Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

Resumen

Este protocolo describe un método para registrar la actividad eléctrica descendente de la sistema de nervioso central de Drosophila melanogaster para permitir pruebas de agentes farmacológicos, mutaciones genéticas de las proteínas neuronales, conveniente y rentable o el papel de los caminos fisiológicos inexplorados.

Resumen

La mayoría de los insecticidas disponibles actualmente atacar el sistema nervioso y mutaciones genéticas de las proteínas neuronales invertebradas a menudo producen consecuencias perjudiciales, sin embargo, los métodos actuales para el registro de actividad del sistema nervioso de un individuo animal es costoso y laborioso. Esta aspiración preparación del electrodo del sistema nervioso central de larvas tercer estadio de Drosophila melanogaster, es un sistema manejable para las pruebas de los efectos fisiológicos de los agentes neuroactivos, determinar el papel fisiológico de varios nervios caminos hacia la actividad del CNS, así como la influencia de las mutaciones genéticas a la función neuronal. Esta preparación ex vivo requiere sólo moderada disección electrofisiológico experiencia y habilidad generar grabaciones reproducibles de insecto actividad neuronal. Una amplia variedad de moduladores químicos, incluyendo péptidos, entonces puede aplicarse directamente al sistema nervioso en la solución con la solución fisiológica salina para medir la influencia en la actividad del CNS. Genéticas, otras tecnologías, como el sistema de GAL4/UAS, pueden aplicarse independientemente o conjuntamente con los agentes farmacológicos para determinar la función de canales iónicos específicos, transportadores o receptores a artrópodos función del CNS. En este contexto, los ensayos aquí descritos son de gran interés para toxicólogos insecticida insectos fisiólogos y biólogos del desarrollo para que D. melanogaster es un organismo modelo establecido. El objetivo de este protocolo es describir un método electrofisiológico para permitir la medición de la electrogenesis del sistema nervioso central en el insecto modelo, Drosophila melanogaster, que es útil para probar una diversidad de científicos hipótesis.

Introducción

El objetivo general de este enfoque es ayudar a los investigadores a medir rápidamente la electrogenesis del sistema nervioso central (SNC) en el insecto modelo, Drosophila melanogaster. Este método es confiable, rápida y costo-eficiente para llevar a cabo la experimentación fisiológica y toxicológica. El SNC es esencial para la vida y por lo tanto, los caminos fisiológicos críticos para funcionamiento neuronal han sido exploradas extensivamente en un esfuerzo por comprender o modificar la función neural. Caracterización de las vías de señalización dentro del CNS artrópodo ha permitido el descubrimiento de varias clases químicas de insecticidas que interrumpen la función neural invertebrada para inducir mortalidad limitando las consecuencias fuera del objetivo. Así, la capacidad de medir la actividad neuronal de los insectos es de gran interés para el campo de la fisiología y toxicología de insectos ya que el sistema nervioso es el tejido diana de la mayoría de insecticidas desplegados¹. Sin embargo, continuó el crecimiento del conocimiento fundamental y aplicado sobre el sistema nervioso del insecto requiere técnicas neurofisiológicas avanzadas que están limitadas en su viabilidad, puesto que las técnicas actuales de mano de obra y requieren un gasto alto, insecto líneas celulares neuronales son limitadas, y hay acceso limitado a la sinapsis central de mayoría artrópodos. Caracterización de la mayoría de las proteínas neuronal insectos requiere actualmente, el objetivo de ser clonado y expresado heterologously para fármacos posteriores y las grabaciones electrofisiológicas, como fue descrito por canales de potasio rectificador hacia adentro insectos² , receptor de rianodina insectos³, mosquito sensible a voltaje K⁺ canales⁴y otros. Para mitigar la necesidad de expresión heteróloga y el potencial de expresión funcional baja, Bloomquist y colegas para inducir un fenotipo neuronal en cultivan células de Spodoptera frugiperda (Sf21) como un método novedoso para insecticida descubrimiento^5,6. Estos métodos proporcionan un enfoque válido para el desarrollo de la nueva química, sin embargo, a menudo crean un cuello de botella insalvable para la caracterización de los agentes farmacológicos, identificar mecanismos de resistencia a los insecticidas y caracterización de los principios fisiológicos fundamentales. Aquí, describimos un método ex vivo que permite la grabación de la actividad eléctrica de un insecto de modelo que tiene genética maleable^7,8,9 y los patrones de la conocida expresión de nervios complejos^10,11,12 para permitir la caracterización de mecanismos de resistencia a nivel del nervio, el modo de acción de fármacos recientemente desarrollados y otros estudios toxicológicos.

La mosca de la fruta D. melanogaster es un organismo modelo común para la definición de insecto sistemas neuronales o mecanismo insecticida de acción y se ha establecido como un organismo modelo muy adecuado para el estudio de la toxicología¹³, farmacológicas^{14 ,15}, neurofisiológicos¹⁶y patofisiológicos^17,18,19,20 procesos de vertebrados. D.melanogaster es un insectos holometábolos que realiza metamorfosis completa, incluyendo una etapa larvaria y de pupa antes de llegar a la etapa adulta reproductiva. Durante el proceso de desarrollo, el sistema nervioso sufre importantes remodelaciones en diferentes estadios, pero el larvas SNC será el tema central de esta metodología. El CNS larvas completamente desarrollado es anatómico simple con segmentos torácicos y abdominales que se fusionan y forman el ganglio ventral, que representa una matriz de neuromeric repetida y casi idénticas unidades^21,22. Nervios motores descendentes se originan desde el extremo caudal de los ganglios subesophageal y descienden para inervar los músculos de la pared del cuerpo y órganos viscerales de la larva. La figura 1 describe la anatomía macroscópica de la larvas Drosophila CNS.

La barrera Drosophila blood - brain (BBB) se convierte en el final de la embriogénesis y está formada por células gliales (SPG) de subperineurial²¹. Las células SPG forman numerosos procesos como filopodios que extensión para establecer una hoja contigua, muy plana, como endoteliales que cubre el entero Drosophila CNS²³. La Drosophila BBB tiene similitudes con el BBB vertebrado, que incluye preservar la homeostasis del microambiente neuronal controlando la entrada de nutrientes y xenobióticos en la CNS²¹. Esto es un prerrequisito para confiable transmisión neural y la función, sin embargo, la protección del SNC por el BBB restringe la penetración de drogas sintéticas, la mayoría de péptidos y otros xenobióticos^24,25, que presenta potencial problemas cuando caracterizan potencias de moduladores de moléculas pequeñas. El método utiliza un simple corte transversal para interrumpir esta barrera y proporcionar acceso farmacológica a la sinapsis central.
La mayor fortaleza de la metodología descrita es la simplicidad, la reproducibilidad y la relativamente alta-capacidad inherente a este sistema. El protocolo es relativamente fácil de dominar, el programa de instalación requiere poco espacio, y sólo una entrada financiera inicial es necesario que se reduce a reactivos y consumibles. Además, el método descrito es completamente modificable para registrar la actividad nerviosa descendente central de la mosca doméstica, Musca domestica²⁶.

Protocolo

1. equipos y materiales

1. Preparar los componentes necesarios (listados en la Tabla de materiales) de la plataforma de electrofisiología para realizar grabaciones de electrodo de succión de la Drosophila del CNS.
   Nota: Antes de la experimentación, es necesario construir cámaras para la disección de la Drosophila CNS y ser utilizado para bañarse los ganglios en solución salina durante las grabaciones. Un esquema paso a paso de construcción de la cámara se proporciona a continuación.
2. Prepare la cámara larval.
   1. Derretir la cera negra usando una placa caliente.
   2. Vierta 2 mL de cera derretida en una cámara que tiene un volumen máximo de 2-2.5 mL.
   3. Deje que la cera se enfríe y endurezca por aproximadamente 2 h.
   4. Use una navaja para tallar un agujero en la cera endurecida que tendrá un volumen de 500 μl, que tiene una superficie de aproximadamente 0,5 cm² y una profundidad de aproximadamente 0,25 cm.

2. equipo y configuración de Software

Nota: La configuración de la grabación extracelular se describe brevemente a continuación.

1. Preparar equipo para disección y grabación.
   1. Colocar la preparación de tejidos, microscopio, electrodo de succión, micromanipuladores, fuente de luz dentro de la jaula de Faraday para reducir el ruido y eliminar campos eléctricos extraños (figura 2).
   2. Conectar (preferentemente soldadura) tierra y alambres positivos sobre blindado clipes que conectará al titular de la bañera y el microelectrodo, respectivamente.
      Nota: Los cables soldados y expuestos pueden ser cubiertos con papel de aluminio para reducir el ruido.
   3. Conecte los cables positivo a la entrada 1 del amplificador diferencial AC/DC. y tierra
   4. Conectar el sistema de adquisición de datos del amplificador diferencial AC/DC al conectar un cable de Neill-Concelman de bayoneta (BNC) de entrada 1 del sistema de adquisición de datos a la salida del canal 1 del amplificador.
      Nota: Se recomienda incorporar un eliminador de ruido de 50/60 Hz entre el software de adquisición de datos y el amplificador. Es necesario el uso de un conector T BNC.
   5. Si lo desea, incluir a un monitor de audio en la configuración mediante la conexión de entrada 1 del monitor audio a la entrada 1 del software de adquisición de datos.
   6. Llene la jeringa de 10 mL con solución salina y conéctelo al puerto de presión de la pinza portaelectrodos.
      Nota: Asegúrese de que no existen burbujas de aire entre la jeringa, el precipitado de Ag/AgCl y la abertura de electrodo.
2. Preparar el software para grabación y disección.
   Nota: El esquema de métodos para la instalación del software se basa en el software de adquisición y análisis mencionado en la Tabla de materiales que digitalizar la salida eléctrica y convertir los datos para la frecuencia del punto. Sin embargo, se puede utilizar otro software y múltiples conversiones de grabación pueden ser utilizadas.
   1. Abra el software de adquisición y análisis.
   2. Haga clic en "configuración" de la barra de herramientas principal y seleccione "configuración del canal," que se abrirá un cuadro de diálogo.
   3. Reducir el número de canales total a tres.
   4. Para el canal 1, seleccione un rango de 100 mV.
   5. Canal 2, haga clic en la pestaña "cálculo" que se abrirá un menú desplegable. Seleccione "mediciones cíclicas", que se abrirán otro cuadro de diálogo.
   6. Seleccione el canal 1 y la fuente. En la medida del menú desplegable, seleccione punto de unidad en eventos. Finalmente, en el área de configuración de la detección, en el menú desplegable seleccione simple umbral.
   7. Para convertir la actividad eléctrica en una parcela de frecuencia expresada en hertz, el canal 3^rd debe configurarse en modo aritmético: en la ventana de entrada, escriba en "1000*smoothsec(ch2,2)". Luego seleccione como las unidades desplegable hertz de menú.
      Nota: Grabaciones exitosas se pueden realizar con múltiples configuraciones de grabación diferentes, pero "Punto de unidad en eventos y umbral simple" es probablemente el más fácil, ya que permite para el ajuste del umbral por encima de la actividad de fondo para cada individuo grabación. Grabaciones bajo el ajuste de "Custom-Source Input" aumentan la reproducibilidad de los datos, asumiendo que la actividad de fondo no es diferente entre grabaciones.
   8. Cierre los cuadros de diálogo para volver a la pantalla principal. El eje y debe expresarse en Hz y el eje x en el tiempo.

3. disecar y preparan las larvas Drosophila CNS

Nota: Métodos para la disección del CNS larval se ilustran claramente en Hafer y Schedl²⁷, pero estos métodos previamente publicados reducen la longitud de las neuronas descendentes que son importantes para medir la frecuencia del pico. Aquí, se describe un método adicional para suprimir el SNC larvas que mantiene durante mucho tiempo, las neuronas descendentes intactas.

1. Preparación de solución salina.
   1. Preparar la disección y la solución salina de grabación a los siguientes en mM²⁸: 157 NaCl, 3 KCI, 2 CaCl₂, 4 ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES); valorar el pH 7.25.
2. Diseccionar las larvas Drosophila CNS.
   1. Identificar y extraer una errante de tercer estadio Drosophila melanogaster el frasco de cultivo y el lugar en 200 μL de solución salina (Figura 3A).
   2. Sujete los ganchos de la boca con un par de Pinzas finas y agarre el abdomen de la manzana de la discordia con un segundo par de pinzas (figura 3B).
      Nota: No aplique demasiada presión en el abdomen ya que puede producir desgarro de la delgada capa cuticular de la manzana de la discordia.
   3. Tire suavemente de los ganchos de la boca y abdomen en diferentes direcciones para separar el extremo caudal de la manzana de la discordia de la región de cabeza y exponer las vísceras de la manzana de la discordia (figura 3).
      Nota: El SNC se va entrelazado con la tráquea y el tubo digestivo. No corte el SNC de cualquier tejido para evitar el corte de los nervios periféricos descendentes.
   4. Tease del CNS en el tracto digestivo y de la tráquea con el fórceps (figura 3D).
   5. Si es necesario, interrumpir la barrera hematoencefálica por manualmente transecting el SNC posterior a los lóbulos cerebrales con las tijeras de Vannas primavera.
      Nota: Esto debe hacerse en base a las propiedades fisicoquímicas de la sustancia que se utiliza. La línea roja en la Figura 4A es el punto de corte transversal sugerida y el CNS seccionado con intactos descendentes troncos de nervio periférico que se muestra en la Figura 4B. El CNS seccionado está listo para experimentar después de la terminación del paso 3.2.5.

4. extracelular grabación de Drosophila del SNC.

1. Preparar el SNC para la grabación.
   1. Tire de un electrodo de pipeta de vidrio de Capillares de vidrio de borosilicato a una resistencia de 5-15 mΩ.
   2. Inserte el SNC seccionado en la cámara de cera que contiene 200 μL de solución salina. Sujete un perno insectos sin recubrimiento con la pinza de soldar al cable de tierra e Inserte el pasador en la solución salina para completar el circuito.
   3. Con los micromanipuladores, orientar el electrodo en el extremo caudal del SNC seccionado. Eliminar registro de ruido de fondo mediante el ajuste del umbral en el software de adquisición y análisis antes de ponerse en contacto con los troncos del nervio periférico.
   4. Dibujar cualquier convenientes nervios periféricos en el electrodo de succión aplicando ligera presión negativa en la jeringa.
      Nota: La referencia de frecuencia de la leña está correlacionada con el número de neuronas dibujado en el electrodo donde las neuronas más a menudo dan como resultado aumento de la resistencia del electrodo.
2. Comenzar a grabar extracelular del sistema nervioso central descendente de actividad del nervio.
   1. Iniciar la grabación en el software de adquisición de datos y seguimiento de la referencia de frecuencia de la leña. Permitir que la tasa de disparo equilibre durante 5 minutos antes de recoger leña tarifa de datos de línea de base.
   2. Desechar la preparación y grabación si el patrón de disparo de tratamiento de control no es un patrón de rotura similar al mostrado en la figura 5A.
      Nota: Patrón alterado de leña sugiere actividad anormal o inestable del generador central del patrón, que puede alterar la función neural.
   3. Después de 5 min, añadir 200 μL de solución salina + vehículo para llevar el volumen total de la cámara a 400 μL para iniciar control de grabación de las tarifas de leña.
   4. Después de línea de base ha sido establecida (3-5 minutos), retirar 200 μL de solución salina y añada 200 μL del agente experimental solubilizado en una solución salina.
      Nota: Dimetilsulfóxido (DMSO) es el solvente recomendado para compuestos lipofílicos y no debe exceder 0,1% v/v.
   5. Aplicar concentraciones de la droga de manera serial (baja a altas concentraciones) y grabar cada concentración para un selecto periodo de tiempo (determinado por el investigador basado en las propiedades químicas de la droga²⁹). Este punto del tiempo de uso de la droga en el software de adquisición y análisis de la etiqueta mediante la inclusión de un comentario que incluye el fármaco y la concentración final.
      Nota: Actividad del CNS de la leña se reducirá en aproximadamente un 10-20% después de 30-50 min después de la disección y por lo tanto, deben realizarse controles sin tratamiento adecuados y tratamientos farmacológicos no deben exceder este período de tiempo.
3. Analizar los datos.
   Nota: Se pueden realizar múltiples análisis en los datos recogidos, como cambios en el potencial de acción ráfagas²⁹, espiga onda amplitud y curso temporal y determinación de frecuencias de media espiga Después de drogas tratamiento^{26,30 , 31 , 32}. el más común es determinar la influencia de una droga tiene que las frecuencias de espiga media durante un período especificado de tiempo, que se describe a continuación.
   1. Tabular las frecuencias media espiga seleccionando toda la región de interés (es decir, el tratamiento farmacológico de período de tiempo) y determinar frecuencias de media espiga automáticamente a través del "registro" situado en la barra de herramientas principal de la adquisición y análisis software.
   2. Determinar la frecuencia de medio punto del SNC después de tratamiento farmacológico a la frecuencia media punto de control del vehículo (línea de base). Calcular el cambio porcentual de la tasa de disparo después de tratamiento farmacológico por la fórmula: (tratamiento frecuencia de frecuencia/referencia) x 100.
   3. Utilizar la leña de frecuencias o por ciento de media espiga de control para cada concentración para construir una curva de respuesta de concentración con estándar graphing software.
   4. Realizar análisis estadístico (por ejemplo, desapareado t-test) para determinar significación entre puntos de tiempo, concentraciones o tratamientos farmacológicos.
      Nota: Hay dos métodos principales para la generación y análisis de curvas de concentración-respuesta. El primer método es una concentración por preparación. Aquí, se normaliza la tasa pico de la concentración única a tasa de punto inicial para cada preparación. Los beneficios se reducen funcionamiento abajo de la preparación debido a acorta el tiempo de grabación, mientras que las trampas están aumentadas disección tiempo porque este método consistirá en 5-7 preparaciones individuales de CNS por concentración, y barras de error más grande en los datos promedio conjunto. El segundo método es múltiples concentraciones por preparación. Aquí, la tasa de alza para cada una de las concentraciones de 3-5 se normalizan a la misma tasa de punto de referencia. Las ventajas son menos tiempo de disección y menos variabilidad entre réplicas de concentraciones de la droga, mientras que las trampas son el requisito de un impacto de drogas y desconocido de acción rápida de tratamientos anteriores de concentración de droga en tratamientos químicos posteriores.

Resultados

La actividad espontánea de los nervios periféricos descendentes del Drosophila del sistema nervioso central puede grabarse utilizando electrodos de succión extracelulares con reproducibilidad consistente. La actividad espontánea de la suprimida y seccionado Drosophila CNS produce un patrón cíclico de explosión con 1-2 s de disparo con aproximadamente 1 s de cerca la actividad de reposo. Por ejemplo, el SNC está quieto (1-2 Hz) de 0.5-1 s, seguido de una explosió...

Discusión

Los datos facilitados en el vídeo asociado y texto han dado pasos para registrar la actividad y la espiga alta frecuencia de Drosophila CNS ex vivo. La eficacia de la disección es el aspecto más crítico del método ya corto o pocas neuronas descendentes reducirá la base disparando ritmo que dan lugar a grandes variaciones entre repeticiones. Sin embargo, una vez que domina la técnica de disección, los datos recogidos con este ensayo son altamente reproducibles y modificable para una amplia varied...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster (strain OR)	Bloomington Drosophila Stock Center	2376
Vibration isolation table	Kinetic Systems	9200 series
Faraday Cage	Kinetic Systems	N/A
Dissecting Microscope on a Boom	Nikon	SMZ800N	Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier	ADInstruments	AM3000H	The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor	ADInstruments	AM3300
Hum Bug Noise Eliminator	A-M Systems	726300
Data Acquisition System (PowerLab)	ADInstruments	PL3504	Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software	ADInstruments	N/A - Online Download
Fiber Optic Lights	Edmund Optics	89-740	Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator	World Precision Instruments	M325
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH715	Different models are acceptable
BNC cables	World Precision Instruments	multiple based on size
Glass Capillaries	World Precision Instruments	PG52151-4
Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-1000	Also can use Narashige PC-100
Black Wax	Carolina Biological Supply	974228
Non-coated insect pins, size #2	Bioquip	1208S2
Fince Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03