Efecto de proteínas fluorescentes de fusión socios en ensayos de toxicidad de poliglutaminas de levadura

Resumen

Este artículo describe los protocolos para evaluar el efecto de proteínas fluorescentes en la agregación y toxicidad del polyglutamine mal plegadas ampliación para la evaluación rápida de una proteína fluorescente recién desacostumbrada en el contexto de reporteros fluorescentes.

Resumen

Para la investigación de localización de la proteína y el tráfico usando proyección de imagen de células vivas, los investigadores a menudo dependen de su proteína de interés a un reportero fluorescente de fusión. La lista en constante evolución de proteínas fluorescentes genéticamente codificadas (FPs) presenta los usuarios varias alternativas cuando se trata de diseño de fusión fluorescente. Cada FP tiene propiedades ópticas y biofísicas específicas que pueden afectar a las propiedades bioquímicas, celulares y funcionales de las fusiones fluorescentes resultantes. Por ejemplo, varios FPs tienden a formar oligómeros no específicos que son susceptibles de obstaculizar la función de la pareja de fusión. Por desgracia, sólo unos cuantos métodos existen para probar el impacto de FPs en el comportamiento del reportero fluorescente. Aquí, describimos un método simple que permite la evaluación rápida del impacto de FPs mediante ensayos de toxicidad del polyglutamine (poliQ) en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Proteínas poliQ amplió la huntingtina se asocian con la aparición de la enfermedad de Huntington (HD), donde la huntingtina ampliada agrega en oligómeros tóxicos y cuerpos de inclusión. La agregación y la toxicidad de poliQ expansiones en la levadura son muy dependientes de las secuencias que flanquean la región de la poliQ, incluyendo la presencia de etiquetas fluorescentes, proporcionando así una plataforma experimental ideal para estudiar el impacto de FPs en el comportamiento de sus socio de la fusión.

Introducción

Desde la caracterización inicial de la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria¹, una amplia paleta de FPs genéticamente codificados han sido desarrollados, permitiendo que biólogos de la célula localizar y rastrear simultáneamente múltiples eventos/proteínas celulares en la vida de las células de^2,3. FPs se derivan de múltiples organismos, de medusas y corales, por lo tanto, pantalla propiedades biofísicas específicas que desviar mucho más allá de su respectivo espectro fluorescente. Estas propiedades incluyen brillo, estabilidad lumínica y una tendencia a oligomerize entre otros^2,4. Selección de FPs monomérica es un aspecto importante en la selección de una etiqueta conveniente diseñar un reportero fluorescente, con el fin de reducir al mínimo las interacciones inadecuadas y alteraciones de la función de socio de la fusión y maximizar la eficiencia de reportero para un dado el compartimiento celular^4,5,6. Mientras que el GFP ha, con el tiempo, ha evolucionado para reducir al mínimo el efecto de la adición de la etiqueta fluorescente a la fusión socio^5,7,8, como nuevas variantes FP realizan en comparación con GFP sigue siendo difícil de evaluar.

Existen pocos métodos para caracterizar el comportamiento de FPs. La mayoría de ellos involucran pruebas propiedades biofísicas de FPs usando aproximaciones bioquímicas, como la ultracentrifugación y gel filtración protocolos^9,10,11,12. Estos métodos tienen la salvedad de utilizar FPs purificada en solución, que ofrece poca información sobre su comportamiento en las células intactas. El desarrollo de las ofertas de ensayo organizado retículo endoplásmico liso (OSER) una evaluación cuantificable de tendencia de FPs a oligomerize en la vida de las células¹³ por la prueba de la capacidad de FPs sobreexpresado para reorganizar los túbulos del retículo endoplásmico en OSER verticilos¹⁴. Esta técnica con éxito puede detectar cambios entre variantes monoméricas y oligoméricas de GFP y otros FPs. Sin embargo, se basa principalmente en la sobreexpresión en las células transfected transitorio, y la cuantificación y el análisis de la imagen pueden ser muy lentos a menos que la técnica es adoptada como una colección de datos y flujo de trabajo de análisis.

Para complementar estos enfoques, se estableció un ensayo que aprovecha el efecto de etiquetas fluorescentes sobre la toxicidad y agregación poliQ expansiones en levadura^15,16. La expansión de la poliQ tramo con más de 36 repeticiones dentro del primer exón de la codificación del gene de que la proteína huntingtina (Htt) está asociada con la enfermedad de Huntington^17,18. La expresión de ampliado Htt^ex1 en los resultados de la levadura en una fuerte agregación de la proteína Htt mal plegada juntada a un defecto severo del crecimiento. Curiosamente, estos fenotipos están fuertemente influenciados por las secuencias que flanquean el tramo de la poliQ, incluyendo FPs^15,16. Fue racionalizado que las diferentes propiedades de FPs pueden afectar diferencialmente poliQ toxicidad en levadura. De hecho, comparado con GFP como FPs, proteínas fluorescentes rojas y sus formas evolucionadas han demostrado una menor toxicidad y agregación¹⁶. Este manuscrito ofrece un protocolo detallado para evaluar el efecto de la próxima generación de FPs de toxicidad poliQ y agregación en la levadura. Este análisis permite un análisis rápido y potencialmente de alto contenido de variantes FP que pueden usarse en paralelo con anteriormente caracteriza técnicas para la caracterización óptima de nuevo FPs y pueden evaluación cómo realizar en comparación con GFP.

Protocolo

1. generación de nuevo fluorescencia etiquetada Htt^ex1 reporteros para una expresión en la levadura

Nota: Esta sección ha sido modificada del Protocolo por Jiang et al. ¹⁶ y Albakri et al. ¹⁹.

1. Diseño de cebadores para amplificar la secuencia de codificación de la proteína fluorescente o interés por PCR. El primer avance debe incluir una secuencia de líder para ayudar a la enzima de restricción durante la digestión (GATC), seguida por un sitio de restricción de SpeI (ACTAGT) y 20 bases de aguas abajo del ATG (excepto ATG) del gene de la proteína fluorescente de interés. La cartilla reversa debe incluir la secuencia de líder (GATC), seguida de un sitio de restricción SalI (GTCGAC) y el complemento reverso de 20 bases corriente arriba del codón de la secuencia FP (incluso parada).
2. Utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.1, realizar la reacción de PCR utilizando un termociclador con los siguientes ajustes: calor hasta 95 ° C por 1 min y ciclo a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 2 min por kB del producto de PCR. Realizar ciclos de 18 es amplia.
3. Ejecutar la reacción de PCR en un gel de agarosa (0,5% de acetato-Tris-EDTA). Se debe una única banda correspondiente al tamaño del producto esperado. Aislar el fragmento utilizando un kit de purificación de gel.
4. El protocolo emplea un vector de Htt^ex1 lleva 25 (no tóxico) y 72 (HD asociada, mostrando una fuerte agregación) repite poliQ. Digerir los fragmentos PCR y el vector con enzimas de restricción del SpeI y SalI por 3 h a 37 ° C.
5. Purificar el vector digerido por correr en un gel de agarosa como en el paso 1.3.
6. Purificar el fragmento PCR digerido con un kit de potabilización de la polimerización en cadena.
7. Ligar el fragmento resultante de PCR digerido y p415 -GAL1-bandera-25 72QpolyQ plásmidos¹ utilizando T4 ligasa (1 h a temperatura ambiente). Utilice una reacción de 10 μl (1 μl de enzima T4, 1 μl de tampón de X 10, 6 μl del fragmento PCR y 2 μl de vector).
8. Transformar 2 μl de la reacción de la ligadura en 50 μl de Escherichia coli-células competentes e incubar en hielo durante 30 minutos. Entonces, choque térmico las células a 42 ° C por 30 s. Agregar 1 mL de medio de consecuencia SOC e incuban a 37 ° C por 1 h en una coctelera Boston. Placa de 200 μL de la reacción en una placa de agar LB con ampicilina μg/mL 100. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
9. Seleccione tres colonias bacterianas individuales, cultivarlas durante la noche en 3 mL de LB caldo que contiene 100 ampicilina μg/mL a 37 ° C en un agitador y extraer el plásmido de ADN utilizando un kit de purificación de plásmidos.
10. Compruebe el plásmido por digerir 500 ng de ADN mediante enzimas de restricción del SpeI y SalI por 1 h a 37 ° C y correr la reacción en un gel de agarosa (0,5% de acetato-Tris-EDTA). Debe haber dos bandas en los tamaños derecha de vector (~ 7 kb) y el inserto (el tamaño varía según el gen de interés). Luego, verifique el plásmido por secuenciación.
11. Transformar la p415 -GAL1- plásmidos - poliQ FP debanderaen la cepa de levadura W303 siguiendo un protocolo de transformación estándar levadura².

2. localización del ensayo

1. Raya la levadura clones llevan 25Q/72Q etiquetadas con el FP de interés sobre una placa de agar que contiene medios de selección de levaduras (sintético completo-SC sin leucina) con glucosa como fuente de carbono. Al mismo tiempo, también raya 25Q/72Q-ymsfGFP para servir como control positivo.
   Nota: 25Q/72Q que no contengan una etiqueta fluorescente no son tóxicos y pueden servir como control negativo.
2. Incubar las placas a 30 ° C durante 2-3 días.
3. Seleccione hasta tres colonias individuales de la placa.
4. Inocular los 5 mL de SC suplementado con 2% de glucosa como fuente de carbono.
5. Pellet en 200 μL de cada cultivo durante la noche y lavar 3 x con estéril de agua destilada.
6. Resuspender las células en medios SC que contiene 2% galactosa como fuente de carbono para inducir la expresión de fusiones poliQ. Incubar la galactosa media noche a 30 ° C en un agitador de tubo. Como control, repita este paso mediante el uso de los medios de comunicación que contiene glucosa.
7. A la mañana siguiente, igualar las densidades de célula a densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0.2 en 100 μl de medio SC en una placa de 96 pocillos estéril.
8. Preparar cuatro cinco diluciones de cada muestra con agua estéril por pipetear 20 μl de la muestra de la anterior en 80 μl de medios de comunicación en el siguiente pozo.
9. Utilice una levadura fijación herramienta para observar las células en las placas selectivas (que contengan glucosa o galactosa) e incubar a 30 ° C por 2 d.
10. Imagen de las placas con un dispositivo de documentación de la imagen.

3. cuantificación del crecimiento celular en cultivo líquido

1. Preparar los cultivos celulares, siguientes pasos 2.1-2.5 del presente Protocolo.
2. Medir el OD₆₀₀ usando un espectrofotómetro.
3. Diluir las células a un OD₆₀₀ de 0.1 en 300 μL de medios de comunicación en una placa de 96 pocillos.
4. Ejecute cada muestra por triplicado.
5. Incube la placa en una lector de placa/incubadora con capacidad de agitación. Establecer el número de muestras, la temperatura a 30 ° C, la absorbancia a 600 nm, la longitud de los experimentos a las 24 h y los intervalos de medición a 15 minutos y, a continuación, seleccione el modo de agitación continua.
6. Crear la curva de crecimiento y cuantificar el área bajo la curva utilizando el software de gráfica científica. Se recomienda el GraphPad Prism 7. Pegar los datos en una tabla XY con tres valores de replicación. La curva de crecimiento se mostrará en la carpeta gráficos en el lado izquierdo. Para cuantificar el área bajo la curva, seleccione analizar en la parte superior izquierda y haz clic en el área bajo la curva en los análisis de XY.

4. fluorescente microscopia

1. Preparar los cultivos celulares, siguientes pasos 2.1-2.5 del presente Protocolo.
2. Diluir las células 10 x en crecimiento los medios de comunicación y la transferencia de 200 μL de cada muestra a cámaras imagen 8-bien.
3. Imagen de las células utilizando un microscopio confocal, equipado con un objetivo Aprochromoat Plan X 63 (1.4 NA) a temperatura ambiente.
   Nota: El uso de un microscopio confocal es opcional. También se puede emplear un microscopio estándar de fluorescencia de amplio campo.
4. Ajustar la potencia del agujero de alfiler y láser para la adquisición de imagen óptima. Puesto que los agregados 72Q son mucho más brillantes que la señal 25Q difusa, a menudo es necesario utilizar un valor de adquisición diferentes entre la plásmidos diferentes con el fin de evitar la saturación de la señal fluorescente.
5. Procesar las imágenes mediante ImageJ²⁰ u otro software de procesamiento de imágenes. En este paso, se desea el porcentaje de células que pantalla agregado puede calcularse manualmente.

5. dot Blot

Nota: En el presente Protocolo, blot dot se utiliza para examinar los niveles de expresión de la proteína. Preparar los cultivos celulares, siguientes pasos 2.1-2.5 del presente Protocolo.

1. Generar proteína lisados con perlas de cristal en tampón de lisis (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% de glicerol, 1 mM Ditiotreitol [TDT]). Añadir inhibidores de la proteasa, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PSMF) y cóctel, directamente antes del uso del inhibidor de la proteasa. 5 mL del cultivo durante la noche de la pelotilla y resuspender en 200 μL de los granos de cristal y 200 μL de tampón de lisis. Agitarlos durante 30 s a 12 asaltos. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 10 min y recoger el sobrenadante.
2. Punto una cantidad igual de proteínas totales en una membrana de nitrocelulosa con un aparato de microfiltración. Prewet la membrana con PBS y montar el aparato. Conectarse a una fuente de vacío y asegúrese de que los tornillos estén apretados. Encienda la aspiradora y deje que el filtro de la muestra a través de la membrana por gravedad.
3. Bloquear la membrana en PBS - 0,05% Tween/5% leche descremada.
4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario anti-FLAG toda la noche a 4 ° C. Se recomienda la M1 monoclonal de anti-FLAG.
5. Lavar la membrana 3 x 10 min con PSB - 0.05% Tween.
6. Incubar la membrana con un anticuerpo secundario fluorescente marcado (anti-mouse IgG) por 1 h a temperatura ambiente en PBS - 0,05% Tween/5% leche descremada.
7. Lavar la membrana 3 x 10 min con PSB - 0.05% Tween.
8. Imagen-mancha blanca /negra usando un sistema de documentación de immunoblot.

Resultados

FPs tienen diferentes propiedades biofísicas, incluyendo su tendencia a oligomerize, que pueden afectar el comportamiento de sus socios de la fusión en el contexto de reporteros fluorescentes. Este protocolo describe un método simple donde se pueden fusionar varios FPs a expansiones de tóxicos poliQ. Puesto que la toxicidad de la poliQ es altamente dependiente de las secuencias que flanquean el tramo poliQ¹⁵, este ensayo permite una comparación rápida y direc...

Discusión

En este artículo, se emplearon varios ensayos para medir la agregación de Htt^ex1 poliQ expansiones y su efecto sobre el crecimiento de la levadura como modelo para estudiar cómo diferentes fluorescentes proteínas alteran sus contrapartes fusion en el contexto de reporteros fluorescentes . Usando una variante de la GFP (ymsfGFP) como control positivo, demostramos que este detecta cambios significativos en la agregación entre diferentes etiquetas fluorescentes y toxicidad de la poliQ y permite una comparaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354