Técnicas de biopsia de glándula mamaria bovina

Resumen

Este artículo presenta una biopsia de glándula mamaria bovina utilizando herramientas de biopsia core y la aguja. Tejido recolectado puede utilizarse para el cultivo celular o para evaluar la fisiología mamaria y metabolismo incluyendo la expresión génica, expresión de la proteína, modificaciones de la proteína, inmunohistoquímica y las concentraciones del metabolito.

Resumen

Las biopsias de la glándula mamaria bovina permiten a los investigadores obtener muestras de tejido para estudiar la biología de la célula incluyendo la expresión génica, análisis histológico, señalización de vías y la traducción de la proteína. Este artículo describe dos técnicas para biopsia de la glándula mamaria bovina (MG). Tres saludables vacas Holstein fueron los temas. Antes de las biopsias, las vacas se ordeñan y posteriormente refrenadas en una canal de ganado. Analgésico (Flunixina meglumina, 1.1 a 2.2 mg/kg de peso corporal) fue administrado vía yugular intravenosa [IV] inyección 15-20 min antes de su biopsia. Para la sedación de pie, el clorhidrato de xilacina (0.01-0.05 mg/kg de peso corporal) fue inyectado a través de los vasos coccygeal 5-10 min antes del procedimiento. Una vez adecuadamente sedado, el sitio de la biopsia fue asépticamente preparado y anestesiado localmente con 6 mL de clorhidrato de lidocaína 2% mediante inyección subcutánea. Utilizando una técnica aséptica, se hizo una incisión vertical de 2 a 3 cm con un bisturí del número 10. Se utilizaron herramientas de biopsia Core y la aguja. La herramienta de biopsia de núcleo fue conectada a un taladro inalámbrico e insertada en el tejido de MG a través de la incisión mediante una acción de perforación las manecillas del reloj. La herramienta de biopsia de la aguja fue insertada manualmente en el sitio de la incisión. Inmediatamente después del procedimiento, un ayudante aplica presión en el sitio de la incisión de 20 a 25 minutos con una toalla estéril para conseguir la hemostasia. Grapas quirúrgicas de acero inoxidable se utilizan para oponerse a la incisión de la piel. Las grapas fueron eliminados 10 días después del procedimiento. Las principales ventajas de las biopsias de la base y la aguja es que ambos métodos son procedimientos mínimamente invasivos que pueden realizarse con seguridad en vacas sanas. Producción de leche después de la biopsia era inafectada. Estos procedimientos requieren un tiempo de recuperación corto y como resultado menos riesgos de complicaciones. Limitaciones específicas pueden incluir sangrado después de la biopsia y la infección en el sitio de la biopsia. Aplicaciones de estas técnicas incluyen la colección de tejidos para el diagnóstico clínico y con fines de investigación, tales como el cultivo de células primarias.

Introducción

Una biopsia es un procedimiento a una sección de la base de tejido de temas médicos o con fines de investigación. Es una técnica mínimamente invasiva y ampliamente utilizada para recoger el tejido como una alternativa a la eutanasia¹ para permitir el análisis de las respuestas del tejido al tratamiento u otros factores de interés. Muestras de tejidos de la glándula mamaria bovina (MG) son esenciales para la investigación lechera para el estudio de expresión génica y proteínas, la histología, la organización de organelos celulares, vías de señalización y los procesos metabólicos en respuesta a cambios en la gestión o la medio ambiente. Además, tejido de MG es necesario para diagnosticar e investigar ciertas enfermedades infecciosas como mastitis bovina causada por infecciones bacterianas².

La ubre de ganado contiene cuatro glándulas separadas y cada glándula contiene un sistema secretor de leche independiente colectivamente llamado parénquima. Los alvéolos, conductos y tejido conectivo están presentes en el parénquima mamario. Los alvéolos son estructuras microscópicas esféricas huecas que se componen de células epiteliales en la superficie interna (luminal) y células mioepiteliales especializados en la superficie externa (basal). Los alvéolos son responsables de la síntesis y secreción de leche. El tejido conectivo fibroso presente en el parénquima puede separar un grupo de alvéolos de otros grupos de alvéolos, y cada grupo se llama lóbulo³. Varios factores pueden afectar el desarrollo y la función del magnesio incluyendo fisiología animal, nutrición, manejo, genética y medio ambiente⁴. Mastitis es también un factor crítico que afecta negativamente a MG leche y función calidad⁵. Las toxinas liberadas por agentes patógenos de la mastitis pueden causar daños en los alvéolos e inducir necrosis dando por resultado cambios bioquímicos e histológicos en el tejido de MG⁶. Así, la histología y los procesos metabólicos de cada alvéolo o lóbulo en el magnesio pueden ser significativamente diferentes de los demás. Por lo tanto, las biopsias que son muestras representativas de toda la glándula mamaria son deseables. Pequeñas biopsias sólo pueden capturar un solo lóbulo o alvéolo individual, limitando la información resultante del científica o de diagnóstica. Para fines de investigación, es necesario ser conscientes de que una biopsia mamaria proporciona una 'instantánea' de las características del tejido pero una biopsia no caracteriza adecuadamente la función mamaria total en ausencia de estimaciones del total de la glándula mamaria masiva.

Varias herramientas de biopsia se han desarrollado en los últimos años 30 para uso humano. Actualmente, adaptaciones de los instrumentos están disponibles para su uso con animales. Para vacas lecheras, se han obtenido muestras de tejido de MG usando técnicas diferentes, como escisión quirúrgica (disección Roma)⁷, biopsia agujas^1,8, core biopsia instrumentos^9,10. Así, técnicas de biopsia de MG en vacas lecheras lactantes han transicionado de procedimientos utilizan sedación reclinada con disección quirúrgica mediante electrocauterización hemostasia en 1992⁷ a la colección de las biopsias de núcleo bajo sedación de pie^{9, 10,11,12}. Biopsia quirúrgica es un método invasivo, que puede ser caro y tienen una mayor incidencia de complicaciones como hematoma, problemas de la herida, y tumor extendido¹³. En la actualidad, la biopsia core y biopsia con aguja (también conocido como una biopsia tru-cut) han sido ampliamente adoptados como alternativas a la biopsia quirúrgica. Las ventajas de las biopsias core y aguja comparadas con biopsia quirúrgica incluyen: el procedimiento es mínimamente invasivo; complicaciones mayores son raras; anestesia general no es necesaria; el procedimiento es relativley rápido; el tiempo de recuperación es corto; hay mínimos efectos negativos sobre la salud de la ubre y sólo a corto plazo efectos sobre la leche producción y composición^8,9,10; y el costo es de biopsia quirúrgica menos de¹³.

Un procedimiento de biopsia de núcleo descrito en 1996 utiliza una cánula de acero inoxidable estéril, con una cuchilla retráctil extraíble para extraer una cantidad representativa de tejido bovino MG sin anestesia general^{9,10,11 ,12}. Durante el procedimiento, el instrumento fue atado a un taladro inalámbrico para crear una baja velocidad, el movimiento de rotación que corta limpiamente un núcleo de tejido como herramienta de la avanzó en el tejido. El beneficio era un tejido más grande de la muestra (70 x 4 mm de diámetro, aproximadamente 0.75 a 1 g) ⁹. Un reciente estudio¹⁰ demostró que el procedimiento de biopsia descrito por V. C. Farret al. ⁹ se puede utilizar para realizar colecciones de tejido MG repetidos sin impacto negativo sobre la salud rendimiento y ubre de las vacas lecheras lactantes. Más recientemente, se llevó a cabo un estudio¹⁴ en vacas lecheras para evaluar biopsias repetidas de la MG con un trócar más grande (de 9,5 mm de diámetro exterior, largo 31 cm, diámetro interior de 8 mm) con vacío aplicado a una cánula interna de acero inoxidable para recoger la biopsia . Este método utiliza anestesia local (clorhidrato de lidocaína 2%) y sedación (xilacina).

La biopsia con aguja es otra técnica para recoger el tejido mamario. Varios estudios han adoptado esta técnica. Un estudio¹ utiliza sedación (detomidina) y anestésico local (lidocaína al 1%) en el procedimiento. Después de la biopsia, las vacas recibieron un tratamiento antibiótico profiláctico. La glándula mamaria se masajear manualmente antes y después del ordeño. Se observó sangre en la leche para un máximo de 84 h después de la biopsia. La cantidad y composición de la leche fueron afectados por un período corto de tiempo. Recientemente, un estudio utilizó una aguja de biopsia para realizar las biopsias repetidas de MG en vacas lecheras⁸. Sedación (acepromazina 1%, intramuscular) y anestesia local (clorhidrato de la lidocaína 2% subcutánea) fueron administrados a los animales. Los animales no recibieron medicamentos intramamarios o antibióticos antes o después del procedimiento, y no había muestras de la infección en el sitio de la biopsia durante el período post-quirúrgico. En este estudio, repetidas biopsias MG bovinas utilizando una aguja tenían un impacto negativo menor en salud producción y ubre de la leche de las vacas lecheras. En general, la biopsia con aguja parece ser un método menos invasivo que el instrumento de biopsia de núcleo. Sin embargo, como se indicó anteriormente, es esencial para la técnica de biopsia para recoger una muestra representativa de la MG de tejido. La limitación de una biopsia con aguja es que una pequeña cantidad de tejido bovino de MG se obtiene (aproximadamente 20 a 25 mg)^8,15.

Casi todos los estudios usaron una combinación de agonista α-2 sedación y anestesia local^8,9,10, si la biopsia era a través de una aguja o un núcleo más grande. En el bovino MG, más las terminaciones nerviosas están asociadas con la piel. Inervación del tejido parenquimal es en gran parte a través de receptores de estiramiento con escaso tipo una fibras nerviosas para detectar dolor agudo quirúrgico. Como resultado, mecanismos fisiológicos del dolor debido a la manipulación quirúrgica del magnesio es a través de la piel y tejidos subcutáneos³ y tejidos profundos no como tejido parenquimal. Por lo tanto, para los procedimientos de biopsia, sólo es necesario anestesiar localmente la piel y tejidos subcutáneos, como infiltración de anestésico local en los tejidos más profundos no reduce significativamente el dolor quirúrgico. Después de una preparación adecuada de la zona de la biopsia, malestar animal es, principalmente, asociados con el alojamiento.

Colección de muestras de núcleo más grandes puede aumentar la formación del hematoma y aumentan el riesgo de infección dentro de la parenquimia de MG. Por lo tanto, protocolos perioperatorios a menudo incluyen la administración de antibióticos parenterales⁷, aunque eso no es universales⁸. Lograr la hemostasis es también un factor importante para reducir la morbilidad de la vaca. En el estudio ya mencionado uso de instrumento de biopsia de núcleo grande¹⁴, presión manual se aplicó en el sitio de la biopsia y un sujetador de la vaca fue utilizado para aplicar hielo en las heridas durante al menos 2 h después del procedimiento. A pesar de la gran cantidad de tejido que se cosechan, se observaron sólo leves reducciones en el rendimiento de leche y consumo de alimentación, y el procedimiento se repitió cada tres semanas sin efectos negativos sobre la salud de la vaca.

Los investigadores realizar biopsia de MG en vacas lecheras deben tener en cuenta la calidad diagnóstico o análisis de la biopsia resultante, la facilidad de la técnica y vaca de morbilidad. Técnica quirúrgica precisa y previamente planificado es imprescindible para conseguir estos objetivos. Hasta la fecha estudios de biopsia de MG se han centrado en describir los resultados de la biopsia, en lugar de describir la técnica de la biopsia, y descripciones para las vacas lecheras lactantes carecen de suficiente detalle para permitir la replicación. Así, el objetivo de este trabajo fue describir la biopsia de la aguja y técnicas de biopsia de núcleo más grandes con suficiente detalle para permitir la replicación segura y humana de biopsia MG de ganado.

Protocolo

Todos los métodos descritos fueron aprobados por el Virginia Tech Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC).

1. el personal

1. Tienen por lo menos dos ayudantes con experiencia quirúrgica y manejo de la vaca.
2. Tren de todos los asistentes por lo menos tres veces, si es posible usar material cadavérico, antes de realizar procedimientos asociados a este protocolo en animales vivos.
   Nota: La capacitación debe realizarse por un instructor que ha sido previamente entrenado y realizar la técnica.
3. Tener una veterinario de animales grandes en la mano para administración de drogas y en el caso tratamiento de emergencia se hace necesario durante el procedimiento. Emergencias que pueden ocurrir durante este procedimiento incluyen pero no están limitadas a: hemorragia, agonista α-2 sobredosis y edema pulmonar, regurgitación y aspiración de alimento material, dolor y resistencia paciente que requiere sedación adicional.

2. preparación de los instrumentos quirúrgicos, suministros y servicio

1. Inventario y compra todos los equipos y suministros (véase Tabla de materiales).
2. Limpio y cortinas quirúrgicas autoclave, instrumentos de biopsia, titulares de bisturí, toallas quirúrgicas y pinzas.
3. Tienen un tamaño adecuado squeeze chute y cabeza puerta para sujetar las vacas.
4. Establecer un espacio de trabajo con una mesa cerca del conducto de squeeze.
5. Asegúrese de que el área de trabajo es limpio y ha limitado la vaca a través de tráfico.
6. Organizar equipos y suministros en el espacio de trabajo de fácil acceso.
7. Tienen una iluminación adecuada dentro del espacio de trabajo.

3. preparación de los animales

1. Un día antes de la biopsia programada, lavar y limpiar el animal, especialmente la ubre para eliminar el estiércol y material sucio.
2. Siga los procedimientos de alojamiento seguro y humanitario de ganado.
3. Antes de la biopsia y otra vez en el momento de la biopsia, evaluar la salud, condición física y el comportamiento del animal.
   Nota: Un examen mínimo incluye temperatura, pulso y tasas respiratorias así como la examinación para la dermatitis en el sitio quirúrgico propuesto u otro tipo de infección bacteriana. Recoger las muestras de leche de cada cuarto y Compruebe la mastitis.
4. Utilice sólo vacas sanas.
5. Completamente la leche la vaca.
6. Colocar el animal en el conducto de presión, idealmente dentro de las 2 h de ordeño para minimizar la presencia de leche en las glándulas.
7. Refrenar el animal con una puerta de cabeza.

4. analgesia y sedación

1. Coloque un halter de la cuerda sobre la cabeza de la vaca para evitar hacia atrás y hacia adelante el movimiento.
2. Tire de la cabeza del animal hacia un lado y ata la cuerda al conducto de squeeze utilizando un nudo de liberación rápida para mantener la cabeza en su lugar.
3. Limpiar la zona de inyección con una torunda de alcohol isopropílico al 70% y administrar Flunixina meglumina (1.1 a 2.2 mg/kg de peso corporal) por vía intravenosa a través de la vena yugular 15-20 min antes para biopsia.
   Nota: en algunos protocolos, fármacos antiinflamatorios no esteroides se administran después de la biopsia si los antiinflamatorios no afectan resultados de la investigación.
   1. Localizar la vena yugular.
   2. Elevar la vena yugular por aplicación de presión en la base del surco yugular.
   3. Verifique que no hay burbujas en la jeringa.
   4. Inserte la aguja en la vena yugular elevada y extraer 0.5 mL de sangre en la jeringa dos veces y mezclar con el contenido. Si la sangre no se muestra en la jeringa, vuelva a colocar la aguja. Si es residente en la vena la aguja, inyectar el contenido.
   5. Retire suavemente la aguja.
   6. Aplicar una gasa con una ligera presión en el sitio de la inyección para prevenir el sangrado.
4. Administrar por vía intravenosa clorhidrato de xilacina (0.01 a 0.05 mg/kg de peso corporal) en el vaso coccygeal aproximadamente 5-10 min antes de la biopsia para permitir tiempo suficiente para el establecimiento de la sedación.
   PRECAUCIÓN: Revise el animal para detectar signos de edema pulmonar. Signos clínicos de edema pulmonar incluyen dificultad respiratoria, disnea severa, dificultad para respirar, tos, esputo espumoso y lengua azul. Si se observan signos de edema pulmonar, se recomienda utilizar tolazine (2 a 4 mg/kg de peso corporal) para revertir los efectos de la xilacina.
   1. Levante la cola y limpiar la zona de inyección con una torunda de alcohol isopropílico al 70%.
   2. Verifique que no hay burbujas en la jeringa.
   3. Inserte la aguja en el vaso de cola, sacar 0,2 mL de sangre en la jeringa y mezclar con el contenido para asegurar que la aguja es residente en el vaso. Si la aguja es residente en el vaso, inyecte el contenido de la jeringa.
   4. Retire suavemente la aguja.
   5. Aplicar una gasa con una ligera presión en el sitio de inyección.

5. preparación del sitio de biopsia

1. Tiene asistente amarrar la cola para el procedimiento.
2. Seleccione el sitio de la biopsia de la ubre (típicamente en una zona alta para minimizar la acumulación de tejido conectivo y para evitar la penetración en la cisterna de la glándula, figura 1) y eliminar material sucio o estiércol desde el sitio de biopsia seleccionado.

Figura 1 . Imagen de la ubre bovina que ilustra el sitio de la biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

3. Observar y palpar la piel con especial atención a identificar cualquier vasos sanguíneos subcutáneos para evitar estos vasos durante la biopsia.
4. Recorte el pelo de un área de 15 x 15 cm alrededor del sitio de biopsia.
5. Preparar el área de la biopsia con povidona-yodo (0,75% de yodo disponible) o matorral de gluconato de clorhexidina. Alternan con alcohol isopropílico al 70% por lo menos tres veces para quitar toda la suciedad visible y lo invisible. Aplique la solución de lavado aséptico y alcohol isopropílico en un movimiento circular usando el enfoque de adentro hacia afuera. Asegúrese de que la solución de lavado antiséptico permanezca en contacto con la piel durante al menos 5 minutos.
6. Utilizar una infusión de mariposa con una aguja de 18 G para depositar 6 mL de clorhidrato de lidocaína 2% por vía subcutánea en el sitio de la incisión para crear un bloque de línea. No penetran en los tejidos más profundos.
   Nota: La dosis de lidocaína varían entre 3 y 8 mL.
7. Permiten que el anestésico local difundir para 3 a 5 minutos realizar otra repetición de solución de lavado y alcohol antes de la incisión. Mientras espera, prepare los instrumentos de biopsia.

6. biopsia

1. Use técnicas asépticas al manipular las herramientas de la biopsia y la incisión.
2. Lávese las manos para eliminar cualquier contaminación visible y aplicar guantes quirúrgicos estériles.
3. Organizar los instrumentos quirúrgicos en una zona estéril en orden de uso. Tienen un bisturí número 10, gasa estéril, un instrumento de biopsia montado y una toalla estéril para la hemostasia.
   Nota: Siga el procedimiento 1 para realizar una biopsia de núcleo o procedimiento 2 para realizar una biopsia con aguja.

Figura 2 . Representación esquemática del ensamblaje y configuración de la herramienta de biopsia de núcleo descrita por V. C. Farr, et al ⁹ barra de escala es 1 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Instrumento de biopsia de núcleo (Farr et al.⁹)
   1. Montar el instrumento de biopsia de núcleo con guantes estériles (figura 2).
      1. Colocar los 7 estéril sobre un paño estéril (figura 2A).
      2. Inserte la hoja (pieza 1) en el sistema de acoplamiento en la pieza 2 (figura 2B ).
         PRECAUCIÓN: No coloque los dedos directamente en la línea de la hoja.
      3. Inserte 3 sobre pieza 2 (figura 2) asegurando que se unirá la estación de acoplamiento.
         Nota: Observe un sistema de acoplamiento en la pared interior de la pieza 4 (Figura 2D).
      4. Enganchar el borde final de la hoja (pieza 1) en el sistema de acoplamiento de pieza 4 (Figura 2D).
      5. Empuje hacia adelante la pieza 4 y observar si la pieza 4 es junto a la pieza 3 (Figura 2E).
      6. Inserte la pieza 5 en el dispositivo (cuchilla + pieza 2) (figura 2F).
      7. Asegurarse de que la estación de acoplamiento está alineada (figura 2).
      8. Inserte la pieza 6 en la parte superior de la pieza 2 (frente a lado de la hoja) (figura 2 H)
      9. Asegurarse de que la estación de acoplamiento está alineada (figura 2 H).
      10. Inserte el tornillo de bloqueo (pieza 7) en la estación de acoplamiento (figura 2I).
      11. Empuje hacia adelante la pieza 3 (negro) para cubrir el tornillo de fijación.
          PRECAUCIÓN: No coloque los dedos en la salida de la hoja.
      12. Activar la herramienta de empujar adelante pieza 4 y observe la hoja fuera de la herramienta.
      13. Tire un pedazo 4 para retraer la cuchilla hacia la herramienta (lista para usar).
          Nota: La hoja debe ser activada sólo cuando la herramienta haya penetrado la distancia deseada dentro del tejido que una biopsia.
   2. Asegúrese de que la vaca es suficientemente sedada y el sitio de la biopsia es suficientemente anestesiado. Pellizcar la piel para no asegurarse de reacción.
   3. Haga una incisión vertical de 2 a 3 cm a través de la piel y tejidos subcutáneos de proximal a distal con un bisturí del número 10.
   4. Coloque el instrumento de biopsia en un taladro inalámbrico utilizando una técnica estéril.
   5. Coloque el taladro contra la herramienta de biopsia y verifique si la herramienta está bien colocada en el taladro.
   6. Garantizar la adecuada sujeción por tener a una persona elevar la cola durante todo el procedimiento.
   7. Encender el taladro con giro a la derecha y a baja velocidad.
      Nota: El taladro no es estéril, y el operador no queda estéril cuando utilice el taladro.
   8. Avanzar toda biopsia (unos 7,5 cm) en la ubre a través de la incisión mientras la broca está girando el peaje.
   9. Apague el taladro y extender manualmente pieza 4 de la herramienta.
   10. Encender el taladro con giro a la derecha y baja velocidad.
   11. Retire el instrumento que contiene la base de tejido de la ubre.
   12. Aplique presión fuerte inmediatamente la herida con una toalla estéril durante al menos 20 minutos.
       Nota: Tiene asistente realizar esto usando su puño para garantizar la aplicación de presión adecuada.
   13. Retire el tejido de la herramienta de biopsia con pinzas.
   14. Mantener la muestra en tampón de fosfato x 1 solución salina y evaluar la cantidad de tejido.
   15. Tomar los signos vitales de la vaca cada 10 minutos después de la biopsia durante al menos 30 minutos.
   16. Si hay sangrado después de 20 min de la presión en el sitio de la biopsia. Si hay goteo de sangre continúe aplicando presión por un 5-10 minutos adicionales.
   17. Cerrar las incisiones mediante grapas de acero inoxidable en intervalos de 5 mm después de todo sangrado se ha detenido. Utilizar entre 5 y 8 grapas.
   18. Aplique un vendaje de aerosol en el área de la biopsia.
   19. Observar el animal durante 50 minutos después del procedimiento.
5. Instrumento de biopsia de aguja
   1. Siga las instrucciones del fabricante para el dispositivo.
   2. Retire la aguja de biopsia del paquete usando técnicas estériles.
   3. Deseche la aguja si se observa cualquier daño.
   4. Coloque la aguja en el dispositivo.
   5. Cierre la tapa y el dispositivo del martillo.
   6. Asegúrese de que la vaca es suficientemente sedada y el sitio de la biopsia es suficientemente anestesiado. Pellizcar la piel para no asegurarse de reacción.
   7. Haga una incisión vertical de 1 a 2 cm a través de la piel y tejidos subcutáneos de proximal a distal con un bisturí del número 10.
      Nota: La incisión para el instrumento de aguja de biopsia puede ser más pequeño (1-2 cm) que para el instrumento de biopsia de núcleo.
   8. Inserte la aguja de biopsia en el sitio de la incisión (alrededor de 10 a 13 cm de la piel).
   9. Activar el dispositivo de aguja de biopsia para recoger el tejido.
   10. Retire la aguja de la ubre.
   11. Aplique presión fuerte, inmediata a la herida con una toalla estéril durante al menos 20 minutos.
   12. Quitar el tejido de la aguja de biopsia con pinzas.
   13. Mantener la muestra en tampón de fosfato x 1 solución salina y evaluar la cantidad de tejido.
   14. Tomar signos vitales cada 10 minutos después de la biopsia durante al menos 30 minutos.
   15. Si hay sangrado después de 20 min de la presión en el sitio de la biopsia.
   16. Cerrar las incisiones mediante grapas de acero inoxidable después de todo sangrado se ha detenido.
   17. Aplique un vendaje de aerosol en el área de la biopsia.
   18. Observar el animal durante 50 minutos después del procedimiento.

7. biopsia posterior al cuidado de los animales

1. Documentar todos los medicamentos administrados a los animales.
   Nota: La leche fue desechada durante un período de 36 horas después del procedimiento; abstinencia de carne era 4 d. tiempos de espera para la leche y la carne pueden variar dependiendo del país o jurisdicción y los fármacos utilizados. Compruebe las regulaciones y leyes locales.
2. Comprobar la presencia de sangre en la leche de 7 a 10 d después de la biopsia.
3. Coágulos de sangre de la tira de la mano del cuarto hecho una biopsia en ordeños posteriores y asegurar que la leche completa se produce el retiro.
   Nota: Se espera la presencia de coágulos de sangre del cuarto hecho una biopsia para 1-3 ordeños después del procedimiento. D de 1 a 6 se puede observar sangre en la leche después de la biopsia.
4. Observar leche producen, y si es posible, el diario individual consumo de alimento hasta que quitaron las grapas quirúrgicas.
5. Vigilar el animal dos veces al día para la temperatura corporal, respiración y ritmo cardiaco y comportamiento hasta que quitaron las grapas quirúrgicas.
6. Verifique el sitio de la biopsia dos veces al día para la hinchazón, dolor y signos de drenaje hasta que se han quitado las grapas quirúrgicas. Si éstos se observan, consulte a un veterinario.
   Nota: Limpiar el sitio de la biopsia y vuelva a aplicar el vendaje de aerosol cada uno a tres días según sea necesario.
7. Retire las grapas de la incisión de 10 a 14 d después de la biopsia, dependiendo de la tasa de curación.
8. Consulte a un veterinario si se observan signos de infección local o sistémica.

Resultados

En el presente Protocolo, la técnica de biopsia de núcleo producido muestra de tejido de 200 a 600 mg mientras que la biopsia de aguja producido muestras de 10 a 30 mg por biopsia. Los animales se observaron dos veces al día durante 10 d después del procedimiento. Ningunas complicaciones ocurrieron durante el procedimiento o en el postoperatorio, con parámetros vitales de las vacas restantes dentro de límites normales (promedio frecuencia respiratoria = 31,4 ± 7.04 (SD) respiraciones por minuto, pulso promedio = 75,9 ± 8,9 latidos por min y promedio temperatura rectal = 38.2 ± 0,68 ° C, figura 3).

Tras presión manual en el área de la biopsia para conseguir la hemostasia (25 min.), la herida abierta demostró la sangría mínima (figura 4). Las vacas se alimentaron la misma dieta ad libitum, y los animales se mantuvieron en las mismas instalaciones de la vivienda durante el período postoperatorio. Los animales no presentaron signos de infección en el sitio de la biopsia; no había ningún dolor, sangrado, inflamación, drenaje o temperatura elevada (figura 5). La herida sanó dentro d 8 a 10 de la biopsia (figura 5).

Un animal desarrollado irritaciones menores de la piel debido al roce con el día 8 después del procedimiento de la herida. Esta vaca fue tratada por limpiar el sitio de la biopsia usando solución de povidona-yodo y alcohol isopropílico al 70%. Las grapas de acero inoxidable fueron quitadas para permitir el drenaje y ungüento de yodo povidona (1%) se aplicó dos veces al día en el sitio de biopsia de 2 a 3 d. La irritación de la piel desaparecieron 2 d después de aplicar el ungüento de povidone-yodo y la herida curó sin más complicaciones.

Coágulos de sangre fueron quitados por la mano de leche desde el cuarto hecho una biopsia antes de la máquina de ordeño. En el presente Protocolo, se observó la presencia de coágulos de sangre en la leche para un máximo de tres ordeños (aproximadamente 36 h) después de la biopsia. Contaminación de la sangre de la leche se observó hasta 48 h después de la biopsia. No hubo diferencias visuales entre las biopsias de la base y la aguja en relación con la cantidad de sangre en la leche. Los animales no presentaron una disminución significativa en la producción de leche después del procedimiento (figura 6). Composición de la leche promedio era 4,37% de materia grasa, 3.34% de proteína y 4.64% de lactosa. El recuento de células somáticas de leche promedio (SCC) fue menos de 200.000 células por mL.

El MG de tejido obtenido puede utilizarse para fines de investigación como las culturas de célula primaria (figura 7).

Figura 3 . Evaluación de indicadores de salud animal después de la biopsia de glándula mamaria bovina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 4 . Apariencia del sitio de la biopsia después de de presión manual se aplicó a la zona de la biopsia para conseguir la hemostasia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 . Fotografías del sitio de biopsia. (A) biopsia del sitio 3 d después del procedimiento de. (B) biopsia del sitio 6 d después del procedimiento de. (C) biopsia del sitio 10 d después del procedimiento que ilustra que la herida fue curada adecuadamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 . Producción diaria de leche antes y después de la biopsia de glándula mamaria bovina (n = 3 vacas). Un modelo lineal había estimado que 10 días antes de la biopsia los animales producen 23,35 kg de leche por día. La producción de leche no cambiaron significativamente (P > 0.05) desde 10 días antes hasta 10 días después de la biopsia aunque un ligero aumento en la producción de leche fue observada (aumento de 0,0005 kg/d de leche por cada día de 10 días antes de la biopsia). Tres animales fueron utilizados en el presente Protocolo; un animal fue hecho una biopsia dos veces (Animal 1: core biopsia en el lado izquierdo de la ubre y biopsia en el lado derecho de la ubre) y dos animales fueron hechas una biopsia una vez (animales 2 y 3: sólo en el lado derecho de la ubre mediante el procedimiento de núcleo o una aguja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 . Imágenes representativas de la cultura de células epiteliales mamarias bovinas primaria. Barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Métodos de biopsia Core y la aguja se describen en este protocolo^9,16. Una evaluación detallada de la salud animal y la incidencia de mastitis¹⁴ antes de la biopsia es necesaria para ambos procedimientos. Para fines de investigación, realizar la técnica en animales con signos evidentes de inflamación o de enfermedades infecciosas debe evitarse. Esto reducirá el riesgo de complicaciones durante y después de una biopsia. Todos los instrumentos de biopsia y dispositivos deben ser limpios, desinfectados y esterilizados para evitar la contaminación del sitio de biopsia. Antes del procedimiento, es necesario reducir al mínimo infecciones del sitio quirúrgico (SSI). En general, SSI se asocia con morbilidad animal, pierde rendimiento y mayores costos de producción en vacas lecheras. Estudios divulgados previamente métodos para prevenir SSI debido a biopsia incluyendo recorte el pelo alrededor del sitio de incisión, lavar el área de la biopsia para eliminar contaminación^9,14y el uso de agentes antisépticos (alcohol 70%, yodo quirúrgico talle⁹, de solución de acetato de clorhexidina 2%¹⁴, 10% povidone-yodo⁸) para la preparación de la piel. En algunos estudios, se adoptó la administración de antibióticos durante⁷ o inmediatamente después de la biopsia⁹; sin embargo, la profilaxis antibiótica no fue utilizada en el presente trabajo, e infecciones del sitio de la biopsia no fueron observadas. Para evitar la contaminación de la biopsia de la herida, la cola debe estar sujeto para evitar el contacto con el sitio de la biopsia hasta que se ha aplicado el vendaje de aerosol. En el presente Protocolo, las grapas se quitan alrededor de 10 a 14 d después de la biopsia.

Antes de una biopsia, es importante configurar la herramienta y sujete el taladro; elige una velocidad de rotación lenta, seleccionar la rotación hacia adelante y no utilice el modo inverso del taladro. Durante el procedimiento, es importante utilizar presión digital a ambos lados de la incisión para mantener separados los bordes de la piel y tener una incisión lo suficientemente largos para permitir la entrada de la herramienta sin contacto con la piel o del tejido conectivo. Si no se realiza este procedimiento, un lastre para los bordes de la incisión durante la rotación del instrumento de biopsia de núcleo puede ocurrir y causar traumas de tejido de piel adicional que aumentan el riesgo de infección y pueden retrasar la cicatrización de heridas. Los procedimientos actuales de la biopsia que se describe en este protocolo fueron realizados por un cirujano certificado de animales grandes. Los procedimientos fueron realizados con éxito (figura 5). Ambas técnicas son relativamente fáciles y rápidos de realizar en comparación con el procedimiento de escisión quirúrgica.

Sangrado en el sitio de la biopsia son comunes después de la biopsia de MG en vacas lecheras^8,9,10,14. En el presente Protocolo, sangrado observado fue mínimo (figura 4), que puede ser debido a la aplicación de presión adecuada (fuerte) en la herida inmediatamente después del procedimiento. Se requiere una presión fuerte por al menos 20 min, y puede requerir más de 30 minutos en algunos casos. Si se observa un moderado a severo sangrado después de la aplicación de presión en el sitio de la biopsia, se recomienda continuar la presión, y comuníquese inmediatamente con un veterinario.

Hemostasia es un factor importante para reducir la morbilidad de la vaca, un estudio lleno cojines hemostáticos en el sitio de la biopsia para control de sangrado⁹. Sin embargo, el uso de hemostáticos de tal manera tiene un alto riesgo potencial de contaminación microbiológica en el entorno de la granja lechera. Otro estudio¹⁴ aplicar presión manual en el sitio de biopsia entre las biopsias repetidas y después cierre la biopsia de piel y aplicar hielo en el sitio durante al menos 2 h después de la biopsia. En el presente Protocolo, fuerte presión sobre el sitio de la biopsia durante 20 a 25 minutos fue suficiente para controlar el sangrado.

Una técnica de biopsia exitosa debe resultar mínima sangre en la leche que persiste durante un período corto de tiempo después del procedimiento. Para evitar una interrupción de la secreción de leche en leche bajada y mastitis infecciones, coágulos de sangre intramamaria deben eliminarse a mano pela del cuarto una biopsia^10,14. En el presente Protocolo, se observó sangre en la leche hasta 48 h después de la biopsia. Sin embargo, en un estudio que utilizó un mayor número de animales, sangre en la leche se observó en la mayoría de las vacas de menos de 6 días. Pocos animales mostraron sangre en la leche después de 6 días⁸. Por esta razón, la observación diaria de la apariencia de la leche es necesaria para 6 d después del procedimiento. Animales no mostró ningún signo de infección de mastitis cuando se obtuvo una muestra de tejido grande¹⁴. Sin embargo, investigaciones previas que realiza biopsias repetidas en el mismo animal, utilizando una aguja encontraron que incidencia de infección de mastitis fue aproximadamente un 12% tras el procedimiento⁸. En el presente Protocolo, ni animal tenía signos visuales de infección de mastitis clínica después del procedimiento. También hay una ligera posibilidad de que el sitio de la incisión puede infectarse después de la biopsia.

Tolazoline hydrochloride, un fármaco que invierte los efectos de la sedación, debe estar disponible en caso de una sobredosis de xilacina. Una excesiva dosis de xilacina puede causar edema pulmonar. Signos clínicos de edema pulmonar incluyen dificultad respiratoria, disnea severa, dificultad para respirar, tos y esputo espumoso. Si se observan signos de edema pulmonar, se recomienda utilizar tolazine (2 a 4 mg/kg de peso corporal) para revertir los efectos de la xilacina.

El presente Protocolo describe la técnica para realizar una biopsia de la aguja y la biopsia. En general, la ventaja de una biopsia de núcleo en comparación con la biopsia por punción es el más grande tejido muestra (0.75 a 1 g)⁹ con mínimo efecto negativo en la salud de la ubre. La biopsia con aguja es un método menos invasivo que el instrumento de biopsia de núcleo. Sin embargo, la biopsia múltiple intenta obtener una mayor cantidad de tejido utilizando que un procedimiento de la biopsia de aguja puede aumentar el riesgo de hemorragia grave después del procedimiento, así como coágulos de sangre en la leche. Ambas técnicas causaron morbilidad mínima vaca y se lograron con una formación mínima del personal quirúrgico. Un cambio a corto plazo la producción de leche diaria (8 a 10% de disminución) y en su composición⁹ consumo reducción¹⁴ se espera que después de las biopsias de aguja y base, respectivamente. Limitaciones del procedimiento de la biopsia de aguja son la escasa cantidad de tejido extirpado con la aguja. El instrumento necesita ser activado sólo cuando la aguja está dentro del tejido que una biopsia y múltiples intentos a menudo son necesarios para obtener una cantidad adecuada de tejido, que aumenta el riesgo de la sangre en la leche y la mastitis después del procedimiento. Limitaciones de la biopsia incluyen un mayor riesgo de sangrado después del procedimiento si una gran cantidad de tejido (> 200 mg) se obtiene. Además, la herramienta de biopsia es más difícil de montar que requieren una formación adecuada antes de usar.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Isopropyl alcohol	Walmart	565106257	1 L
Aerosol spray to kill and repel flies	MWI	14339	1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm	C. R. Bard	MN1216	2
Butterfly infusion set (18 G needle)	Fisher	22-258087	1
Cell culture dishes	Fisher	08-772E	4
Cordless drill (low speed)	Hitachi	DS10DFL	1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996)			2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows			cattle healthy
Flunixin meglumine	MWI/VetOne	501018	1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table	Amazon		1
Forceps	Fisher	09-753-50	1
Gloves non-sterile	Fisher	17-200-845	9, size dependent
Hard brush	Sullivan Supply	18270	1, to wash the cows
Head gate			1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable	MWI/VetOne	510212	6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash	eZall Technologies	39384	1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“)	Fisher	14-821-15A	6
Needle 20 G (1 to 1/5“)	Fisher	14-815-526	6
Phosphate buffered saline (0.9%)	Fisher	20-012-043	1 L
Povidone Iodine ointment	Jeffers	#VED1A	500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine)	MWI/VetOne	510094	1 L
Reusable biopsy instrument	C. R. Bard	MG1522	1
Rope halter	Nasco farm and ranch	C10852	2, cow size
Scalpel blades (#10)	MWI	033870	2
Scalpel holders (#3)	MWI	602008	1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in.	Fisher	19-130-0038	1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges	Fisher	22-037-986	4
Sterile gauze pads	Fisher	19-090-735	4
Sterile surgical gloves	Surgical gloves	19-166-679	3,  size dependent
Sterile surgical towels	Fisher	50-118-0339	6
Stethoscope	Littmann Master Classic II	1392	1
Surgical clipper	Oster A5	078005-010-003	1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 )	Oster	78919-016	1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover	MWI	541	1
Surgical stapler pre-loaded	MWI	17713	5
Syringes of 10 mL	Fisher	14-823-224	3
Syringes of 2 mL	Fisher	22-028854	3
Syringes of 20 mL	Fisher	22-034507	3
Syringes of 5 mL	Fisher	22-028855	3
Thermometer	Agri-Pro Enterprises Inc	72000	1
Tolazine hydrochloride	Akorn Animal Health	61311-486-10	2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer	Fisher	14-955-025	1, for handle the tissue sample
Water hose	Miracle-Gro, Walmart	554990501	1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg)	MWI	010728	1 bottle
Xylazine hydrochloride	MWI/VetOne	510650	0.01 to 0.05 mg/kg of body weight