Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

Resumen

El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.

Resumen

El estudio de las relaciones del sustrato de la quinasa es esencial tener una comprensión completa de las funciones de estas enzimas y sus objetivos downstream en Estados fisiológicos y patológicos. CK2 es una cinasa serina/treonina evolutivamente conservados con una creciente lista de centenares de sustratos implicados en múltiples procesos celulares. Debido a sus propiedades pleiotrópicos, identificar y caracterizar un conjunto amplio de sustratos de CK2 ha sido particularmente difícil y sigue siendo un obstáculo en el estudio de esta enzima importante. Para abordar este desafío, hemos ideado una estrategia experimental versátil que permite el enriquecimiento objetivo e identificación de posibles sustratos de CK2. Este protocolo aprovecha de la especificidad de sustrato Co dual única de CK2 permitiendo thiophosphorylation específico de sus sustratos en una célula o tejido lisado. Estas proteínas de sustrato son posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por líquido cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS). Previamente hemos utilizado este enfoque para identificar con éxito CK2 sustratos de Drosophila ovarios y aquí extendemos la aplicación del presente Protocolo a las células de glioblastoma humano, ilustrando la capacidad de adaptación de este método para investigar la funciones biológicas de esta quinasa en diversos organismos modelo y sistemas experimentales.

Introducción

Proteínas quinasas son componentes clave de cascadas de transducción de la señal. Fosforilación de las proteínas sustrato de estas enzimas produce respuestas biológicas que regulan eventos críticos que controla la división celular, el metabolismo y la diferenciación, entre otros. CK2 es una quinasa de serina/treonina ubicuo expresada, acidófilos que se conserva de la levadura a los seres humanos y que juega un papel importante en muchos procesos celulares que van desde la regulación transcripcional de la progresión del ciclo celular apoptosis^{1 ,2,3}. La enzima es un heterotet....

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Protocolo

Nota: Asegúrese de que los materiales están disponibles y preparados adecuadamente (véase Tabla de materiales).

1. preparación

1. Mecánicamente lyse muestra de tejido (1-2 mg de tejido en 100 μl de tampón de lisis, tabla 1) o cultivadas las células (placa de 10 cm que es 80-90% confluente en 350 μl de tampón de lisis,) con el objetivo de recolectar un total de 900 μl de la muestra para el experimento. Tenga en cuenta que este volumen es en ligero exceso de lo que se requiere para el experimento que se describe a continuación.
2. Desactivación de las muestras por centrifugación a 17.500 x g....

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Resultados

Un diagrama esquemático del procedimiento experimental se ofrece en la figura 1. La base subyacente de la técnica es la inusual habilidad de CK2 con GTP para la transferencia de grupo fosforilo. Además de holoenzyme de CK2 exógeno junto con el análogo del GTP, GTPγS, a un lisado celular resulta en thiophosphorylation de sustratos de CK2 endógenos. Posterior tratamiento de lisado con lo alquilantes reactivo p- Nitrobencilo mesilato (PNBM) gener.......

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Discusión

Aquí, describimos un método bioquímico relativamente simple para la identificación de sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja. Los pasos críticos de este protocolo se basan en las propiedades enzimáticas inusuales de CK2 e incluyen thiophosphorylation CK2 dependiente de las proteínas sustrato específico utilizando GTPγS y su posterior inmunoprecipitación e identificación. Con estos resultados, hemos demostrado la utilidad y versatilidad de este enfoque como ahora hemos.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mg/mL PNBM	Abcam	ab138910	40.5 µL
2.5 mM GTPγS	Sigma-Aldrich	G8634-1MG	5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-373894	1:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32233	1:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody	Abcam	ab22758	1:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab92570	Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºC	ThermoScientific	Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor	Roche	11836170001
Lysis Buffer	See recipe below	See recipe below	30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control)	Cell Signaling Technology	2729S	Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap Column	GE Healthcare	28-9180-10	3 columns
Protein A/G Plus Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003	600 µL
Recombinant human CK2 holoenzyme	New England Biolabs	P6010S	2.7 µL
Rotator	Labnet: Mini Labroller	Mini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cells	ATCC	CRL-1690
Water bath pre-set to 30ºC	Shel Lab	H20 Bath Series Model# SWB15