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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Résumé

La majorité des insecticides disponibles actuellement cible le système nerveux et des mutations génétiques des protéines neuronales invertébrés donnent souvent des conséquences délétères, mais les méthodes actuelles pour l’enregistrement de l’activité du système nerveux d’un individu l’animal est coûteuse et laborieuse. Cette aspiration électrode préparation du troisième stade larvaire central nerveux système de Drosophila melanogaster, est un système souple pour tester les effets physiologiques des agents de neuroactive, déterminer le rôle physiologique des différents neurones voies d’activité de la CNS, ainsi que l’influence de mutations génétiques à fonction neurale. Cette préparation ex vivo nécessite seulement modérée disséquant les compétences et l’expertise électrophysiologique générer des enregistrements reproductibles de l’activité neuronale insecte. Une grande variété de modulateurs chimiques, y compris les peptides, puis peut être appliquée que directement sur le système nerveux en solution avec du sérum physiologique pour mesurer l’influence sur l’activité de la CNS. Technologies plus, génétiques, comme le système de GAL4/UAS, peuvent être appliquées indépendamment ou en collaboration avec des agents pharmacologiques afin de déterminer le rôle des canaux ioniques spécifiques, transporteurs ou récepteurs d’arthropode fonction CNS. Dans ce contexte, les essais décrits dans les présentes sont d’un intérêt majeur pour les toxicologues insecticide insectes physiologistes et des biologistes du développement pour laquelle d. melanogaster est un organisme modèle établi. Le but du présent protocole est de décrire une méthode électrophysiologique pour permettre la mesure de l’électrogénèse du système nerveux central chez l’insecte modèle, Drosophila melanogaster, qui est utile pour tester une diversité des scientifiques hypothèses.

Introduction

L’objectif global de cette approche est de permettre aux chercheurs de mesurer rapidement l’électrogénèse du système nerveux central (SNC) chez l’insecte modèle, Drosophila melanogaster. Cette méthode est fiable, rapide et rentable d’effectuer l’expérimentation physiologique et toxicologique. Le CNS est essentiel pour la vie et par conséquent, les voies physiologiques essentiels pour le bon fonctionnement neuronal ont été explorées intensivement dans un effort pour comprendre ou modifier la fonction neurale. Caractérisation des voies de signalisation dans le système nerveux central arthropod a permis la découverte de plusieurs classes chimiques des insecticides qui perturbent la fonction neurale d’invertébrés pour induire la mortalité tout en limitant les conséquences hors cible. Ainsi, la capacité de mesurer l’activité neurale des insectes est d’un intérêt majeur pour le domaine de la physiologie et toxicologie insecte étant donné que le système nerveux est le tissu de cible de la plupart des insecticides déployé1. Pourtant, suite à une croissance des connaissances fondamentales et appliquées sur l’insectes du système nerveux nécessite des techniques neurophysiologiques avancées qui sont limitées à une faisabilité, étant donné que les techniques actuelles sont demande beaucoup de travail et nécessitent une grande dépense, insecte lignées de cellules neurales sont limitées, et/ou il y a un accès limité aux synapses centrales de la plupart des arthropodes. Caractérisation de la plupart des protéines neuronales insectes exige actuellement, la cible ne la découverte de médicaments suivantes clonés et façon hétérologue expresse pour et enregistrements électrophysiologiques, qu’a été décrit pour les canaux potassiques de rectification entrante insectes2 , récepteur de la ryanodine insectes3, moustiques sensibles au voltage K+ canaux4et d’autres. Pour atténuer le besoin d’expression hétérologue et le potentiel d’expression fonctionnelle faible, Bloomquist et collègues visant à induire un phénotype neuronal dans Spodoptera frugiperda (Sf21) cellules cultivées comme nouvelle méthode pour insecticide découverte5,6. Ces méthodes fournissent une approche valable pour le développement de la chimie nouvelle, mais ils créent souvent un goulot d’étranglement insurmontable pour la caractérisation des agents pharmacologiques, identifier des mécanismes de résistance aux insecticides et caractérisation des principes physiologiques fondamentaux. Nous décrivons ici une méthode ex vivo qui permet l’enregistrement de l’activité électrique d’un insecte de modèle qui a malléable génétique7,8,9 et des modèles d’expressions connus de neurones complexes de10,11,12 pour permettre la caractérisation des mécanismes de résistance au niveau du nerf, le mode d’action des nouveaux médicaments et autres études toxicologiques.

La mouche à fruit, d. melanogaster, est un organisme modèle commun pour la définition des systèmes neuronaux insectes ou mécanisme insecticide d’action et a été établi comme un organisme modèle bien adapté pour l’étude toxicologique13, pharmacologiques14 ,15, neurophysiologiques16et physiopathologiques17,18,19,20 processus de vertébrés. D.melanogaster est un insecte holométaboles qui effectue la métamorphose complète, y compris un stade larvaire et nymphal avant d’atteindre le stade adulte reproducteur. Tout au long du processus de développement, le système nerveux subit un remodelage important à différents stades de vie, mais le CNS larvaire fera l’objet de cette méthodologie. La décélération CNS larvaire est anatomiquement simple avec des segments thoraciques et abdominales qui sont fusionnés et forment le ganglion ventral, qui représente un tableau de neuromeric répétées et presque identiques unités21,22. Descendant des nerfs moteurs proviennent de l’extrémité caudale des ganglions sous-oesophagien et descendre pour innerver les muscles de la paroi du corps et des organes viscéraux des larves. La figure 1 décrit l’anatomie générale de la larves de drosophile CNS.

La barrière Drosophila sang - encéphalique (BHE) se développe à la fin de l’embryogenèse et est formée par la subperineurial des cellules gliales (SPG)21. Les cellules SPG forment de nombreux processus filopodes-like qui se propagent à établir une feuille de contigus, très plate, endothéliales semblable qui couvre l’ensemble de Drosophila CNS23. La drosophile BBB a des similitudes avec le vertébrés BBB, qui comprend à préserver l’homéostasie du microenvironnement neuronaux en contrôlant l’entrée des nutriments et des xénobiotiques dans le CNS21. C’est une condition sine qua non pour la transmission neuronale fiable et fonction, mais la protection du SNC par le BBB restreint la perméation de drogues de synthèse, la plupart des peptides et autres xénobiotiques24,25, qui introduit le potentiel problèmes lors de caractériser les puissances de modulateurs de petites molécules. La méthode utilise une transection simple pour perturber cette barrière prêt pharmacologique et y accéder et les synapses centrales.
La plus grande force de la méthodologie décrite est la simplicité, la reproductibilité et relativement haut débit capacité inhérente à ce système. Le protocole est relativement facile à maîtriser, l’installation requiert peu d’espace, et seulement un apport financier initial est nécessaire qui est réduite à réactifs et consommables. En outre, la méthode décrite est complètement modifiable pour enregistrer l’activité centrale de nerf décroissant de la mouche domestique, Musca domestica26.

Protocole

1. matériel et matériaux

  1. Préparer les composants requis (répertoriés dans la Table des matières) de la plate-forme d’électrophysiologie pour effectuer des enregistrements d’électrode d’aspiration de la drosophile CNS.
    Remarque : Avant expérimentation, il est nécessaire de construire des chambres pour la dissection de la drosophile CNS et à utiliser pour les ganglions dans une solution saline de baignade pendant les enregistrements. Un plan étape par étape de la construction de la chambre est fourni ci-dessous.
  2. Préparer la chambre larvaire.
    1. Faire fondre la cire noire à l’aide d’une plaque chauffante.
    2. Verser 2 mL de cire fondue dans une chambre qui a un volume maximum de 2 à 2,5 mL.
    3. Laisser la cire refroidir et durcir pendant environ 2 h.
    4. Utilisez une lame de rasoir pour creuser un trou avec de la cire durcie qui contiendra un volume de 500 µL, qui a une superficie d’environ 0,5 cm2 et une profondeur d’environ 0,25 cm.

2. matériel et Configuration du logiciel

Remarque : La configuration de l’enregistrement extracellulaire est brièvement décrite ci-dessous.

  1. Préparer le matériel pour la dissection et l’enregistrement.
    1. Placez la préparation du tissu, microscope, électrode d’aspiration micromanipulateurs, source de lumière à l’intérieur de la cage de Faraday pour réduire le bruit et d’éliminer les champs électriques extérieures (Figure 2).
    2. Se connecter (préférence soudure) au sol et les fils positifs sur blindé pinces crocodiles qui seront reliés à la titulaire de la baignoire et la microélectrode, respectivement.
      NOTE : Fils soudés et exposées peuvent être recouvert de papier d’aluminium pour réduire le bruit.
    3. Relier le sol et les fils de positifs à l’entrée 1 de l’amplificateur différentiel AC/DC.
    4. Branchez le système d’acquisition de données à l’amplificateur différentiel AC/DC en connectant un câble baïonnette Neill-Concelman (BNC) de d’entrée 1 sur le système d’acquisition de données à la sortie du canal 1 de l’amplificateur.
      Remarque : Il est recommandé d’incorporer un éliminateur de bruit 50/60 Hz entre l’amplificateur et le logiciel d’acquisition de données. L’utilisation d’un connecteur en T BNC est nécessaire.
    5. Si vous le souhaitez, inclure un moniteur audio dans le setup en connectant l’entrée 1 du moniteur audio à l’entrée 1 sur le logiciel d’acquisition de données.
    6. Remplir la seringue de 10 mL avec du sérum physiologique et branchez-le sur le port de pression du porte-électrode.
      Remarque : Veiller à ce qu’aucune bulle d’air n’existe entre la seringue, le culot de Ag/AgCl et l’ouverture de l’électrode.
  2. Préparer le logiciel pour l’enregistrement et de dissection.
    Remarque : Les grandes lignes des méthodes pour la configuration du logiciel sont basé sur le logiciel d’acquisition/analyse énuméré dans la Table des matières qui va numériser la sortie électrique brute et convertir les données pour doper la fréquence. Toutefois, autres logiciels peuvent être utilisés et plusieurs conversions d’enregistrement peuvent être utilisées.
    1. Ouvrez le logiciel d’acquisition/analyse.
    2. Cliquez sur « setup » de la barre d’outils principale et sélectionnez « Paramètres du canal » qui ouvriront une boîte de dialogue.
    3. Réduire le nombre de canaux total à trois.
    4. Pour le canal 1, sélectionnez une plage de 100 mV.
    5. Pour le canal 2, cliquez sur l’onglet « calcul » qui va ouvrir un menu déroulant. Sélectionnez « mesures cyclique, » qui ouvriront une seconde boîte de dialogue.
    6. Sélectionnez le canal 1 comme source. Puis sur la mesure de menu déroulant, sélectionnez spike unité lors d’événements. Enfin, dans la zone paramètres de détection, dans le menu déroulant sélectionnez seuil simple.
    7. Pour convertir l’activité électrique dans une parcelle de taux exprimée en hertz, le canal 3rd doit être défini en mode arithmétique : dans la fenêtre de saisie, tapez « 1000*smoothsec(ch2,2) ». Sélectionnez puis les unités déroulant hertz de menu.
      NOTE : Les bons enregistrements peuvent être effectuées avec plusieurs différentes configurations d’enregistrement différentes, mais « Unité spike lors d’événements et de seuil simple » est probablement le plus facile, car il permet un ajustement du seuil au-dessus de l’activité d’arrière-plan pour chaque individu enregistrement. Enregistrements avec le paramètre de « Custom-Source entrée » augmentent la reproductibilité des données en supposant que l’activité d’arrière-plan n’est pas différente entre les enregistrements.
    8. Fermez les boîtes de dialogue pour revenir à l’écran principal. L’axe des ordonnées doivent être exprimée en Hz et l’axe des abscisses dans le temps.

3. décortiquer et préparer les larves Drosophila CNS

NOTE : Méthodes pour la dissection de CNS larvaire sont clairement illustrés dans Hafer et Schedl27, mais ces méthodes publiées antérieurement réduisent la longueur des neurones descendantes qui sont importants pour mesurer la fréquence de l’épi. Ici, une méthode est décrite pour exciser les CNS larvaire qui maintient depuis longtemps, les neurones intacts décroissant.

  1. Préparation de solution saline.
    1. Préparer la dissection et l’enregistrement solution saline à la suivante en mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, acide 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 4 (HEPES) ; titrer un pH à 7.25.
  2. Disséquer la larves de drosophile CNS.
    1. Identifier et extraire une errance de troisième stade Drosophila melanogaster du flacon de culture et de la place dans 200 µL de solution saline (Figure 3 a).
    2. Saisir les crochets de la bouche avec une paire de pinces fines et saisir l’abdomen de la mouche avec une deuxième paire de pinces (Figure 3 b).
      Remarque : Ne pas appliquer trop de pression sur l’abdomen car cela pourrait provoquer dans le déchirement de la couche cuticulaire de la mouche.
    3. Tirer doucement sur les crochets de la bouche et de l’abdomen dans des directions différentes pour séparer l’extrémité caudale de la mouche de la région céphalique et exposer les viscères de la mouche (Figure 3).
      Remarque : Le système nerveux central va être entrelacé avec la trachée et le tube digestif. Ne pas couper le CNS loin de n’importe quel tissu pour éviter de couper les nerfs périphériques décroissant.
    4. Taquiner la CNS sur le tube digestif et de la trachée avec une pince (Figure 3D).
    5. Si nécessaire, perturber la barrière hémato encéphalique en sectionnant manuellement le système nerveux central postérieur aux lobes cérébraux avec des ciseaux de Vannas printemps.
      Remarque : Cela devrait être fait basé sur les propriétés physico-chimiques de la substance chimique utilisée. La ligne rouge dans la Figure 4 a est le point de transection suggérée et le CNS transfectées avec intacts troncs nerveux périphériques décroissant illustré à la Figure 4 b. Le CNS sectionnée est prêt pour l’expérimentation à l’issue de l’étape 3.2.5.

4. extracellulaire enregistrement de Drosophila CNS.

  1. Préparer le système nerveux central pour l’enregistrement.
    1. Tirez sur une électrode de pipette de verre de capillaires en verre borosilicate à une résistance de 5-15 mΩ.
    2. Insérez le CNS sectionnée dans la chambre de cire qui contient 200 µL de solution saline. Fixer une tige d’insectes non couchée avec la pince crocodile soudée au fil de terre et insérez la tige dans la solution saline pour compléter le circuit.
    3. À l’aide des micromanipulateurs, orienter l’électrode à l’extrémité caudale du SNC sectionnée. Éliminer les enregistrement des bruits de fond en ajustant le niveau de seuil dans le logiciel d’acquisition/analyse avant de communiquer avec les troncs nerveux périphériques.
    4. Dessiner des nerfs périphériques commodes dans l’électrode d’aspiration en exerçant une légère pression négative sur la seringue.
      Remarque : La ligne de base fréquence de tir est en corrélation avec le nombre de neurones aspiré par l’électrode où neurones plus souvent entraîner une résistance accrue de l’électrode.
  2. Commencer l’enregistrement extracellulaire du CNS descendre l’activité nerveuse.
    1. Démarrer l’enregistrement sur le logiciel d’acquisition de données et de surveiller la ligne de base fréquence de tir. Laisser le taux de décharge s’équilibrer pendant 5 min avant de prélever la base de données de vitesse de tir.
    2. Jetez la préparation et l’enregistrement si le modèle de mise à feu du traitement de la commande n’est pas un motif de rupture similaire à celle illustrée à la Figure 5 a.
      NOTE : Modèle modifié de mise à feu suggère une activité anormale ou instable du générateur central, ce qui peut altérer la fonction neurale.
    3. Après 5 min, ajouter 200 µL de solution saline + véhicule pour porter le volume total de la chambre à 400 µL pour commencer l’enregistrement contrôle taux de combustion.
    4. Après que la ligne de base a été établie (3-5 min), retirer 200 µL de solution saline et ajouter 200 µL de l’agent expérimental solubilisée dans une solution saline.
      Remarque : Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est le solvant recommandé pour les composés lipophiles et ne doit pas dépasser 0,1 % v/v.
    5. Appliquer des concentrations du médicament dans une manière serial (faible à des concentrations élevées) et enregistrer chaque concentration pendant un certains laps de temps (déterminé par le chercheur basé sur les propriétés chimiques des drogues29). L’étiquette de ce moment de la demande de drogue dans le logiciel d’acquisition/analyse en incluant un commentaire qui inclut le médicament et la concentration finale.
      Remarque : L’activité du SNC de tir diminuera d’environ 10-20 % après 30-50 min après la dissection donc, témoins non traités appropriés doivent être effectués et les traitements médicamenteux ne doivent pas dépasser ce délai.
  3. Analyser les données.
    Remarque : Plusieurs analyses peuvent être effectuées sur les données recueillies, comme des changements de potentiel d’action rafales29, amplitude d’onde spike et évolution temporelle et déterminer les fréquences moyennes de spike après traitement de drogue26,30 , 31 , 32. la plus courante consiste à déterminer l’influence d’une drogue a les fréquences de pointe moyenne sur une période déterminée de temps, ce qui est décrit ci-dessous.
    1. Tabuler pointe moyenne fréquences en sélectionnant l’ensemble de la région d’intérêt (c.-à-d., le traitement de la toxicomanie laps de temps) et déterminer pointe moyenne fréquences automatique par le biais de la « Datapad » situé sur la barre d’outils principale de l’acquisition/analyse logiciel.
    2. Déterminer la fréquence de pointe moyenne du CNS après traitement de la toxicomanie à la fréquence de pointe moyenne du contrôle véhicule (de base). Calculer la variation en pourcentage du taux de combustion après traitement de la toxicomanie par la formule suivante : (fréquence de fréquence/base traitée) × 100.
    3. Le tir de pointe moyenne fréquences ou pour cent de contrôle pour chaque concentration permet de construire une courbe de réponse de concentration avec la norme graphique logiciel.
    4. Effectuer une analyse statistique (p. ex., non appariés t-test) pour déterminer l’importance entre les points dans le temps, les concentrations ou les traitements médicamenteux.
      Remarque : Il existe deux principales méthodes pour générer et analyser les courbes concentration-réponse. La première méthode est une concentration par préparation individuelle. Ici, le taux de l’épi de la concentration est normalisé au taux de spike de base pour chaque préparation. Les prestations sont réduites couler la préparation due à raccourcie la durée d’enregistrement, tandis que les pièges sont augmentés dissection temps parce que cette méthode sera composé de 5-7 préparations individuelles de CNS par concentration, et erreur plus gros bars sur les données moyennes ensemble. La deuxième méthode est plusieurs concentrations par préparation individuelle. Ici, le taux de spike pour chacun des 3-5 concentrations sont normalisées pour le même taux de référence spike. Les avantages sont moins temps de dissection et moins de variabilité entre réplique pour les concentrations de médicament, tandis que les pièges sont l’exigence d’un effet de drogue et inconnu à action rapide de précédents traitements de concentration sur les traitements chimiques ultérieures.

Résultats

L’activité spontanée des nerfs périphériques décroissant découlant de la drosophile du système nerveux central peut être enregistrée en utilisant des électrodes d’aspiration extracellulaires avec une reproductibilité cohérente. L’activité spontanée de l’excisée et percement Drosophila CNS produit un modèle cyclique d’éclatement avec 1-2 s de tir avec environ 1 s de près l’activité quiescente. Par exemple, le système nerveux central se trou...

Discussion

Les détails fournis dans la vidéo associée et texte ont fourni des étapes clés afin d’enregistrer l’activité et l’épi s’acquitter de fréquence de la drosophile CNS ex vivo. L’efficacité de la dissection est l’aspect le plus important de la méthode parce que peu de neurones décroissant ou court réduira la taux qui se traduira par grands écarts entre les répétitions de combustion de base. Cependant, une fois que la technique de dissection a été maîtrisée, les données recuei...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Mme Rui Chen pour la dissection et les images de la drosophile CNS illustrés sur les figures.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Drosophila melanogaster (strain OR)Bloomington Drosophila Stock Center2376
Vibration isolation tableKinetic Systems9200 series
Faraday CageKinetic SystemsN/A
Dissecting Microscope on a BoomNikonSMZ800NMultiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifierADInstrumentsAM3000HThe model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitorADInstrumentsAM3300
Hum Bug Noise EliminatorA-M Systems726300
Data Acquisition System (PowerLab)ADInstrumentsPL3504Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro SoftwareADInstrumentsN/A - Online Download
Fiber Optic LightsEdmund Optics89-740Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM325
Microelectrode HolderWorld Precision InstrumentsMEH715Different models are acceptable
BNC cablesWorld Precision Instrumentsmultiple based on size
Glass CapillariesWorld Precision InstrumentsPG52151-4
Microelectrode PullerSutter InstrumentsP-1000Also can use Narashige PC-100
Black WaxCarolina Biological Supply974228
Non-coated insect pins, size #2Bioquip1208S2
Fince ForcepsFine Science Tools11254-20
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-03

Références

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