Proteína quinasa c-Delta inhibidor péptido formulación usando nanopartículas de oro

Resumen

Anteriormente hemos utilizado un híbrido de péptido nanopartículas de oro para entregar por vía intravenosa un péptido sintético, inhibidor de proteína cinasa C-delta, que reduce la lesión pulmonar aguda inducida por isquemia-reperfusión. A continuación os mostramos el protocolo detallado de la formulación de la droga. Otros péptidos intracelulares pueden ser formuladas de manera similar.

Resumen

Inhibidores de proteína quinasa c-Delta (PKCδi) es un fármaco prometedor para evitar lesiones de órgano inducida por isquemia-reperfusión. Generalmente se conjuga a un penetración de célula péptido, TAT, para la entrega intracelular. Sin embargo, TAT ha mostrado actividad biológica no específica. Nanopartículas de oro (SPNG) pueden utilizarse como portadores de drogas entrega sin toxicidad reconocida. Por lo tanto, hemos utilizado un híbrido de GNP/péptido para entregar PKCδi. Dos cortos péptidos (P2: CAAAAE y P4: CAAAAW), en una proporción de 95: 5, fueron utilizados para modificar las propiedades superficiales del PNB. SPNG conjugado con PKCδi (GNP/PKCi) es estables en agua destilada 0,9% NaCl y el tampón fosfato salino (PBS) con albúmina sérica bovina o suero bovino fetal. La inyección intravenosa de GNP-PKCi fue demostrada previamente para evitar lesiones de isquemia-reperfusión pulmonar. Este artículo describe un protocolo para GNP/PKCi de formular y evaluar las propiedades fisicoquímicas de GNP/PKCi. Hemos utilizado métodos similares para formular otros fármacos basados en péptidos con el PIB. Este artículo que sacarán más atención a esta tecnología de entrega de nuevas drogas intracelular y sus aplicaciones en vivo.

Introducción

Trasplante de pulmón guarda a pacientes con fase final pulmón enfermedad¹. Sin embargo, complicaciones serias después de trasplante de pulmón siguen siendo un obstáculo. En las primeras etapas después del trasplante del pulmón, la disfunción primaria del injerto es la complicación más perjudiciales¹, y su principal causa es la isquemia-reperfusión (IR)-inducida de lesión pulmonar aguda².

Bajo conservación en frío, el metabolismo en el pulmón de un donante es restringido a un nivel muy bajo. Sin embargo, la síntesis de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno se activan debido a la cesación del flujo de sangre³. Después del trasplante, se restablece la circulación de la sangre, y especies reactivas del oxígeno y el óxido nítrico generado durante la isquemia fría mejoran la inflamación y muerte celular, dando por resultado la lesión del tejido.

Para evitar lesiones de IR, se ha utilizado un inhibidor de proteína cinasa Cδ (PKCδi) en el corazón, cerebro y pulmón^4,5,6,7,8. Estos estudios demostraron que el PKCδi disminuido la inflamación y la apoptosis durante la reperfusión. También ha impedido pulmonar lesiones IR en ratas y en un modelo de trasplante pulmonar⁶. PKCδi generalmente se conjuga con un penetración celular péptido, TAT, para la entrega intracelular. Sin embargo, se ha demostrado que el péptido de TAT solo tiene efectos biológicos no específicos, incluyendo la promoción de la angiogénesis, apoptosis y la inhibición de múltiples citoquinas^9,10,11. Nanopartículas, pequeñas partículas que van desde 1 a 100 nm de diámetro¹², han sido exploradas como candidatos en la facilitación de entrega de drogas¹³. En particular, nanopartículas de oro (SPNG) son consideradas como no invasiva y no tóxico. Por lo tanto, hemos desarrollado SPNG como portadores de entrega de medicamentos de fármacos basados en péptidos^14,15.

La superficie de PNB puede ser manipulada para aplicaciones específicas como el reconocimiento molecular^16,17, sensores químicos¹⁸, imagen¹⁹y entrega de la droga. Se ha desarrollado un sistema híbrido de GNP/péptido, que contiene 20 nm SPNG y dos péptidos cortos (P2: CAAAAE y P4: CAAAAW) en una proporción de 95: 5, para modificar las propiedades superficiales de PNB. El péptido de la P2, con el cargado negativa el ácido glutámico (E) al final, estabiliza el SPNG en una solución acuosa, y el péptido de P4, con el triptófano hidrofóbico (W) al final, ayuda a PNB entrada en células¹⁴. El residuo de cisteína (C) en el término de N de estos péptidos contiene un grupo tiol que puede conjugar a las superficies del oro¹⁴. Este híbrido de péptido y PNB se utilizó más para entregar PKCδi (CSFNSYELGSL). La relación molar optimizada de P2:P4 a PKCδi es 47.5:2.5:50. SPNG conjugado con PKCδi (GNP/PKCi) son estables en agua destilada, 0.9% NaCl y PBS con albúmina bovina o suero bovino fetal¹⁴. La inyección intravenosa de GNP/PKCi se ha demostrado para prevenir lesiones de isquemia-reperfusión del pulmón¹⁵. Este artículo describe un método para formular GNP/PKCi y describe cómo evaluar las propiedades fisicoquímicas de GNP/PKCi. Hemos utilizado métodos similares para formular otros fármacos basados en péptidos conjugados a GNP^20,21,22. Esperamos que este artículo dibuja más atención a esta formulación novedosa para la entrega intracelular de la droga.

Protocolo

1. preparación de soluciones de péptido

1. Recuperar los péptidos (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) del congelador de-20 ° C y descongelar a temperatura ambiente (RT).
   Nota: Mantenga el frasco cerrado para evitar que la humedad de condensación en los péptidos.
2. Pesar 0.01 g de cada péptido en una microescala. Poner cada péptido en un tubo cónico de 50 mL separadas.
3. Añadir 18,74 mL de agua desionizada (DI) al tubo de P2.
4. Añadir 16,93 mL de agua desionizada al tubo P4.
5. Añadir 8,21 mL de acetonitrilo 50% diluido en agua desionizada para el tubo de PKCδi.
6. Vortex brevemente las soluciones de péptido. Poner los tubos cónicos de 50 mL en un sonicador (40 MHz) durante 5 minutos.
7. Llevar las soluciones de péptido a un gabinete de bioseguridad. Todas las soluciones de péptido preparadas deben ser de 1 mm.
8. Transferir 1 mL de cada solución del péptido a un nuevo tubo cónico de 50 mL. 19 mL de agua desionizada en los tubos de P2 y P4 y añadir 19 mL de acetonitrilo 50% al tubo de PKCδi, tal que cada solución es diluida a 50 μm y almacenado en su propio tubo.

2. formulación de PNB/PKCi

1. Péptidos se deben agregar a la solución de GNP mientras que todavía en el BSC
2. Añadir 475 μL de P2, 25μL de P4 y 500 μL de solución de δPKCi en un tubo de 15 mL. Añadir 9 mL de solución de GNP de 20 nm (7.0x10¹¹ partículas/mL) en el mismo tubo de 15 mL.
3. La salida del gabinete de seguridad de la biotecnología. Envuelva el tubo de 15 mL con papel de aluminio. Dejarlo toda la noche en un agitador a temperatura ambiente.
4. Retomar las muestras la bioseguridad gabinete. Alícuota 1 mL de GNP/PKCi en cada microtubos de 1,5 mL.
5. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga durante 30 min a 15.294 x g a 4 ° C.
6. Retire el sobrenadante de cada tubo en un gabinete de bioseguridad.
   Nota: Tenga cuidado de quitar el sobrenadante asegurando que el GNP se mantiene intacta y no se aspira.
7. Vuelva a suspender el sedimento en el solvente deseado según la concentración necesaria. Aplicables disolventes pueden ser agua DI, PBS y 0.9% NaCl.
   Nota: A partir de 1 mL de GNP/PKCi, la pelotilla de GNP contiene 6.3 x 10¹¹ partículas, basadas en la concentración de GNP proporcionada por el fabricante. Administrar 1.3 x 10¹² partículas en 500 μl de 0.9% NaCl, añadimos 232 μl de 0.9% NaCl a cada uno de tres gránulos. Después de la les agrupación juntos, entonces podemos recolectar 500 μl de solución de GNP/PKCi.
   Nota: Mezcle el deseado solvente antes de diluir la pastilla de GNP/PKCi, de lo contrario GNP/PKCi será agregado.

3. evaluación de la PNB/PKCi híbrido solubilidad

1. Verter 0,5 mL de solución de GNP/PKCi en una cubeta de acrílico. Coloque la cubeta de acrílico en un espectrofotómetro UV-Vis y el pico de absorción¹⁵de prueba.

Resultados

Se debe evaluar las propiedades biofísicas del GNP/PKCi híbrido, como GNP tiende a agregado de solvente. Cuando se agrega GNP, el color de la solución cambia de color de rosa a púrpura (Figura 1a). Espectrofotómetro UV-Vis es capaz de detectar los cambios más sensible. Si GNP/PKCi no se agrega el pico de absorción debe ser en 525 nm (Figura 1b). Si se agrega el PNB, el pico de absorción se desplazan hacia la derecha. Como...

Discusión

Para garantizar la formulación correcta, es crucial que la solución de δPKCi sufre el paso de sonicación en 1.6. ΔPKCi secuencia de péptido contiene moléculas hidrofóbicas, por lo que un sonicador ayuda a disolver PKCi en la solución de 50% acetonitrilo. Además, es muy importante mezclar el solvente meticulosamente, como se indica en el paso 2.7.  El híbrido de GNP/PKCi no se bien formularán si estos pasos no se realizan correctamente, debido a la agregación del péptido δPKCi²³.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
negatively charged glutamic acid peptide (P2)	CanPeptide		Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
hydrophobic tryptophan peptide (P4)	CanPeptide		Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
δPKCi peptide	CanPeptide		Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
Conical tube(50ml)	Corning Life Sciences	3582070
Conical tube(15ml)	Corning Life Sciences	3582096
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004-100ML
Sonicator	Branson Ultrasonics Corp.	Branson 2510MTH
Microtube	Diamed.ca	AD 150-N
Gold nanoparticle solution	Ted Pella	15705-5	A particle size is 20nm
Rocking Platform shaker	VWR international	40000-304
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Acryl cuvette	SARSREDT	67.758
UV-Vis spectrophotometer	Agilent	Caty 60 UV-Vis