduciendo el alambre de metal en el orificio de la aguja.
   11. Cuando la cantidad deseada de microcolumns han acumulado en el cilindro, desconecte el dispositivo de succión, luego verter el contenido de la lata de succión hacia fuera a través de un filtro para recoger el microcolumns.
6. Después de la cosecha, aplique un ungüento antibiótico tópico sobre los sitios donantes.
   Nota: Aderezos adicionales generalmente no son necesarios para sitios dispensadores de aceite.

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Resultados

Las agujas de cosecha deben ser capaces de recoger microcolumns del tejido de piel de espesor total con aproximadamente un 80-90% de éxito, y debe contener cada microcolumna epidermis, dermis y algunas grasa subcutánea (figura 4). Si la tasa de éxito de la cosecha es baja, o si resulta difícil insertar una aguja en el tejido, luego una aguja nueva es probable que se necesita. Si la tasa de éxito para la cosecha es consistentemente baja, incluso con aguja...

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Discusión

Los métodos aquí descritos están diseñados para permitir la colección de tejido microcolumns en cantidades suficientes para en vivo grandes estudios con animales, utilizando herramientas de suministros de laboratorio disponibles en el mercado. Este aparato ha sido utilizado previamente en la recolección del tejido de piel humana suprimido^4,9 como cerdos en piel³. Los parámetros específicos descritos son aquellos que fueron...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diamond wheel	Dremel	545
Hypodermic needle (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Other needle sizes could be used, depending on experimental needs
Stone wheel	Dremel	540
Syringe (20mL with luer lock)	Fisher Scientific	22-124-967
Suction adapter	Tulip Medical	PA20BD	Optional, for high volume harvesting
Suction canister	Fisher Scientific	19-898-212	Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use.
Suction tubing	Medline	DYND50216H	Optional, for high volume harvesting