Protéine Kinase C-delta inhibiteur Peptide Formulation utilisant des nanoparticules d’or

Résumé

Nous avons déjà utilisé un hybride de peptide or nanoparticule à livrer par voie intraveineuse un peptide synthétique, un inhibiteur de protéine kinase C-delta, qui a réduit la lésion pulmonaire aiguë induite par l’ischémie-reperfusion. Ici, nous montrons le protocole détaillé de la formulation de médicaments. Autres peptides intracellulaires peuvent être formulées de la même façon.

Résumé

Inhibiteur de la protéine kinase C-delta (PKCδi) est un médicament prometteur pour prévenir toute blessure induite par l’ischémie-reperfusion orgue. Il est souvent conjugué à un peptide pénétration cellulaire, TAT, pour la délivrance intracellulaire. TAT a toutefois montré des activités biologiques non spécifiques. Nanoparticules d’or (PNB) peuvent servir comme entreprises de livraison de drogue sans toxicité reconnue. Par conséquent, nous avons utilisé un hybride de GNP/peptide pour livrer PKCδi. Deux courtes peptides (P2 : CAAAAE et P4 : CAAAAW), dans une proportion de 95 : 5, ont été utilisées pour modifier les propriétés de surface du PNB. PNB conjugués avec PKCδi (GNP/PKCi) sont stables dans l’eau distillée, 0,9 % NaCl et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant de l’albumine de sérum bovin ou de sérum de veau fœtal. Une injection intraveineuse de GNP-PKCi a déjà été démontrée pour prévenir l’ischémie-reperfusion du poumon. Cet article décrit un protocole pour formuler le GNP/PKCi et évaluer les propriétés physico-chimiques du GNP/PKCi. Nous avons utilisé des méthodes similaires à formuler d’autres médicaments à base de peptides dont le PNB. Cet article sera je l’espère attirer davantage l’attention à cette technologie de délivrance intracellulaire de nouveaux médicaments et de ses applications in vivo.

Introduction

Transplantation pulmonaire enregistre les patients avec la phase terminale de maladie pulmonaire¹. Toutefois, des complications graves après une greffe de poumon restent un obstacle. Dans les premiers stades, consécutive à une transplantation pulmonaire, dysfonction du greffon primaire est le plus nocif de la complication¹, et sa cause principale est l’ischémie-reperfusion (IR)-induite de lésion pulmonaire aiguë².

Sous conservation froide, métabolisme dans un poumon de donneur est limité à un niveau très bas. Toutefois, les espèces réactives de l’oxygène et la synthèse de l’oxyde nitrique sont activées en raison de la cessation de l' écoulement de sang³. Après la transplantation, la circulation sanguine est rétablie et les espèces réactives de l’oxygène et l’oxyde nitrique générée au cours de l’ischémie froide améliorent l’inflammation et la mort cellulaire, entraînant des lésions tissulaires.

Pour éviter toute blessure de IR, un inhibiteur Cδ protéine kinase (PKCδi) a été utilisé dans le coeur, le cerveau et le poumon^4,5,6,7,8. Ces études ont montré que PKCδi diminue l’inflammation et l’apoptose durant la reperfusion. Il a également empêché des blessures IR pulmonaire chez le rat et un poumon greffe modèle⁶. PKCδi est généralement conjugué avec un peptide pénétration cellulaire, TAT, pour la délivrance intracellulaire. Toutefois, il a été démontré que le peptide TAT seul a des effets biologiques non spécifiques, y compris la promotion de l’angiogenèse, l’apoptose et l’inhibition de plusieurs cytokines^9,10,11. Nanoparticules, particules allant de 1 à 100 nm de diamètre¹², ont été explorées comme candidats pour faciliter la livraison de drogue¹³. En particulier, les nanoparticules d’or (PNB) sont considérés comme non invasive et non toxique. Par conséquent, nous avons développé des PNB comme supports de livraison de drogue pour les médicaments à base de peptides^14,15.

La surface des PNB peut être manipulée pour des applications spécifiques telles que la reconnaissance moléculaire^16,17, détection chimique¹⁸, imagerie¹⁹et délivrance de médicaments. Un système hybride de GNP/peptide a été développé, contenant 20 nm PNB et deux petits peptides (P2 : CAAAAE et P4 : CAAAAW) à un ratio de 95 : 5, pour modifier les propriétés de surface des PNB. Le peptide P2, avec la charge négative l’acide glutamique (E) à la fin, stabilise le PNB dans une solution aqueuse, et le peptide de P4, avec le tryptophane hydrophobe (W) à la fin, aide des PNB entrée dans les cellules¹⁴. Les résidus de cystéine (C) à l’extrémité N terminale de ces peptides contient un groupe de thiol qui peut conjuguer les surfaces d’or¹⁴. Cet hybride de peptide/PNB a été utilisé pour fournir des PKCδi (CSFNSYELGSL). Le rapport molaire optimisé de P2:P4 à PKCδi est 47.5:2.5:50. PNB conjugués avec PKCδi (GNP/PKCi) sont stables dans l’eau distillée, 0,9 % NaCl et PBS contenant de l’albumine bovine ou sérum de veau fœtal¹⁴. Une injection intraveineuse de GNP/PKCi a été démontrée pour prévenir l’ischémie-reperfusion du poumon¹⁵. Cet article décrit une méthode pour formuler le GNP/PKCi et comment évaluer les propriétés physico-chimiques du GNP/PKCi. Nous avons utilisé des méthodes similaires à formuler d’autres médicaments à base de peptides conjugués au GNP^20,21,22. Nous espérons que cet article attirera davantage d’attention à cette nouvelle formulation pour la livraison de drogue intracellulaire.

Protocole

1. préparation des Solutions de Peptide

1. Récupérer les peptides (P2 : CAAAAE, P4 : CAAAAW, PKCδi : CSFNSYELGSL) du congélateur-20 ° C et décongélation à température ambiante (RT).
   Remarque : Conservez la bouteille fermée pour empêcher l’humidité de condensation sur les peptides.
2. Peser 0,01 g de chaque peptide sur un microscopique. Mettre chaque peptide dans un tube conique séparé de 50 mL.
3. Ajouter 18,74 mL d’eau désionisée de (DI) dans le tube de P2.
4. Ajouter 16,93 mL de l’eau distillée dans le tube de P4.
5. Ajouter 8,21 mL d’acétonitrile 50 % dilué dans l’eau distillée au tube PKCδi.
6. Vortex brièvement les solutions de peptide. Mettre les tubes coniques 50 mL dans un sonicateur (40 MHz) pendant 5 min.
7. Apporter les solutions de peptide à une armoire de sécurité biologique. Toutes les solutions de peptide préparées devraient être de 1 mM.
8. Transférer 1 mL de chaque solution de peptide dans un nouveau tube conique de 50 mL. Ajouter 19 mL de l’eau distillée dans les tubes de P2 et P4 et ajouter 19 mL d’acétonitrile de 50 % dans le tube de la PKCδi, telle que chaque solution est diluée à 50 µM et stockée dans son propre tube.

2. formulation du PNB/PKCi

1. Peptides devraient être ajoutés à la solution du GNP tout en restant dans le BSC
2. Ajouter 475 μL de P2, 25µL de P4 et 500 μl de solution de δPKCi dans un tube de 15 mL. Ajouter 9 mL de solution de GNP 20 nm (¹¹ 7.0x10 particules/mL) dans le même tube de 15 mL.
3. Sortie du cabinet de prévention des risques biotechnologiques. Enrouler le tube de 15 mL avec du papier aluminium. Laisser la nuit sur un agitateur à RT.
4. Retourner les échantillons à la biosécurité du cabinet. ML 1 aliquote du GNP/PKCi dans chaque microtubes de 1,5 mL.
5. Centrifuger les tubes dans un micro-centrifuge pendant 30 min à 15 294 x g à 4 ° C.
6. Retirez le surnageant de chaque éprouvette sous une armoire de sécurité biologique.
   Remarque : Veillez à enlever le surnageant tout en veillant à ce que le culot de GNP demeure intact et qu’il n’est pas aspiré.
7. Resuspendre le culot dans le solvant désiré selon la concentration requise. Solvants applicables peuvent être DI eau, PBS et 0,9 % NaCl.
   NOTE : À partir de 1 mL de GNP/PKCi, le culot de GNP contient 6,3 x 10¹¹ particules, basées sur la concentration de GNP fournie par le fabricant. Pour administrer 1,3 x 10¹² particules dans 500 µL de 0,9 % NaCl, nous ajoutons 232 µL de 0,9 % NaCl à chacun des trois pastilles. Après les regroupant, nous pouvons ensuite recueillir 500 µL de solution de GNP/PKCi.
   NOTE : Mélanger le désiré solvant bien avant de diluer le culot de GNP/PKCi, sinon le GNP/PKCi regroupera.

3. Evaluation des PNB/PKCi hybride solubilité

1. Verser 0,5 mL de solution de GNP/PKCi dans une cupule acryl. Placez la cuve acrylique sur un spectrophotomètre UV-Vis et tester le pic d’absorption¹⁵.

Résultats

Il faut pour évaluer les propriétés biophysiques de l’hybride de GNP/PKCi, comme GNP tend à agrégat dans le solvant. Lorsque GNP est agrégé, la couleur de la solution passe du rose au violet (Figure 1 a). Spectrophotomètre UV-Vis est capable de détecter les changements plus sensiblement. Si le GNP/PKCi n’est pas agrégé le pic d’absorption doit être à 525 nm (Figure 1 b). Si le PNB est agrégé, le pic d’absor...

Discussion

Afin d’assurer la bonne formulation, il est crucial que la solution de δPKCi subit l’étape de sonication décrite au point 1.6. Séquence peptidique δPKCi contient des portions hydrophobes, donc un sonicateur aide à dissoudre PKCi dans la solution de 50 % d’acétonitrile. En outre, il est très important de mélanger le solvant méticuleusement, comme indiqué dans l’étape 2.7.  Le GNP/PKCi hybride ne sera pas bien formulé si ces étapes ne sont pas faites correctement, en raison de l’agrégation du pept...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
negatively charged glutamic acid peptide (P2)	CanPeptide		Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
hydrophobic tryptophan peptide (P4)	CanPeptide		Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
δPKCi peptide	CanPeptide		Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
Conical tube(50ml)	Corning Life Sciences	3582070
Conical tube(15ml)	Corning Life Sciences	3582096
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004-100ML
Sonicator	Branson Ultrasonics Corp.	Branson 2510MTH
Microtube	Diamed.ca	AD 150-N
Gold nanoparticle solution	Ted Pella	15705-5	A particle size is 20nm
Rocking Platform shaker	VWR international	40000-304
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Acryl cuvette	SARSREDT	67.758
UV-Vis spectrophotometer	Agilent	Caty 60 UV-Vis