Proteina chinasi C-delta inibitore Peptide formulazione usando nanoparticelle d'oro

Riepilogo

In precedenza abbiamo usato un ibrido del peptide di nanoparticelle d'oro per consegnare per via endovenosa un peptide sintetico, inibitore della protein chinasi C-delta, che ha ridotto la lesione di polmone acuta indotta da ischemia-riperfusione. Qui vi mostriamo il protocollo dettagliato della formulazione di droga. Altri peptidi intracellulare possono essere formulate allo stesso modo.

Abstract

Inibitore della protein chinasi C-delta (PKCδi) è un farmaco promettente per evitare ferita indotta da ischemia-riperfusione dell'organo. Esso è solitamente coniugato ad un peptide cellula-penetrante, TAT, per consegna intracellulare. Tuttavia, TAT ha dimostrato attività biologiche non specifici. Nanoparticelle di oro (PNL) possono essere utilizzate come trasportatori di farmaci consegna senza tossicità riconosciuta. Di conseguenza, abbiamo usato un ibrido GNP/peptide per fornire PKCδi. Due brevi peptidi (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), con un rapporto di 95: 5, sono stati utilizzati per modificare le proprietà di superficie del PNL. PNL coniugato con PKCδi (GNP/PKCi) sono stabili in acqua distillata, 0,9% NaCl e tampone fosfato salino (PBS) contenente albumina di siero bovino o siero bovino fetale. L'iniezione endovenosa di GNP-PKCi precedentemente è stato indicato per impedire l'ischemia-riperfusione del polmone. Questo articolo descrive un protocollo per formulare GNP/PKCi e valutare le proprietà chimico-fisico di GNP/PKCi. Abbiamo usato metodi simili per formulare altri farmaci peptidici con PNL. In questo articolo si spera attirerà più attenzione a questa tecnologia di consegna di droga novella intracellulare e sue applicazioni in vivo.

Introduzione

Trapianto del polmone Salva i pazienti con stadio finale del polmone malattia¹. Tuttavia, le complicazioni serie dopo trapianto del polmone rimangono un ostacolo. Nelle prime fasi dopo il trapianto del polmone, disfunzione dell'innesto primario è il più nocivo di complicazione¹, e la sua causa primaria è l'ischemia-riperfusione (IR)-indotta di lesione polmonare acuta².

Sotto conservazione freddo, metabolismo in un polmone di donatore è limitato ad un livello molto basso. Tuttavia, specie reattive dell'ossigeno e sintesi di ossido nitrico sono attivati a causa la cessazione del flusso di sangue³. Dopo il trapianto, viene ripristinata la circolazione del sangue, e specie reattive dell'ossigeno e dell'ossido di azoto generati durante ischemia fredda che permettono di migliorare l'infiammazione e la morte cellulare, con conseguente danno tissutale.

Per evitare la lesione di IR, un inibitore della protein chinasi Cδ (PKCδi) è stato utilizzato nel cuore, cervello e polmone^4,5,6,7,8. Questi studi hanno dimostrato che PKCδi riduce l'infiammazione e gli apoptosi durante la riperfusione. Ha anche impedito ferita polmonare IR in ratti ed in un modello di trapianto del polmone⁶. PKCδi di solito è coniugato con un peptide cellula-penetrante, TAT, per consegna intracellulare. Tuttavia, è stato dimostrato che il peptide TAT da solo ha effetti biologici non specifici, compresa la promozione dell'angiogenesi, apoptosi e l'inibizione di più citochine^9,10,11. Nanoparticelle, piccole particelle che vanno da 1 a 100 nanometro di diametro¹², sono stati esplorati come candidati nel facilitare la droga consegna¹³. In particolare, nanoparticelle di oro (PNL) sono considerate come non invadente e non tossico. Pertanto, abbiamo sviluppato dei PNL come elementi portanti di consegna di droga per farmaci peptidici^14,15.

La superficie del PNL può essere manipolata per applicazioni specifiche quali riconoscimento molecolare^16,17, rilevamento chimico¹⁸, imaging¹⁹e consegna della droga. È stato sviluppato un sistema ibrido di GNP/peptide, contenente 20 nm PNL e due brevi peptidi (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW) con un rapporto di 95: 5, modificare le proprietà di superficie del PNL. Il peptide di P2, con la carica negativa acido glutammico (E), alla fine, si stabilizza la PNL in soluzione acquosa, e il peptide di P4, con il triptofano idrofobo (W) alla fine, aiuta PNL ingresso in cellule¹⁴. Il residuo di cisteina (C) al capolinea di questi peptidi N contiene un gruppo tiolico che sappia coniugare per le superfici in oro¹⁴. Questo ibrido di peptide/PNL è stato ulteriormente usato per fornire PKCδi (CSFNSYELGSL). Il rapporto molare ottimizzato di P2:P4 di PKCδi è 47.5:2.5:50. PNL coniugato con PKCδi (GNP/PKCi) sono stabili in acqua distillata, 0,9% NaCl e PBS contenente albumina bovina o siero bovino fetale¹⁴. L'iniezione endovenosa di GNP/PKCi ha dimostrato di prevenire l'ischemia-riperfusione del polmone¹⁵. Questo articolo descrive un metodo per formulare GNP/PKCi e verrà descritto come valutare le proprietà fisico-chimiche del GNP/PKCi. Abbiamo usato metodi simili per formulare altri farmaci peptidici coniugati a GNP^20,21,22. Speriamo che questo articolo attirerà più attenzione a questa formulazione novella per la consegna di droga intracellulare.

Protocollo

1. preparazione delle soluzioni di Peptide

1. Recuperare i peptidi (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) da-20 ° C e scongelare a temperatura ambiente (TA).
   Nota: Tenere il flacone chiuso per evitare che l'umidità da condensa sui peptidi.
2. Pesare 0,01 g di ciascun peptide su un Microscala. Mettere ogni peptide in una provetta conica da mL 50 separato.
3. Aggiungere 18,74 mL di acqua deionizzata (DI) sul tubo di P2.
4. Aggiungere 16,93 mL di acqua deionizzata al tubo P4.
5. Aggiungere 8,21 mL di acetonitrile 50% diluito in acqua distillata per il tubo di PKCδi.
6. Vortice brevemente le soluzioni del peptide. Mettere le provette coniche da 50 mL in un sonicatore (40 MHz) per 5 min.
7. Portare le soluzioni del peptide di una cappa di biosicurezza. Tutte le soluzioni del peptide preparate dovrebbero essere 1 mM.
8. Trasferire 1 mL di ciascuna soluzione del peptide in una nuova provetta conica 50 mL. Aggiungere 19 mL di acqua deionizzata a tubi di P2 e P4 e aggiungere 19 mL di acetonitrile 50% al tubo PKCδi, tale che ogni soluzione viene diluito a 50 µM e memorizzati in un tubo.

2. formulazione di PNL/PKCi

1. Peptidi dovrebbero essere aggiunto alla soluzione GNP mentre ancora in BSC
2. Aggiungere 475 μL di P2, 25μL di P4 e 500 μL di soluzione di δPKCi in una provetta da 15 mL. Aggiungere 9 mL di soluzione di 20 nm GNP (7.0x10¹¹ particelle/mL) per la stessa provetta da 15 mL.
3. Uscita la cappa di biosicurezza. Avvolgere il tubo da 15 mL con carta stagnola. Lasciarlo tutta la notte su un agitatore a RT.
4. Restituire i campioni per la biosicurezza armadietto. Aliquotare 1 mL di GNP/PKCi in ogni microprovette da 1,5 mL.
5. Centrifugare le provette in una micro-centrifuga per 30 min a 15.294 x g a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante da ciascuna provetta sotto una cappa di biosicurezza.
   Nota: Fare attenzione a rimuovere il supernatante, garantendo nel contempo che il pellet GNP rimane intatto e non viene aspirato.
7. Risospendere il pellet nel solvente desiderato secondo la concentrazione necessaria. Applicabile solventi possono essere DI acqua, PBS e 0,9% NaCl.
   Nota: A partire da 1 mL di GNP/PKCi, il pellet GNP contiene 6.3 x 10 particelle¹¹ , sulla base della concentrazione di GNP fornita dal produttore. Per amministrare 1.3 x 10¹² particelle in 500 µ l di 0,9% NaCl, aggiungiamo µ l 232 del 0,9% NaCl a ciascuno dei tre palline. Dopo la messa in comune con loro insieme, possiamo quindi raccogliere 500 µ l di soluzione di GNP/PKCi.
   Nota: Mescolare il desiderato solvente ben prima di diluire il pellet GNP/PKCi, altrimenti sarà aggregato il GNP/PKCi.

3. valutazione della PNL/PKCi ibrido solubilità

1. Versare 0,5 mL di soluzione di GNP/PKCi in una cuvetta di acryl. Disponga la provetta di acryl su uno spettrofotometro UV-Vis e testare il picco di assorbimento¹⁵.

Risultati

Cura dovrebbe essere presa per valutare le proprietà biofisiche del GNP/PKCi ibrido, come GNP tende ad aggregare in solvente. Quando GNP è aggregato, il colore della soluzione cambia dal rosa al viola (Figura 1a). Spettrofotometro UV-Vis è in grado di rilevare i cambiamenti più sensibile. Se non è aggregato il GNP/PKCi il picco di assorbimento dovrebbe essere a 525 nm (Figura 1b). Se il PNL è aggregato, il picco di assorbim...

Discussione

Per garantire la corretta formulazione, è fondamentale che la soluzione di δPKCi subisce il passo di sonicazione delineato in 1.6. Sequenza del peptide δPKCi contiene molecole idrofobiche, quindi un sonicatore assiste nello sciogliere PKCi nella soluzione 50% acetonitrile. Inoltre, è molto importante mescolare il solvente meticolosamente, come indicato al punto 2.7.  L'ibrido di GNP/PKCi non sarà formulato anche se questi passaggi non vengono eseguiti correttamente, a causa l'aggregazione del peptide δPKCi

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
negatively charged glutamic acid peptide (P2)	CanPeptide		Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
hydrophobic tryptophan peptide (P4)	CanPeptide		Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
δPKCi peptide	CanPeptide		Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95%
Conical tube(50ml)	Corning Life Sciences	3582070
Conical tube(15ml)	Corning Life Sciences	3582096
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004-100ML
Sonicator	Branson Ultrasonics Corp.	Branson 2510MTH
Microtube	Diamed.ca	AD 150-N
Gold nanoparticle solution	Ted Pella	15705-5	A particle size is 20nm
Rocking Platform shaker	VWR international	40000-304
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Acryl cuvette	SARSREDT	67.758
UV-Vis spectrophotometer	Agilent	Caty 60 UV-Vis