Tecniche di biopsia della ghiandola mammaria bovina

Riepilogo

Questo articolo presenta una biopsia della ghiandola mammaria bovina utilizzando strumenti di biopsia core e dell'ago. Tessuto raccolto può essere utilizzato per la coltura cellulare o per valutare mammaria fisiologia e metabolismo compreso l'espressione genica, espressione della proteina, modifiche della proteina, immunohistochemistry e concentrazioni nel metabolita.

Abstract

Le biopsie della ghiandola mammaria bovina permettono ai ricercatori di raccogliere campioni di tessuto per studiare biologia cellulare tra cui espressione genica, analisi istologica, segnalazione vie e la traduzione della proteina. In questo articolo viene descritto due tecniche per biopsia della ghiandola mammaria bovina (MG). Tre vacche Holstein sani sono stati i temi. Prima le biopsie, le mucche erano munte e successivamente trattenute in uno scivolo di bestiame. Un analgesico (flunixin meglumine, 1,1-2,2 mg/kg di peso corporeo) è stato amministrato via giugulare prima 15-20 min iniezione endovenosa del [IV] alla biopsia. Per la sedazione in piedi, xilazina cloridrato (0,01-0,05 mg/kg di peso corporeo) è stato iniettato attraverso i vasi coccygeal 5-10 minuti prima della procedura. Una volta adeguatamente sedato, il sito di biopsia era preparato asetticamente e anestetizzato localmente con 6 mL di cloridrato di lidocaina 2% tramite iniezione sottocutanea. Utilizzando una tecnica asettica, un'incisione verticale di 2-3 cm è stata effettuata usando un bisturi numero 10. Core e ago biopsia strumenti utilizzati. Il principale strumento per la biopsia è stato collegato a un trapano cordless e inserito nel tessuto MG attraverso l'incisione mediante un'azione di trapano in senso orario. Lo strumento di biopsia dell'ago è stato inserito manualmente nel sito di incisione. Immediatamente dopo la procedura, un assistente applicato pressione sul sito di incisione per 20-25 min utilizzando un panno sterile per ottenere l'emostasi. Graffette chirurgiche in acciaio inox sono stati utilizzati per contrastare l'incisione cutanea. I punti metallici sono stati rimossi 10 giorni dopo la procedura. I principali vantaggi delle biopsie core e dell'ago è che entrambi gli approcci sono procedure minimamente invasive che possono essere eseguite in modo sicuro in vacche sane. Produzione di latte dopo la biopsia era inalterata. Queste procedure richiedono un tempo di recupero breve e comportare meno rischi di complicazioni. Limitazioni specifiche possono includere sanguinamento dopo la biopsia e l'infezione del sito di biopsia. Applicazioni di queste tecniche comprendono la raccolta di tessuto per la diagnosi clinica e di ricerca, come le colture cellulari primarie.

Introduzione

Una biopsia è una procedura per la raccolta di una sezione del tessuto da soggetti per uso medico o per scopi di ricerca. È una tecnica mini-invasiva e ampiamente utilizzata per raccogliere il tessuto come alternativa all'eutanasia¹ per consentire l'analisi delle risposte dei tessuti al trattamento o da altri fattori di interesse. Campioni di tessuti bovini della ghiandola mammaria (MG) sono essenziali per la ricerca lattiero-caseario studiare l'espressione genica e proteica, l'istologia, l'organizzazione di organelli cellulari, vie di segnalazione e processi metabolici in risposta a cambiamenti nella gestione o la ambiente. Inoltre, tessuto di MG è necessario per diagnosticare e ricercare determinate malattie infettive, come la mastite bovina causata da infezioni batteriche².

La mammella del bovino contiene quattro ghiandole separati e ogni ghiandola contiene un sistema secretivo latte indipendenti chiamati collettivamente parenchima. Il alveoli, condotti e del tessuto connettivo sono presenti nel parenchima mammario. Gli alveoli sono microscopiche strutture sferiche cave che sono composti da cellule epiteliali sulla superficie interna (luminal) e cellule myoepithelial specializzate sulla superficie esterna (basale). Gli alveoli sono responsabili della sintesi e la secrezione del latte. Il tessuto connettivo fibroso presente nel parenchima può separare un gruppo di alveoli da altri gruppi di alveoli, e ogni gruppo è chiamato un lobulo³. Diversi fattori possono influenzare lo sviluppo e la funzione del MG tra cui fisiologia animale, nutrizione, gestione, genetica e l' ambiente⁴. La mastite è anche un fattore critico che influenza negativamente la MG funzione e latte di qualità⁵. Le tossine rilasciate da mastite patogeni possono causare danni agli alveoli e indurre necrosi conseguente cambiamenti biochimici ed istologici in tessuto MG⁶. Quindi, l'istologia e processi metabolici di ogni alveoli o lobulo nel MG possono essere significativamente diversi dagli altri. Come tale, le biopsie che sono campioni rappresentativi dell'intera ghiandola mammaria sono desiderabili. Piccole biopsie possono acquisire solo un singolo lobulo o singolo alveolo, limitando le informazioni scientifiche o diagnostiche risultanti. Per scopi di ricerca, è necessario essere consapevoli che una biopsia mammaria fornisce una 'istantanea' delle caratteristiche dei tessuti, ma una biopsia non può caratterizzare adeguatamente funzione totale mammaria in assenza di stime della ghiandola mammaria totale massa.

Diversi strumenti di biopsia sono stati sviluppati negli ultimi 30 anni per uso umano. Attualmente, gli adattamenti di tali strumenti sono disponibili per l'uso con gli animali. Per bovini da latte, campioni di tessuto di MG sono stati ottenuti con tecniche diverse, tra cui l'asportazione chirurgica (dissezione smussa)⁷, biopsia aghi^1,8e core biopsia strumenti^9,10. Così, le tecniche di biopsia MG in vacche da latte in lattazione hanno la transizione dalle procedure utilizzando recumbent sedazione con dissezione chirurgica usando l'elettrocauterio emostasi nel 1992⁷ collezione di biopsie sotto in piedi sedazione^{9, 10,11,12}. Biopsia chirurgica è un metodo invasivo, che può essere costoso e hanno una maggiore incidenza di complicazioni quali ematoma, ferita problemi e tumore diffuso¹³. Attualmente, biopsia del centro e la biopsia dell'ago (anche conosciuto come una biopsia tru-cut) sono state ampiamente adottate come alternative alla biopsia chirurgica. I vantaggi delle biopsie core e dell'ago rispetto alla biopsia chirurgica includono: la procedura è minimamente invasiva; le principali complicazioni sono rare; l'anestesia generale non è necessaria; la procedura è relativley veloce; il tempo di recupero è breve; non c'è minimi effetti negativi sulla salute della mammella e soltanto gli effetti a breve termine il latte produzione e composizione^8,9,10; e il costo è di biopsia chirurgica meno di¹³.

Una procedura di biopsia di nucleo descritta nel 1996 usato una sterile, cannula in acciaio inox con una lama retrattile rimovibile per rimuovere una quantità rappresentativa del tessuto dalla bovina MG senza anestesia generale^{9,10,11 ,12}. Durante la procedura, lo strumento era collegato a un trapano cordless per creare una bassa velocità, il movimento di rotazione che tagliato in modo pulito un nucleo di tessuto come lo strumento è stato avanzato nel tessuto. Il beneficio era un tessuto più grande campione (70 mm x 4 mm di diametro, circa 0.75-1 g) ⁹. Un recente studio¹⁰ ha dimostrato che la procedura di biopsia descritta da V. C. Farret al. ⁹ può essere utilizzato per eseguire ripetuti collezioni di tessuto di MG senza impatto negativo sulla salute delle prestazioni e delle mammelle delle vacche da latte durante l'allattamento. Più di recente, un Studio¹⁴ è stato effettuato nelle vacche da latte per valutare le biopsie ripetute del MG con un trequarti più grande (31 cm lungo, esterno diametro di 9,5 mm, diametro interno di 8 mm) con vuoto applicato a una cannula interna in acciaio inox per raccogliere la biopsia . Questo metodo utilizzato (xilazina) sedazione e l'anestesia locale (2% lidocaina cloridrato).

La biopsia dell'ago è un'altra tecnica per raccogliere il tessuto mammario. Parecchi studi hanno adottato questa tecnica. Uno studio¹ utilizzato sedazione (detomidina) e anestetico locale (lidocaina 1%) nella procedura. Dopo la biopsia, le mucche hanno ricevuto un trattamento antibiotico profilattico. La ghiandola mammaria è stata massaggiata manualmente prima e dopo la mungitura. Sangue nel latte è stata osservata per 84 h dopo la biopsia. La quantità e la composizione del latte sono stati colpiti per un breve periodo di tempo. Recentemente, uno studio utilizzato un ago di biopsia per eseguire le biopsie ripetute di MG in vacche da latte⁸. Sedazione (1% acepromazina, intramuscolare) e anestesia locale (2% lidocaina cloridrato, sottocutanea) sono stati somministrati agli animali. Gli animali non hanno ricevuto intramammaria farmaci o antibiotici prima o dopo la procedura, e non c'erano segni di infezione presso il sito di biopsia durante il periodo post-chirurgico. In questo studio, le biopsie ripetute bovine MG usando un ago avevano un minore impatto negativo sulla salute di produzione e delle mammelle di latte delle vacche da latte. In generale, la biopsia dell'ago sembra essere un metodo meno invasivo che lo strumento di biopsia di nucleo. Tuttavia, come osservato in precedenza, è essenziale per la tecnica di biopsia raccogliere un campione rappresentativo del tessuto di MG. La limitazione di una biopsia dell'ago è che una piccola quantità di tessuto bovino MG è ottenuta (circa 20-25 mg)^8,15.

Quasi tutti gli studi usato una combinazione di α-2 agonista sedazione e anestetico locale^8,9,10, se la biopsia era tramite un ago o un nucleo più grande. Nel bovino MG, la maggior parte delle terminazioni nervose sono associati con la pelle. Lo stimolo al tessuto parenchima è in gran parte tramite ricevitori di stirata con tipo sparsa un fibre nervose per rilevare dolore chirurgico acuto. Di conseguenza, meccanismi fisiologici del dolore a causa di manipolazione chirurgica del MG è via della pelle e dei tessuti sottocutanei³ e tessuti non profondi come tessuto parenchimatico. Pertanto, per le procedure di biopsia, solo è necessario anestetizzare localmente la pelle ed i tessuti sottocutanei, come infiltrazione di anestetico locale nei tessuti più profondi non riduce significativamente il dolore chirurgico. Dopo un'adeguata preparazione della zona di biopsia, disagio animale è, in primo luogo, associato con moderazione.

Raccolta dei più grandi campioni di nucleo può aumentare la formazione dell'ematoma e aumentare il rischio di infezione all'interno del parenchima di MG. Di conseguenza, peri-operatorio protocolli includono spesso la somministrazione di antibiotici parenterali⁷, sebbene questo non sia "universali"⁸. Raggiungimento del hemostasis è anche un fattore importante per ridurre la morbilità di mucca. Nello studio sopra usando un grosso nucleo biopsia strumento¹⁴, pressione manuale è stato applicato al sito di biopsia e un reggiseno di mucca è stato usato per applicare del ghiaccio per le ferite per almeno 2 h dopo la procedura. Nonostante la grande quantità di tessuto raccolto, sono state osservate solo lievi riduzioni in mangime resa di aspirazione e latte, e la procedura è stata ripetuta ogni tre settimane senza effetti negativi sulla salute delle bovine.

Ricercatori di effettuazione della biopsia di MG nelle vacche da latte è necessario prendere in considerazione la qualità diagnostica o analitica della biopsia risultante, facilità di tecnica e la morbosità di mucca. Tecniche chirurgiche accurate e pre-pianificate sono imperative per raggiungere questi obiettivi. Fino ad oggi, gli studi di biopsia di MG sono imperniati sulla descrizione risultati di biopsia, rispetto che descrive la tecnica di biopsia stessa, e descrizioni per vacche da latte in lattazione sono prive di dettagli sufficienti per consentire la replica. Così, l'obiettivo di questo lavoro era di descrivere sia la biopsia dell'ago e più grandi tecniche di biopsia di nucleo in maniera sufficientemente dettagliata per consentire la replica sicuro e umana della biopsia di MG del bestiame.

Protocollo

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dalla Virginia Tech istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC).

1. il personale

1. Avere almeno due assistenti con esperienza chirurgica e movimentazione di mucca.
2. Tutti gli assistenti treno almeno tre volte, se possibile utilizzando materiale cadaverico, prima dell'esecuzione delle procedure connesse con questo protocollo sugli animali vivi.
   Nota: Formazione dovrebbe essere condotta da un istruttore che è stato precedentemente addestrato ed eseguita la tecnica.
3. Hanno un grande animale veterinario a portata di mano per la somministrazione di farmaci e nel caso in cui tale trattamento di emergenza diventa necessario durante la procedura. Emergenze che possono verificarsi durante questa procedura includono ma non sono limitate a: emorragia, overdose di α-2 agonisti ed edema polmonare, rigurgito e aspirazione di materiale alimentare, dolore e resistenza che richiedono ulteriore sedazione del paziente.

2. preparazione degli strumenti chirurgici, i rifornimenti e struttura

1. Inventario e acquistare tutte le attrezzature e forniture (Vedi Tabella materiali).
2. Pulito e teli chirurgici autoclave, strumenti di biopsia, titolari di bisturi, asciugamani chirurgici e forcipe.
3. Hanno un scivolo squeeze correttamente dimensionato e cancello di testa per trattenere le mucche.
4. Stabilire uno spazio di lavoro con un tavolo vicino lo scivolo di squeeze.
5. Assicurarsi che l'area di lavoro è pulito e ha limitato la mucca al traffico.
6. Organizzare le attrezzature ed i rifornimenti nello spazio di lavoro per un facile accesso.
7. Avere un'illuminazione adeguata all'interno dello spazio di lavoro.

3. preparazione degli animali

1. Un giorno prima della biopsia programmata, lavare e spazzolare l'animale, in particolare la mammella per rimuovere il letame e materiale sporco.
2. Seguire le procedure per contenimento sicuro e umano del bestiame.
3. In anticipo la biopsia e nuovamente al momento della biopsia, valutare la salute, la condizione fisica e il comportamento dell'animale.
   Nota: Un esame minimo include temperatura, impulso e le frequenze respiratorie così come esame per dermatite sopra il sito chirurgico proposto o di altri settori di infezione batterica. Raccogliere campioni di latte da ogni trimestre e verifica per mastite.
4. Utilizzare solo mucche sane.
5. Completamente mungi la mucca.
6. Spostare l'animale nello scivolo squeeze, idealmente entro 2 h di mungitura per ridurre al minimo la presenza di latte nelle ghiandole.
7. Trattenere l'animale con un cancello di testa.

4. analgesia e sedazione

1. Posizionare una cavezza corda sulla testa della mucca per impedire all'indietro e movimento in avanti.
2. Tirare la testa dell'animale da un lato e legare la corda per lo scivolo di spremere utilizzando un nodo di sgancio rapido per tenere la testa a posto.
3. Pulire l'area di iniezione con un tampone di alcool isopropilico al 70% e amministrare flunixin meglumina (1,1-2,2 mg/kg di peso corporeo) per via endovenosa tramite il preventivo di 15-20 min di vena giugulare alla biopsia.
   Nota: In alcuni protocolli, farmaci anti-infiammatori sono amministrati dopo la biopsia se farmaci anti-infiammatori non influenzerà i risultati della ricerca.
   1. Individuare la vena giugulare.
   2. Sollevare la vena giugulare mediante applicazione di pressione alla base della scanalatura giugulare.
   3. Controllare per assicurarsi che non ci sono bolle nella siringa.
   4. Inserire l'ago nella vena giugulare sollevata e disegnare due volte 0,5 mL di sangue nella siringa e mescolare con il contenuto. Se nessun sangue nella siringa, riposizionare l'ago. Se l'ago è residente nella vena, iniettare il contenuto.
   5. Rimuovere delicatamente l'ago.
   6. Applicare garza con una leggera pressione sul sito di iniezione per prevenire il sanguinamento.
4. Somministrare per via endovenosa xilazina cloridrato (0,01-0,05 mg/kg di peso corporeo) nel vaso coccygeal circa 5-10 min prima della biopsia per consentire tempo sufficiente per l'istituzione della sedazione.
   Attenzione: Controllare l'animale per segni di edema polmonare. I segni clinici dell'edema polmonare comprendono distress respiratorio, dispnea severa, difficoltà respiratorie, tosse, espettorato schiumoso e lingua blu. Se si osservano segni di edema polmonare, si consiglia di utilizzare tolazine (2-4 mg/kg di peso corporeo) per invertire gli effetti di xilazina.
   1. Sollevare la coda e pulire l'area di iniezione con un tampone di alcool isopropilico al 70%.
   2. Controllare per assicurarsi che non ci sono bolle nella siringa.
   3. Inserire l'ago nel vaso coda, disegnare 0,2 mL di sangue nella siringa e mescolare con il contenuto affinché che l'ago è residente nel vaso. Se l'ago è residente nel vaso, iniettare il contenuto della siringa.
   4. Rimuovere delicatamente l'ago.
   5. Applicare garza con una leggera pressione al sito di iniezione.

5. preparazione del sito di biopsia

1. Avere un assistente di legare la coda per la procedura.
2. Selezionare il sito di biopsia della mammella (in genere in un'area superiore per minimizzare la raccolta di tessuto connettivo e per evitare la penetrazione nella cisterna della ghiandola, Figura 1) e rimuovere qualsiasi materiale sporco o letame dal sito di biopsia selezionato.

Figura 1 . Immagine della mammella bovina che illustrano il sito di biopsia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

3. Osservare e palpare la pelle con particolare attenzione per identificare qualsiasi grandi vasi sanguigni sottocutanei per evitare questi vasi durante la biopsia.
4. Tagliare i capelli da un'area di 15 x 15 cm attorno al sito di biopsia.
5. Preparare l'area di biopsia con povidone-iodio (0,75% iodio disponibile) o clorexidina gluconato scrub. Si alternano con alcool isopropilico al 70% almeno tre volte a rimuovere tutti i detriti visibili e invisibili. Applicare la soluzione asettica macchia e alcool isopropilico in un movimento circolare con approccio inside out. Assicurarsi che la soluzione antisettica macchia rimane a contatto con la pelle per almeno 5 min.
6. Utilizzare una farfalla set di infusione con un ago da 18 G per depositare 6 mL di lidocaina cloridrato 2% per via sottocutanea al sito di incisione per creare un blocco di riga. Non penetrano nei tessuti più profondi.
   Nota: Il dosaggio di lidocaina varia fra 3 e 8 mL.
7. Consentire l'anestetico locale diffondere per 3 a 5 min di eseguire un'altra ripetizione di soluzione di macchia e di alcool prima dell'incisione. Durante l'attesa, preparare gli strumenti di biopsia.

6. procedura di biopsia

1. Utilizzare tecniche asettiche nella movimentazione degli utensili di biopsia e per l'incisione.
2. Lavarsi le mani per rimuovere tutta la contaminazione visibile e applicare guanti chirurgici sterili.
3. Organizzare gli strumenti chirurgici in area sterile in ordine di utilizzo. Avere un bisturi numero 10, garza sterile, uno strumento assemblato biopsia e un asciugamano sterile per l'emostasi.
   Nota: Seguire procedura 1 per eseguire una biopsia Core o 2 procedura per eseguire una biopsia dell'ago.

Figura 2 . Rappresentazione schematica di assemblaggio e installazione dello strumento di biopsia nucleo descritto da V. C. Farr, et al. ⁹ barra della scala è 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Strumento di biopsia di nucleo (Farr et al.⁹)
   1. Montare lo strumento di biopsia core utilizzando guanti sterili (Figura 2).
      1. Mettere i 7 pezzi sterili su un telino sterile (Figura 2A).
      2. Inserire la lama (parte 1) il sistema di aggancio sulla parte 2 (Figura 2B ).
         Attenzione: Non mettere le dita direttamente nella linea di lama.
      3. Inserire il pezzo 3 sopra pezzo 2 (Figura 2) garantendo che vengano allineate la docking station.
         Nota: Osservare un sistema di aggancio a muro interno del pezzo 4 (Figura 2D).
      4. Coinvolgere il bordo finale della lama (parte 1) nel sistema di ancoraggio del pezzo 4 (Figura 2D).
      5. Spingere in avanti il pezzo 4 e osservare se il pezzo 4 è accanto al pezzo 3 (Figura 2E).
      6. Inserire il pezzo 5 sul dispositivo (lama + pezzo 2) (Figura 2F).
      7. Garantire che la docking station è allineata (Figura 2).
      8. Inserire il pezzo 6 nella parte superiore del pezzo 2 (lato opposto della lama) (Figura 2 H)
      9. Garantire che la docking station è allineata (Figura 2 H).
      10. Inserire la vite di bloccaggio (pezzo 7) nell'alloggiamento (Figura 2I).
      11. Spingere in avanti il pezzo 3 (nero) per coprire la vite di bloccaggio.
          Attenzione: Non mettere le dita all'uscita della lama.
      12. Attivare lo strumento spingendo in avanti il pezzo 4 e osservare la lama di fuori lo strumento.
      13. Tirare indietro pezzo 4 per ritrarre la lama nell'apposito attrezzo (pronto per l'uso).
          Nota: La lama deve essere attivata solo quando lo strumento ha penetrato la distanza desiderata all'interno del tessuto di essere biopsiato.
   2. Assicurarsi che la mucca è sufficientemente sedata e il sito di biopsia è sufficientemente anestetizzato. Pizzicare la pelle per non garantire nessuna reazione.
   3. Praticare un'incisione verticale di 2-3 cm attraverso la pelle ed i tessuti sottocutanei da prossimale a distale usando un bisturi numero 10.
   4. Collegare lo strumento di biopsia di un trapano a batteria utilizzando una tecnica sterile.
   5. Posizionare la punta contro lo strumento di biopsia e verifica se lo strumento è saldamente attaccato al trapano.
   6. Garantire un'adeguata moderazione avendo un individuo elevare la coda durante tutta la procedura.
   7. Accendere il trapano con rotazione in senso orario e a bassa velocità.
      Nota: Il trapano non è sterile, e l'operatore non rimane sterile quando si utilizza il trapano.
   8. Far avanzare lo strumento intero biopsia (circa 7,5 cm) nella mammella attraverso l'incisione mentre il trapano è in rotazione il pedaggio.
   9. Spegnere il trapano ed estendere manualmente il pezzo 4 dello strumento.
   10. Accendere il trapano con rotazione in senso orario e bassa velocità.
   11. Rimuovere lo strumento contenente il nucleo di tessuto dalla mammella.
   12. Applicare pressione forte immediatamente la ferita utilizzando un panno sterile per almeno 20 min.
       Nota: Eseguire questo con loro pugno per garantire un'adeguata pressione viene applicata e dispone di un assistente.
   13. Rimuovere il tessuto da strumento di biopsia usando la pinzetta.
   14. Mantenere il campione in 1 tampone fosfato x Salina e valutare la quantità di tessuto.
   15. Prendere i segni vitali di mucca ogni 10 min dopo la biopsia per almeno 30 min.
   16. Verifica per sanguinamento dopo 20 min di pressione sul sito di biopsia. Se ci sono gocce di sangue continuano a esercitare una pressione per altri 5-10 min.
   17. Chiudere le incisioni utilizzando punti in acciaio inossidabile a intervalli di 5 mm dopo tutto lo spurgo ha smesso. Utilizzare tra 5 e 8 graffette.
   18. Applicare un bendaggio di aerosol per l'area di biopsia.
   19. Osservare l'animale per 50 min dopo la procedura.
5. Strumento di biopsia dell'ago
   1. Seguire le istruzioni del produttore per il dispositivo.
   2. Rimuovere l'ago di biopsia dal pacchetto usando tecniche sterili.
   3. Se non si osserva alcun danno, smaltire l'ago.
   4. Collegare l'ago al dispositivo.
   5. Chiudere il coperchio e gallo il dispositivo.
   6. Assicurarsi che la mucca è sufficientemente sedata e il sito di biopsia è sufficientemente anestetizzato. Pizzicare la pelle per non garantire nessuna reazione.
   7. Praticare un'incisione verticale di 1-2 cm attraverso la pelle ed i tessuti sottocutanei da prossimale a distale usando un bisturi numero 10.
      Nota: L'incisione per lo strumento di biopsia dell'ago può essere più piccolo (1-2 cm) rispetto a quello dello strumento di biopsia di nucleo.
   8. Inserire l'ago di biopsia dell'incisione (circa 10 a 13 cm dalla pelle).
   9. Attivare il dispositivo per biopsia dell'ago per raccogliere il tessuto.
   10. Rimuovere l'ago dalla mammella.
   11. Applicare pressione immediata, forte la ferita usando un asciugamano sterile per almeno 20 min.
   12. Rimuovere il tessuto dall'ago biopsia usando la pinzetta.
   13. Mantenere il campione in 1 tampone fosfato x Salina e valutare la quantità di tessuto.
   14. Prendere i segni vitali ogni 10 min dopo la biopsia per almeno 30 min.
   15. Verifica per sanguinamento dopo 20 min di pressione sul sito di biopsia.
   16. Chiudere le incisioni utilizzando punti in acciaio inossidabile ha smesso di sanguinamento dopo tutto.
   17. Applicare un bendaggio di aerosol per l'area di biopsia.
   18. Osservare l'animale per 50 min dopo la procedura.

7. post-biopsia cura degli animali

1. Documentare tutti i farmaci somministrati agli animali.
   Nota: Il latte è stato scartato durante un periodo di 36 h dopo la procedura; ritiro di carne era 4 d. periodi di sospensione per il latte e la carne possono variare a seconda del paese o giurisdizione e farmaci utilizzati. Si prega di controllare regolamenti e normative locali.
2. Verificare la presenza di sangue nel latte per 7-10 d dopo la biopsia.
3. Coaguli di sangue striscia a mano dal quartiere biopsiato alle successive mungiture e garantire che il latte completo rimozione si verifica.
   Nota: Si prevede la presenza di coaguli di sangue dal quartiere biopsiato per 1-3 mungiture seguendo la procedura. Sangue nel latte può essere osservato per 1 a 6 d dopo la biopsia.
4. Osservare il latte resa, e se possibile, l'individuale giornaliera ingestione alimentazione fino a graffette chirurgiche sono state rimosse.
5. Monitorare l'animale due volte al giorno per la temperatura corporea, la respirazione e frequenza cardiaca e contegno fino a graffette chirurgiche sono state rimosse.
6. Controllare il sito di biopsia due volte al giorno per gonfiore, tenerezza e segni di drenaggio fino a quando non sono state rimosse le graffette chirurgiche. Se questi sono osservati, consultare un veterinario.
   Nota: Pulire il sito di biopsia e riapplicare la benda di aerosol ogni uno a tre giorni se necessario.
7. Rimuovere i punti metallici dal sito di incisione 10 a 14 d dopo la biopsia, a seconda del tasso di guarigione.
8. Se si osservano segni di infezione locale o sistemica, consultare un veterinario.

Risultati

Nel presente protocollo, la tecnica di biopsia core prodotto campione di tessuto da 200 a 600 mg, mentre la biopsia dell'ago prodotto campioni di 10 a 30 mg per la biopsia. Gli animali sono stati osservati due volte al giorno per 10 d dopo la procedura. Nessuna complicazione si è verificato durante la procedura o nel periodo post-operatorio, con parametri vitali delle mucche rimanendo entro i limiti normali (media frequenza respiratoria = 31,4 ± 7.04 (SD) respiri / min, frequenza cardiaca media = 75,9 ± 8,9 battiti al min e media temperatura rettale = 38,2 ± 0,68 ° C, Figura 3).

A seguito di pressione manuale sulla zona di biopsia per ottenere l'emostasi (circa 25 min), la ferita aperta ha mostrato minimo sanguinamento (Figura 4). Le mucche sono state alimentate la stessa dieta ad libitum, e gli animali sono stati tenuti nella stessa struttura di alloggiamento durante il periodo post-operatorio. Gli animali non hanno mostrato segni di infezione al sito di biopsia; non c'era nessun dolore, sanguinamento, gonfiore, drenaggio o temperatura elevata (Figura 5). La ferita è guarita entro 8-10 d della biopsia (Figura 5).

Un animale sviluppato irritazione della pelle dovuta alla ferita strofinando il giorno 8 dopo la procedura. Questa mucca è stata trattata con la pulizia del sito di biopsia utilizzando soluzione povidone-iodio e alcol isopropilico al 70%. I punti metallici in acciaio inox sono stati rimossi per consentire il drenaggio e unguento di povidone iodio (1%) è stato applicato due volte al giorno sul sito di biopsia per 2 o 3 d. L'irritazione cutanea è sparito 2 d dopo l'applicazione di unguento di povidone-iodio e la ferita è guarita senza ulteriori complicazioni.

Coaguli di sangue sono stati rimossi a mano stripping del latte dal quartiere biopsiato prima macchina mungitura. Nel presente protocollo, la presenza di coaguli di sangue nel latte è stata osservata per fino a tre mungiture (circa 36 h) dopo la biopsia. Contaminazione di sangue del latte è stata osservata fino a 48 h dopo la biopsia. Non c'erano differenze visual osservate fra le biopsie core e dell'ago rispetto alla quantità di sangue nel latte. Gli animali non hanno mostrato una diminuzione significativa nella produzione di latte dopo la procedura (Figura 6). Composizione media di latte era 4,37% grasso, 3,34% di proteine e lattosio 4,64%. Il conteggio di cellule somatiche (SCC) di media di latte era meno di 200.000 cellule / mL.

Il tessuto di MG ottenuto può essere utilizzato per scopi di ricerca diversi quali colture cellulari primarie (Figura 7).

Figura 3 . Valutazione degli indicatori di salute degli animali dopo la biopsia della ghiandola mammaria bovina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 4 . Aspetto del sito di biopsia dopo pressione manuale è stata applicata alla zona di biopsia per ottenere l'emostasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 . Fotografie del sito di biopsia. (A) biopsia sito 3 d dopo la procedura di. (B) biopsia sito 6D dopo la procedura di. (C) biopsia sito 10 d dopo la procedura che illustrano che la ferita era guarita adeguatamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 . Produzione giornaliera di latte prima e dopo la biopsia della ghiandola mammaria bovina (n = 3 mucche). Un modello lineare calcola che 10 giorni prima della biopsia gli animali prodotte 23,35 kg di latte al giorno. La produzione di latte non è cambiato significativamente (P > 0,05) da 10 giorni prima a 10 giorni dopo la biopsia anche se un lieve aumento della produzione di latte è stata osservata (aumento di 0,0005 kg/d di latte per ogni giorno da 10 giorni prima della biopsia). Tre animali sono stati utilizzati in questo protocollo; un animale è stato biopsiato due volte (1 animale: nucleo biopsia sul lato sinistro della mammella e dell'ago biopsia sul lato destro della mammella) e due animali sono stati biopsiati una volta (animale 2 e 3: solo sul lato destro della mammella utilizzando la procedura core o ago). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 . Immagini rappresentative della cultura primaria delle cellule epiteliali mammarie bovina. Barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Core e ago biopsia metodi sono stati descritti in questo protocollo^9,16. Una valutazione dettagliata della salute animale e della incidenza di mastite¹⁴ prima della biopsia è necessaria per entrambe le procedure. Per scopi di ricerca, dovrebbe essere evitato eseguendo la tecnica in animali con evidenti segni di infiammazione o di malattie infettive. Questo ridurrà il rischio di complicazioni durante e dopo una biopsia. Tutti i dispositivi e gli strumenti biopsia dovrebbero essere puliti, disinfettati e sterilizzati per evitare la contaminazione del sito di biopsia. Prima della procedura, è necessario ridurre al minimo le infezioni sito chirurgico (SSI). In generale, SSI è associata con la morbosità animale, delle prestazioni e maggiori costi di produzione nelle vacche da latte. Studi precedentemente segnalati metodi per prevenire SSI a causa di biopsia compreso ritaglio i capelli attorno al sito di incisione, lavare l'area di biopsia per rimuovere la contaminazione^9,14e l'utilizzo di agenti antisettici (alcool al 70%, iodio chirurgico macchia⁹, clorexidina al 2% acetato soluzione¹⁴, 10% povidone-iodio⁸) per la preparazione della pelle. In alcuni studi, la somministrazione di antibiotici è stata adottata durante⁷ o immediatamente dopo la biopsia⁹; Tuttavia, la profilassi antibiotica non è stata utilizzata nel presente lavoro, e nessun infezioni del sito di biopsia sono stato osservato. Per evitare la contaminazione della biopsia della ferita, la coda deve essere fissata per evitare il contatto con il sito di biopsia fino a quando è stata applicata la benda di aerosol. In questo protocollo, graffette vengono rimossi circa 10 a 14 d dopo la biopsia.

Prima di una biopsia del centro, è importante impostare lo strumento correttamente e di allegarlo al trapano; scegliere una velocità di rotazione lenta, selezionare la rotazione in avanti e non utilizzare la modalità reverse del trapano. Durante la procedura, è importante utilizzare la pressione digitale su entrambi i lati dell'incisione per tenere separati i bordi della pelle e hanno un'incisione abbastanza a lungo per consentire l'entrata di strumento senza contatto con la pelle o il tessuto connettivo. Se questa procedura non viene eseguita, un trascinamento sui bordi incisione durante la rotazione dello strumento biopsia core può accadere e causare il trauma dei tessuti della pelle ulteriori che aumenterà il rischio di infezione e può ritardare la guarigione della ferita. Le procedure di biopsia presente descritte in questo protocollo sono state eseguite da una scheda certificata chirurgo animale grande. Le procedure sono state eseguite correttamente (Figura 5). Entrambe le tecniche sono relativamente facili e veloci da eseguire rispetto alla procedura di escissione chirurgica.

Sanguinamento dal sito della biopsia sono comuni dopo la biopsia di MG in vacche da latte^8,9,10,14. Nel presente protocollo, sanguinamento osservato era minima (Figura 4), che può essere dovuto l'applicazione di una pressione adeguata (forte) sulla ferita immediatamente dopo la procedura. È richiesta una forte pressione per almeno 20 min, e può essere richiesto per più di 30 min in alcuni casi. Se moderata a grave emorragia è osservata dopo l'applicazione di pressione al sito di biopsia, è consigliabile continuare a pressione e contattare immediatamente un veterinario.

Come l'emostasi è un fattore importante per ridurre la morbilità di mucca, uno studio pranzo emostatiche pastiglie al sito di biopsia per controllare lo spurgo⁹. Tuttavia, uso di tamponi emostatici in modo ha un alto rischio di potenziale contaminazione microbiologica nel settore lattiero-caseario. Un altro studio¹⁴ manuale pressione applicata al sito di biopsia tra le biopsie ripetute e dopo la chiusura di biopsia e la pelle e applicare ghiaccio al sito per almeno 2 h dopo la biopsia. Nel presente protocollo, la forte pressione applicata al sito di biopsia per 20-25 min era adeguata per controllare lo spurgo.

Una tecnica di successo biopsia dovrebbe provocare minimo sangue nel latte che persiste per un breve periodo di tempo dopo la procedura. Per evitare un'interruzione della secrezione di latte durante le infezioni di delusione e mastite latte, coaguli di sangue intramammaria dovrebbero essere rimosso a mano stripping dal biopsiato trimestre^10,14. Nel presente protocollo, il sangue è stato osservato nel latte fino a 48 ore dopo la biopsia. Tuttavia, in uno studio che ha utilizzato un numero maggiore di animali, sangue nel latte è stata osservata nella maggior parte delle mucche per meno di 6 giorni. Alcuni animali hanno mostrato sangue nel latte dopo 6 giorni⁸. Per questo motivo, osservazione quotidiana dell'apparenza di latte è necessario per 6 d dopo la procedura. Animali non hanno esibito i segni di mastite infezione quando un campione di tessuto grande è stato ottenuto¹⁴. Tuttavia, la ricerca precedente che ha eseguito le biopsie ripetute sull'animale stesso utilizzando un ago trovato che tale incidenza di infezioni di mastite era circa il 12% dopo la procedura⁸. Nel presente protocollo, né animale aveva segni visivi dell'infezione di mastite clinica dopo la procedura. C'è anche una lieve possibilità che il sito di incisione può infettarsi dopo la biopsia.

Tolazoline cloridrato, un farmaco che inverte gli effetti della sedazione, dovrebbe essere disponibile in caso di sovradosaggio da xilazina. Un'eccessiva dose di xilazina può causare edema polmonare. I segni clinici dell'edema polmonare comprendono afflizione respiratoria, dispnea severa, difficoltà respiratorie, tosse ed espettorato schiumoso. Se si osservano segni di edema polmonare, si consiglia di utilizzare tolazine (2-4 mg/kg di peso corporeo) per invertire gli effetti di xilazina.

Il presente protocollo descrive la tecnica per eseguire una biopsia dell'ago e la biopsia del centro. In generale, il vantaggio di una biopsia del centro rispetto alla biopsia dell'ago è il più grande del tessuto campione (0.75-1 g)⁹ con minimi effetti negativi sulla salute della mammella. La biopsia dell'ago è un metodo meno invasivo che lo strumento di biopsia di nucleo. Tuttavia, la biopsia più tentativi ottenere una maggiore quantità di tessuto utilizzando che una procedura di biopsia dell'ago può aumentare il rischio di sanguinamento maggiore dopo la procedura, come pure i coaguli di sangue nel latte. Entrambe le tecniche causato morbosità minima mucca e facilmente sono stati raggiunti con una formazione minima del personale chirurgico. Un cambiamento a breve termine di resa di latte giornaliera (8-10% diminuzione) e sua composizione⁹ e assunzione di mangime riduzione¹⁴ è previsto dopo le biopsie core e ferri, rispettivamente. Limitazioni della procedura di biopsia dell'ago sono il piccolo volume di tessuto asportato con l'ago. Lo strumento deve essere attivato solo quando l'ago è all'interno del tessuto di essere biopsiati e molteplici tentativi spesso sono necessari per ottenere un'adeguata quantità di tessuto, che aumenta il rischio di sangue nel latte e la mastite dopo la procedura. Limitazioni della biopsia core includono un elevato rischio di emorragia dopo la procedura in se una grande quantità di tessuto (> 200 mg) è ottenuta. Inoltre, lo strumento di biopsia è più difficile da montare che richiedono una formazione adeguata prima dell'uso.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Isopropyl alcohol	Walmart	565106257	1 L
Aerosol spray to kill and repel flies	MWI	14339	1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm	C. R. Bard	MN1216	2
Butterfly infusion set (18 G needle)	Fisher	22-258087	1
Cell culture dishes	Fisher	08-772E	4
Cordless drill (low speed)	Hitachi	DS10DFL	1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996)			2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows			cattle healthy
Flunixin meglumine	MWI/VetOne	501018	1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table	Amazon		1
Forceps	Fisher	09-753-50	1
Gloves non-sterile	Fisher	17-200-845	9, size dependent
Hard brush	Sullivan Supply	18270	1, to wash the cows
Head gate			1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable	MWI/VetOne	510212	6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash	eZall Technologies	39384	1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“)	Fisher	14-821-15A	6
Needle 20 G (1 to 1/5“)	Fisher	14-815-526	6
Phosphate buffered saline (0.9%)	Fisher	20-012-043	1 L
Povidone Iodine ointment	Jeffers	#VED1A	500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine)	MWI/VetOne	510094	1 L
Reusable biopsy instrument	C. R. Bard	MG1522	1
Rope halter	Nasco farm and ranch	C10852	2, cow size
Scalpel blades (#10)	MWI	033870	2
Scalpel holders (#3)	MWI	602008	1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in.	Fisher	19-130-0038	1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges	Fisher	22-037-986	4
Sterile gauze pads	Fisher	19-090-735	4
Sterile surgical gloves	Surgical gloves	19-166-679	3,  size dependent
Sterile surgical towels	Fisher	50-118-0339	6
Stethoscope	Littmann Master Classic II	1392	1
Surgical clipper	Oster A5	078005-010-003	1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 )	Oster	78919-016	1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover	MWI	541	1
Surgical stapler pre-loaded	MWI	17713	5
Syringes of 10 mL	Fisher	14-823-224	3
Syringes of 2 mL	Fisher	22-028854	3
Syringes of 20 mL	Fisher	22-034507	3
Syringes of 5 mL	Fisher	22-028855	3
Thermometer	Agri-Pro Enterprises Inc	72000	1
Tolazine hydrochloride	Akorn Animal Health	61311-486-10	2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer	Fisher	14-955-025	1, for handle the tissue sample
Water hose	Miracle-Gro, Walmart	554990501	1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg)	MWI	010728	1 bottle
Xylazine hydrochloride	MWI/VetOne	510650	0.01 to 0.05 mg/kg of body weight