Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt Protokolle, um die Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf die Aggregation und Toxizität von fehlgefaltete Trinukleotiderkrankungen Erweiterung für die schnelle Bewertung eines neu Fußgelenkes fluoreszierenden Proteins im Rahmen des fluoreszierenden Reporter zu bewerten.

Zusammenfassung

Für die Untersuchung von Protein-Lokalisierung und Menschenhandel mit live Cell Imaging setzen Forscher oft auf Absicherung ihrer Protein des Interesses zu einem fluoreszierenden Reporter. Die ständig weiterentwickelnde Liste der genetisch codierten fluoreszierende Proteine (FPs) präsentiert Benutzer mit mehreren Alternativen, wenn es um fluoreszierende Fusion Design kommt. Jedes FP hat bestimmte optische und Biophysikalische Eigenschaften, die die biochemischen, zellulären und funktionellen Eigenschaften der daraus resultierenden fluoreszierenden Fusionen beeinträchtigen können. Zum Beispiel mehrere FPs tendenziell unspezifische Oligomere bilden, die auf die Funktion der Fusion Partner behindern anfällig sind. Leider gibt es nur wenige Methoden, um die Auswirkungen der FPs auf das Verhalten des fluoreszierenden Reporters zu testen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die es ermöglicht die schnelle Bewertung der Auswirkungen der FPs mit Trinukleotiderkrankungen (PolyQ) Toxizität Assays in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae. PolyQ erweitert Huntingtin-Proteine sind verbunden mit dem Beginn der Huntington-Krankheit (HD), wo die erweiterten Huntingtin in toxischen Oligomeren und Einschlusskörperchen aggregiert. Die Aggregation und Toxizität von PolyQ Erweiterungen in der Hefe sind stark abhängig von der PolyQ-Region, einschließlich das Vorhandensein von fluoreszierenden Tags, wodurch eine ideale experimentelle Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen von FPs auf das Verhalten der flankierenden Sequenzen ihre Fusion Partner.

Einleitung

Da die ursprüngliche Charakterisierung der das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequorea Victoria¹, eine breite Palette von genetisch codierte FPs sind entwickelt worden, so dass Zellbiologen, gleichzeitig zu lokalisieren und zu verfolgen mehrere zelluläre Ereignisse/Proteine in lebenden Zellen^2,3. FPs stammen aus mehreren Organismen, von Quallen, Korallen, und daher spezielle biophysikalische Anzeigeeigenschaften, die ausführlich über ihre jeweiligen Fluoreszenzspektrum abzulenken. Zu diesen Eigenschaften gehören Helligkeit, Photostabilität und eine Tendenz, unter anderem^2,4oligomerize. Auswahl der Monomere FPs ist ein wichtiger Aspekt bei der Auswahl eines geeigneten Tags beim Entwerfen einer fluoreszierenden Reporter, um unangemessene Interaktionen und Veränderungen von der Fusion Partnerrolle zu minimieren und maximieren die Effizienz der Reporter für eine zelluläre Fach^4,5,6gegeben. Während GFP hat, im Laufe der Zeit entwickelt wurde, um Minimierung der Auswirkungen der Fusion Partner^5,7,8, das fluoreszierende Tag hinzufügen wie neue FP-Varianten im Vergleich zu GFP bleibt schwer zu beurteilen.

Einige Methoden existieren, um das Verhalten der FPs charakterisieren. Die meisten von ihnen beinhalten Tests Biophysikalische Eigenschaften von FPs mit biochemischen Ansätzen, wie z. B. Ultrazentrifugation und gel Filtration Protokolle^9,10,11,12. Solche Methoden haben die Einschränkung der Verwendung von gereinigten FPs in Lösung und bieten Einblick in ihr Verhalten in intakten Zellen. Die Entwicklung der organisierten glatte endoplasmatische Retikulum (OSER) Assay Angebote Zellen eine messbare Bewertung der FPs tendenziell in lebenden oligomerize¹³ von testen, ob der überexprimieren FPs endoplasmatische Retikulum Tubuli in reorganisieren OSER Quirlen¹⁴. Diese Technik kann erfolgreich Änderungen zwischen Monomeren und Oligomere Varianten der GLP und anderen FPs erkennen. Aber es stützt sich vor allem auf Überexpression in vorübergehend transfizierten Zellen, und die Quantifizierung und Bildanalyse können zeitaufwändig sein, es sei denn, die Technik als automatisierte Datenerfassung und Analyse Workflow angenommen wird.

Um diese Ansätze zu ergänzen, haben wir eine Probe, die die Wirkung von fluoreszierenden Tags zur Toxizität und Aggregation von PolyQ Erweiterungen in Hefe^15,16nutzt. Der Ausbau der PolyQ Strecke mit mehr als 36 wiederholt innerhalb der ersten Exon Gene kodieren, das Huntingtin (Htt) mit Chorea Huntington^17,18verbunden ist. Der Ausdruck des erweiterten Htt^ex1 in Hefe führt zu einer starken Aggregation fehlgefaltete Htt-Protein gekoppelt mit einem starken Wachstum defekt. Interessanterweise sind diese Phänotypen flankieren die PolyQ Strecke, einschließlich FPs^15,16Sequenzen stark beeinflusst. Es wurde rationalisiert, dass die verschiedenen Eigenschaften der FPs differentiell PolyQ Toxizität in der Hefe beeinflussen können. In der Tat haben im Vergleich zu GFP-wie FPs, rot fluoreszierende Proteine und ihre entwickelten Formen eine geringere Toxizität und Aggregation¹⁶gezeigt. Diese Handschrift enthält ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Wirkung der nächsten Generation von FPs auf PolyQ Toxizität und Aggregation in der Hefe. Dieser Assay ermöglicht eine schnelle und potenziell hohen Inhalt Analyse von FP-Varianten, die parallel verwendet werden können, vorher gekennzeichnet Techniken für die optimale Charakterisierung von neuen FPs und kann beurteilen, wie sie im Vergleich zu GFP durchführen.

Protokoll

1. Generation des neuen Eindringmittel Tagged Htt^ex1 Reporter für einen Ausdruck in der Hefe

Hinweis: In diesem Abschnitt wurde aus dem Protokoll von Jiang Et Al. modifiziert ¹⁶ und Albakri Et al. ¹⁹.

1. Design-Primer an die Reihenfolge, die Codierung der fluoreszierenden Proteins oder Zinsen durch PCR verstärken. Der forward Primer gehören eine Leader-Sequenz um das Restriktionsenzym während der Verdauung (GATC), gefolgt von einer SpeI-Einschränkung-Website (ACTAGT) und 20 Basen flussabwärts von der ATG (mit Ausnahme von ATG) des Gens fluoreszierenden Proteins des Interesses zu unterstützen. Die rückwärts-Primer sollte die Leader-Sequenz (GATC), gefolgt von einer SalI Einschränkung Website (GTCGAC) und die umgekehrte Ergänzung 20 Basen stromaufwärts von Stopcodon der FP-Sequenz (einschließlich Stop) enthalten.
2. Die Primer in Schritt 1.1, gestaltet mit die PCR-Reaktion mit einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durchführen: Hitze bis 95 ° C für 1 min und Zyklus bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 2 min pro kB des PCR-Produktes. Durchführung von 18 Zyklen ist ausreichend.
3. Die PCR-Reaktion auf einem Agarosegel (0,5 % im Tris-Acetat-EDTA) ausgeführt. Es sollte ein einzelnes Band der erwarteten Größe entspricht. Das Fragment mit einem Gel-Reinigung-Kit zu isolieren.
4. Das Protokoll beschäftigt einen Htt^ex1 Vektor mit 25 (ungiftig) und 72 (HD-assoziiert, zeigt eine starke Aggregation) PolyQ wiederholt. Verdauen der PCR-Fragmente und der Vektor mit SpeI und SalI Restriktionsenzyme für 3 h bei 37 ° C.
5. Reinigen des verdauten Vektors auf einem Agarosegel wie in Schritt 1.3 ausgeführt.
6. Reinigen Sie die verdaute PCR-Fragment mit einem PCR-Reinigung-Kit.
7. Die daraus resultierende verdaute PCR-Fragment verbinden und p415 -GAL1-Flagge-25/72QpolyQ Plasmide¹ mithilfe von T4-Ligase (1 h bei Raumtemperatur). Verwenden Sie eine 10 µL-Reaktion (1 µL T4 Enzym, 1 µL 10 X Puffer 6 µL des PCR-Fragments und 2 µL Vektor).
8. 2 µL der Ligatur Reaktion in 50 µL von Escherichia colizu verwandeln-kompetente Zellen und inkubieren sie für 30 min auf Eis. Dann Hitze-Schock die Zellen bei 42 ° C für 30 s. Add 1 mL SOC Auswuchs Medien und Inkubation bei 37 ° C für 1 h in einen Shaker geben. Platte 200 µL der Reaktion auf eine LB-Agar-Platte mit 100 µg/mL Ampicillin. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.
9. Wählen Sie drei individuelle Bakterienkolonien, wachsen sie über Nacht in 3 mL LB-Bouillon mit 100 µg/mL Ampicillin bei 37 ° C in einen Shaker geben und extrahieren Sie das Plasmid DNA mit einem Plasmid-Reinigung-Kit zu.
10. Das Plasmid überprüfen, indem Sie verdauen 500 ng DNA mit Restriktionsenzymen SpeI und SalI für 1 h bei 37 ° C und die Reaktion auf eine Agarosegel (0,5 % im Tris-Acetat-EDTA) ausführen. Auf die richtige Größe des Vektors (~ 7 kb) und der Einsatz werden zwei Bands (Größe variiert je nach das gen des Interesses). Überprüfen Sie anschließend, das Plasmid durch Sequenzierung.
11. Die p415 -GAL1-Flagge- PolyQ-FP Plasmide in der Hefestamm W303 nach einem standard Hefe Umwandlung Protokoll Nr.²zu verwandeln.

(2) Schmierblutungen Assay

1. Streifen die Hefe klont tragenden 25Q/72Q mit dem Stichwort der FP auf eine Agarplatte mit Hefe-Auswahl-Media (synthetische komplette-SC ohne Leucin) mit Glukose als die Kohlenstoffquelle. Zum gleichen Zeitpunkt auch Streifen Sie 25Q/72Q-YmsfGFP als Positivkontrolle dienen.
   Hinweis: 25Q/72Q Konstrukte, die keinen fluoreszierenden Tag enthalten sind nicht giftig und können als negative Kontrolle dienen.
2. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 2-3-d.
3. Wählen Sie bis zu drei einzelnen Kolonien von der Platte.
4. 5 mL SC ergänzt mit 2 % Glukose als die Kohlenstoffquelle zu impfen.
5. Pellet-200 µL jeder Nacht Kultur und waschen Sie ihn 3 X mit sterilem destilliertem Wasser.
6. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in SC-Medien mit 2 % Galaktose als Kohlenstoffquelle induzieren die Expression von PolyQ Fusionen. Inkubieren Sie die Galaktose, die Medien über bei 30 ° C in ein Rohr Rotator Nacht. Als Kontrolle wiederholen Sie diesen Schritt mithilfe von Glukose-haltigen Medien.
7. Am nächsten Morgen auszugleichen Zelldichten zu Extinktion bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,2 in 100 µL SC Medien in einem sterilen 96-Well-Platte.
8. Bereiten Sie vier Fünffache Verdünnungen von jeder Probe mit sterilem Wasser durch Pipettieren 20 µL der Probe aus dem vorherigen hinein 80 µL der Medien in den nächsten gut.
9. Verwenden Sie eine Hefe anheften Werkzeug zu erkennen die Zellen auf selektive Teller (mit Glukose oder Galaktose) und inkubieren Sie bei 30 ° C für 2 d.
10. Bild der Platten mit einem Bild-Dokumentation-Gerät.

3. Quantifizierung des Zellwachstums in Flüssigkultur

1. Bereiten Sie die Zellkulturen, folgende Schritte 2.1-2.5 dieses Protokolls.
2. Messen Sie die OD₆₀₀ mit einem Spektralphotometer.
3. Verdünnen Sie die Zellen, die eine OD₆₀₀ von 0,1 in 300 µL der Medien in einer 96-Well-Platte.
4. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
5. Inkubieren Sie die Platte in eine Platte Leser/Inkubator mit schütteln Fähigkeiten. Legen Sie die Anzahl der Proben, die Temperatur auf 30 ° C, die Extinktion bei 600 nm, die Länge der die Experimente bis 24 h und die Messintervalle 15 min, und wählen Sie schütteln Dauerbetrieb.
6. Erstellen Sie die Wachstumskurve und quantifizieren Sie die Fläche unter der Kurve mit wissenschaftlichen Grafik Software. GraphPad Prism 7 wird empfohlen. Fügen Sie die Daten in eine XY-Tisch mit drei wiederholte Werte. Die Wachstumskurve wird im Ordner " Diagramme " auf der linken Seite angezeigt. Die Fläche unter der Kurve zu quantifizieren, wählen Analyze oben links und klicken Sie auf die Fläche unter der Kurve in XY-Analysen.

(4) Fluoreszenz-Mikroskopie

1. Bereiten Sie die Zellkulturen, folgende Schritte 2.1-2.5 dieses Protokolls.
2. Verdünnen Sie die Zellen 10 X im Wachstum Medien und Transfer 200 µL jeder Probe 8-Brunnen bildgebenden Kammern.
3. Bild der Zellen mit einem konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 63 X planen Aprochromoat Ziel (1,4 NA) bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Die Verwendung eines konfokalen Mikroskops ist optional. Ein standard Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop kann auch eingesetzt werden.
4. Lochkamera und Laser Leistung für optimale Bildaufnahme einstellen. Da die 72Q Aggregate viel heller als das diffuse 25Q Signal sind, ist es oft erforderlich, eine andere Erwerb Einstellung zwischen den verschiedenen Plasmiden zur Vermeidung von Sättigung das Fluoreszenzsignal verwenden.
5. Bearbeiten Sie die Bilder mit ImageJ²⁰ oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software. In diesem Schritt wird der Anteil der Zellen Display Aggregat kann manuell berechnet werden gewünscht.

(5) Dot-Blot

Hinweis: In diesem Protokoll Dot-Blot dient die Proteingehalte Ausdruck zu prüfen. Bereiten Sie die Zellkulturen, folgende Schritte 2.1-2.5 dieses Protokolls.

1. Generieren Sie Protein Lysates mit Glasperlen in Lyse Puffer (100 mM Tris, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 % Glyzerin, 1 mM Dithiothreitol [DTT-]). Protease-Inhibitoren, 4 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PSMF) und Protease-Inhibitor cocktail, direkt vor der Verwendung hinzufügen. Pellet-5 mL der Übernacht-Kultur und in 200 µL von Glasperlen und 200 µL Puffer Lyse aufzuwirbeln. Vortex 30 s für 12 Runden. Bei 12.000 X g bei 4 ° C für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu sammeln.
2. Erkennen einer gleichen Menge von insgesamt Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran mit einer Mikrofiltration Apparatur. Prewet der Membran mit PBS und montieren Sie das Gerät. An eine Vakuumquelle schließen Sie an und sicherstellen Sie, dass die Schrauben angezogen werden. Schalten Sie das Vakuum und lassen Sie den Beispiel-Filter durch die Membran durch die Schwerkraft.
3. Blockieren Sie die Membran in der PBS - 0,05 % Tween/5% fettfreie Milch.
4. Inkubieren Sie die Membran mit Anti-FLAG Primärantikörper über Nacht bei 4 ° c Die monoklonalen Anti-FLAG-M1 wird empfohlen.
5. Waschen Sie die Membran 3 X 10 min mit PSB - 0,05 % Tween.
6. Inkubieren Sie die Membran mit einem Eindringmittel beschrifteten sekundäre Antikörper (Anti-Maus IgG) für 1 h bei Raumtemperatur in der PBS - 0,05 % Tween/5% fettfreie Milch.
7. Membran 3 x 10 min mit PSB - 0,05 % Tween zu waschen.
8. Bild-Blot mit einem Immunoblot-Dokumentations-System.

Ergebnisse

FPs haben unterschiedliche Biophysikalische Eigenschaften, einschließlich ihrer Tendenz, oligomerize, die das Verhalten ihrer Fusion Partner im Zusammenhang mit fluoreszierenden Reporter beeinflussen können. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, wo mehrere FPs auf toxische PolyQ Erweiterungen verschmolzen werden kann. Da PolyQ Toxizität stark abhängig von den flankierenden PolyQ Stretch¹⁵Sequenzen ist, ermöglicht dieser Test einen schnellen und di...

Diskussion

In diesem Artikel wurden verschiedene Tests zur Messung der Aggregation von Htt^ex1 PolyQ Erweiterungen und deren Wirkung auf das Wachstum der Hefe als Modell eingesetzt, um studieren wie verschiedene fluoreszierende Proteine verändern ihre Fusion Partner im Zusammenhang mit fluoreszierenden Reporter . Eine GLP-Variante (YmsfGFP) zeigten als Positivkontrolle wir, dass dies erhebliche Veränderungen in der PolyQ Toxizität und Aggregation zwischen verschiedenen fluoreszierenden Tags erkennt und einen direkten u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354