ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

Abstract

עבור החקירה של לוקליזציה חלבון וסחר באמצעות הדמיה תא חי, החוקרים מסתמכים בדרך כלל על פיוזינג חלבון שלהם לעניין כתב פלורסנט. הרשימה מתפתחת ללא הרף של חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית (FPs) מציג משתמשים עם מספר חלופות כשמדובר עיצוב פיוז'ן פלורסנט. FP כל בעלת תכונות אופטי ו biophysical ספציפיים שיכולים להשפיע על מאפייני הביוכימי, סלולר ופונקציונלי fusions פלורסנט וכתוצאה מכך. למשל, כמה FPs נוטים ליצור oligomers לא ספציפית כי הם רגישים כדי להכשיל על הפונקציה של הזוג פיוז'ן. למרבה הצער, רק כמה שיטות קיימות כדי לבחון את ההשפעה של FPs על ההתנהגות של הכתב פלורסנט. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת את ההערכה המהירה של ההשפעה של FPs באמצעות מבחני רעילות polyglutamine (polyQ) בשמרים ניצני האפייה. חלבונים huntingtin מורחב-PolyQ קשורים עם תחילתה של מחלת הנטינגטון (HD), איפה huntingtin המורחב אגרגטים לתוך oligomers רעילים וגופים הכללה. צבירה של רעילות polyQ הרחבות בשמרים הם תלויים במידה רבה רצפי איגוף באזור polyQ, כולל הנוכחות של תגיות פלורסנט, ובכך מספק פלטפורמה ניסיוני אידיאלי לחקור את ההשפעה של FPs על התנהלות שלהם שותף פיוז'ן.

Introduction

מאז פותחו האפיון הראשוני של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויקטוריה Aequorea¹, לוח צבעים רחב של מקודדים גנטית FPs, ומאפשר תא ביולוגים בו-זמנית לשפה ולעקוב מרובים אירועים/החלבונים חי תאים^2,3. FPs נגזרות אורגניזמים מרובים, מן המדוזה אלמוגים, ולכן, הצגת מאפייני biophysical ספציפי המסיטים בהרחבה מעבר ספקטרום פלורסנט המתאימים שלהם. מאפיינים אלה כוללים בהירות, פוטוסטביליטי נטייה oligomerize בין היתר^2,4. בחירת monomeric FPs היא היבט חשוב בבחירה של תג מתאים בעת עיצוב כתב פלורסנט, על מנת למזער אינטראקציות בלתי הולם והשינויים של הפונקציה של השותף פיוז'ן, למקסם את היעילות כתב עבור בהתחשב תא הסלולר-^4,-^5,-⁶. בעוד ה-GFP, לאורך זמן, התפתח כדי לצמצם את ההשפעה של הוספת תגית פלורסנט של פיוז'ן שותף^5,7,8, כמה גרסאות חדשות FP לבצע בהשוואה ל GFP נשאר קשה להעריך.

כמה שיטות קיימות כדי לאפיין את אופן הפעולה של FPs. רובן כוללות בדיקת מאפיינים ביופיזיקלי של FPs שימוש בגישות ביוכימיים, כגון ultracentrifugation, ג'ל סינון פרוטוקולים^9,10,11,12. שיטות כאלה יש אזהרה של שימוש FPs מטוהרים בפתרון, מציע תובנה קטנה התנהגותם בתאים ללא פגע. הפיתוח של ההצעות assay מאורגן חלקה רשתית תוך-פלזמית (OSER) הערכה הניתנת לכימות של נטייה FPs' oligomerize חי תאים¹³ על-ידי בדיקת היכולת של overexpressed FPs כדי לארגן מחדש את רשתית תוך-פלזמית בקוריאנית לתוך OSER דורים¹⁴. טכניקה זו בהצלחה לזהות שינויים בין גרסאות monomeric ו- oligomeric של ה-GFP, FPs אחרים. עם זאת, זה מסתמך בעיקר על ביטוי בתאים transiently transfected, כימות וניתוח התמונה פקוקה אלא אם הטכניקה מאומצת כמו איסוף נתונים אוטומטי של ניתוח זרימת העבודה.

על מנת להשלים את הגישות האלה, הקמנו וזמינותו כי מנצל את ההשפעה של פלורסנט תגים על רעילות, צבירה של הרחבות polyQ שמרים^15,16. הרחבת רצועת polyQ עם יותר מ 36 חוזר בתוך אקסון הראשון של ג'ין קידוד שהחלבון huntingtin (Htt) מזוהה עם מחלת הנטינגטון^17,18. הביטוי של Htt המורחב^ex1 בתוצאות שמרים ב צבירה חזקה של החלבון Htt misfolded מצמידים פגם חמור צמיחה. מעניין, אלה פנוטיפים חריפה מושפעים את רצפי איגוף רצועת polyQ, כולל FPs^15,16. זה היה מיוחד כי מאפיינים שונים של FPs יכול להשפיע באופן שונה רעילות polyQ שמרים. ואכן, בהשוואה ל- FPs כמו GFP, חלבונים ניאון אדום וטפסים מפותחת שלהם הראו מופחתת רעילות, צבירת¹⁶. כתב יד זה מספק פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את ההשפעה של הדור הבא של FPs על רעילות polyQ, צבירה של שמרים. Assay זו מאפשרת ניתוח מהיר ולא פוטנציאל גבוה-תוכן של גרסאות FP שיכול לשמש במקביל בעבר מאופיין טכניקות אופטימלית אפיון חדש FPs וניתן להעריך כיצד הם לבצע בהשוואה ל- GFP.

Protocol

1. מהדור החדש Htt מתויג Fluorescently^ex1 כתבים עבור ביטוי בשמרים

הערה: סעיף זה השתנה מן הפרוטוקול על ידי ג'יאנג. et al. ¹⁶ ו. Albakri et al. ¹⁹.

1. עיצוב תחל כדי להגביר את רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי או ריבית על-ידי ה-PCR. פריימר לפנים צריכה לכלול רצף מנהיג על מנת לסייע את אנזים הגבלה במהלך העיכול (GATC), ואחריו אתר ההגבלה SpeI (ACTAGT) ו 20 בסיסים downstream של ATG (למעט ATG) של הגן חלבון פלואורסצנטי עניין. ומהצמיגים הפוכה צריכה לכלול את רצף מנהיג (GATC), ואחריו אתר ההגבלה סאלי (GTCGAC), המשלים הפוכה של 20 בסיסי במעלה הזרם stop codon של הרצף FP (כולל הפסקה).
2. באמצעות תחל את תוכנן בשלב 1.1, לבצע את תגובת ה-PCR של thermocycler באמצעות ההגדרות הבאות: חום עד 95 ° C 1 דקות, מחזור 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לכל kB של מוצר ה-PCR. ביצוע מחזורים 18 נמצא בשפע.
3. להפעיל את תגובת ה-PCR ג'ל agarose (0.5% בטריס-אצטט-EDTA). שם צריך להקה יחיד התואם לגודל המוצר הצפוי. לבודד את המקטע בעזרת ערכת טיהור ג'ל.
4. הפרוטוקול מעסיקה וקטור^ex1 Htt נושאת 25 (בלתי רעיל), 72 (HD-הקשורים, הצגת צבירה חזק) polyQ חוזר. לעכל את השברים PCR והן את הווקטור עם אנזימי הגבלה SpeI, סאלי עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
5. לטהר את הווקטור מתעכל על ידי פועל זה ג'ל agarose כמו שלב 1.3.
6. לטהר את המקטע PCR מעוכל בעזרת ערכת טיהור PCR.
7. מאתרים ומפסיקים את השבר שנוצר מתעכל PCR ו- p415 -GAL1-דגל--25/72QpolyQ פלסמידים¹ שימוש T4 ליגאז (1h בטמפרטורת החדר). השתמש לתגובה 10 µL (µL 1 של האנזים T4, µL 1 מאגר X 10, 6 µL של קטע ה-PCR ו- 2 µL של וקטור).
8. להפוך את 2 µL של התגובה מצדו לתוך 50 µL של Escherichia coli-תאים המוסמכת דגירה אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, חום-הלם התאים ב 42 ° C ל 30 ס' הוסף 1 מ"ל של מדיה תוצר SOC, דגירה ב 37 ° C עבור h 1 ב שייקר. צלחת µL 200 התגובה על צלחת LB-אגר המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
9. בחר שלוש מושבות חיידקים בודדים, לגדל אותם בן לילה ב- 3 מ ל LB-מרק המכיל אמפיצילין µg/mL 100 ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר ולחלץ את פלסמיד הדנ א באמצעות ערכת טיהור פלסמיד.
10. בדוק את פלסמיד באמצעות עיכול 500 ננוגרם של הדנ א בעזרת אנזימי הגבלה SpeI, סאלי עבור h 1 37 ° C ולהריץ התגובה על ג'ל agarose (0.5% בטריס-אצטט-EDTA). צריך להיות שתי להקות בגדלים נכון של וקטור (~ 7 קילו), את תותב (גודל משתנה על פי הגן עניין). לאחר מכן, לאמת את פלסמיד על ידי רצף.
11. להפוך את p415 -GAL1-דגלפלסמידים FP - polyQ לתוך המתח שמרים W303 בעקבות פרוטוקול טרנספורמציה²שמרים רגיל.

2. איתור Assay

1. פס השמרים שיבוטים נשיאה 25Q/72Q המתויגת FP של ריבית על צלחת אגר המכילים שמרים בחירת מדיה (סינתטי להשלים-SC ללא לאוצין) עם גלוקוז כמקור פחמן. במקביל, גם פסים 25Q/72Q-ymsfGFP לשמש פקד חיובי.
   הערה: 25Q/72Q מבנים שאינם מכילים תגית פלורסנט אינם רעילים, יכול לשמש בקרה שלילית.
2. דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 d.
3. בחר עד שלוש מושבות יחיד מהצלחת.
4. לחסן 5 מ ל SC בתוספת 2% גלוקוז כמקור פחמן.
5. גלולה 200 µL של כל תרבות הלילה ולשטוף אותו x 3 עם סטרילי מים מזוקקים.
6. Resuspend תאי SC המדיה המכילה 2% גלקטוז כמקור פחמן כדי לעודד את הביטוי של polyQ fusions. דגירה של גלקטוז מדיה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ב rotator הרכבת התחתית. כפקד, חזור על שלב זה באמצעות מדיה המכילה גלוקוז.
7. למחרת בבוקר, להשוות הצפיפויות תא כדי צפיפות אופטית על 600 nm (OD₆₀₀) של 0.2 ל-100 µL של התקשורת SC צלחת 96-ובכן סטרילי.
8. להכין ארבעה דילולים למטר של כל מדגם במים סטריליים על-ידי pipetting 20 µL של הדוגמה הקודמת עד 80 µL של התקשורת הבאר הבא.
9. להשתמש שמרים הצמדת כלי כדי לזהות את התאים על גבי לוחות סלקטיבית (המכילה גלוקוז או גלקטוז) דגירה ב 30 ° C עבור 2 d.
10. תמונה הצלחות עם מכשיר תיעוד התמונה.

3. כימות של צמיחת תאים בתרבות נוזלי

1. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.
2. למדוד את יתר₆₀₀ באמצעות ספקטרופוטומטרים.
3. לדלל לתאים יתר₆₀₀ של 0.1 ב 300 µL של התקשורת צלחת 96-ובכן.
4. תריץ את דגימת כל דולר.
5. דגירה של צלחת צלחת הקורא/חממה עם יכולות חזק. להגדיר את מספר הדגימות, הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס, את ספיגת על 600 ננומטר, האורך של הניסויים ל 24 שעות, את המרווחים מדידה 15 דקות ולאחר בחר באופן רציף חזק.
6. ליצור את עקומת גדילה ולכמת את השטח מתחת לעקומה באמצעות תוכנה graphing מדעי. 7 פריזמה GraphPad מומלץ. להדביק את הנתונים בתוך טבלת XY עם שלושה ערכים שכפל. עקומת גדילה יוצגו תחת התיקיה תרשימים בצד שמאל. כדי לכמת את השטח מתחת לעקומה, בחר נתח בפינה השמאלית העליונה ולחץ על האזור תחת עקומת ניתוחים XY.

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.
2. לדלל את התאים 10 x בצמיחה התקשורת והעברת µL 200 של כל מדגם ללשכה הדמיה 8-. טוב.
3. תמונה של תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם מטרה Aprochromoat תוכנית X 63 (1.4 NA) בטמפרטורת החדר.
   הערה: השימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי היא אופציונלית. גם יכול להיות מועסק מיקרוסקופ רגיל של פלורסנט שדה רחב.
4. להתאים את הכוח חריר ולייזר עבור רכישת תמונה אופטימלית. מאז מצרפי 72Q בהיר יותר האות 25Q ' מאטום לשקוף ', זה לעתים קרובות נדרש להשתמש הגדרה רכישה שונה בין פלסמידים שונים על מנת למנוע הרוויה של האות פלורסנט.
5. לעבד את התמונות באמצעות ImageJ²⁰ או תוכנות עיבוד תמונה. בשלב זה, רצוי האחוז של תאים כי התצוגה צבירה ניתן לחשב באופן ידני.

5. נקודה חשופה

הערה: ב פרוטוקול זה, נקודה חשופה משמש כדי לבדוק את רמות ביטוי של חלבונים. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.

1. צור lysates חלבון באמצעות חרוזי זכוכית במאגר פירוק (100 מ מ. טריס, pH 7.5; 200 מ מ NaCl; 1 מ"מ EDTA; 5% גליצרול, 1 מ dithiothreitol [DTT]). מוסיפים מעכבי פרוטאז, 4 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PSMF), מעכבי פרוטאז קוקטייל, ישירות לפני השימוש. גלולה 5 מ של התרבות לילה, resuspend זה µL 200 של חרוזי זכוכית, µL 200 פירוק המאגר. מערבולת 30 s ל-12 סיבובים. צנטריפוגה ב x 12,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע.
2. במקום כמות שווה של חלבונים הכולל על קרום ניטרוצלולוזה באמצעות מנגנון אוסמוזה הפוכה. Prewet את הקרום עם PBS ולהרכיב את המנגנון. להתחבר למקור ואקום ולוודא שהברגים הם הידקו. את הריב ולתת את המסנן מדגם דרך הקרום על ידי הכבידה.
3. לחסום את הקרום בחלב דל-שומן Tween/5% PBS - 0.05%.
4. דגירה הקרום עם נוגדן נגד דגל הראשי בן לילה ב 4 º C. הדגל אנטי monoclonal ש-m1 מומלץ.
5. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות כל אחד עם Tween PSB - 0.05%.
6. דגירה הקרום עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (אנטי עכבר IgG) לשעה בטמפרטורת החדר ב- PBS - 0.05% Tween/5% חלב ללא שומן.
7. רחץ ממברנה 3 x 10 דקות עם Tween PSB - 0.05%.
8. תמונות-כתם באמצעות מערכת תיעוד immunoblot.

תוצאות

FPs יש biophysical מאפיינים שונים, כולל שלהם נטייה oligomerize, אשר יכולים להשפיע על ההתנהגות של זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה היכן FPs מרובים יכולים נכרכים להרחבות polyQ רעילים. מאז polyQ רעילות תלויה מאוד רצפי איגוף למתוח את polyQ¹⁵, וזמינותו זו מ?...

Discussion

במאמר זה, מבחני שונים כדי למדוד את המצבור של Htt^ex1 polyQ הרחבות ואת השפעתם על צמיחת שמרים הועסקו כמודל ללמוד כמה שונה פלורסנט חלבונים לשנות זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט . באמצעות ה-GFP משתנה (ymsfGFP) כפקד חיובית, הראינו כי זה מזהה שינויים משמעותיים polyQ רעילות, צבירת בין תגי שונה פלורסנט, מא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354