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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è di etichettare, arricchire e identificare i substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso come un lysate delle cellule o del tessuto omogeneizzato. Questo metodo sfrutta gli aspetti unici di CK2 biologia per questo scopo.

Abstract

Lo studio delle relazioni di chinasi-substrato è essenziale per ottenere una comprensione completa delle funzioni di questi enzimi e ai loro obiettivi a valle negli Stati sia fisiologici che patologici. CK2 è un'evolutivamente conservati serina/treonina chinasi con un crescente elenco di centinaia di substrati coinvolti in molteplici processi cellulari. Grazie alle sue proprietà pleiotropici, identificare e caratterizzare una serie completa di CK2 substrati è stato particolarmente impegnativo e rimane un ostacolo nello studio di questo importante enzima. Per affrontare questa sfida, abbiamo messo a punto una strategia sperimentale versatile che consente l'arricchimento mirato e l'identificazione di presunti CK2 substrati. Questo protocollo si avvale della specificità unica dual co-substrato di CK2 permettendo per specifici thiophosphorylation dei suoi substrati in una cellula o tessuto lisato. Queste proteine del substrato sono successivamente alchilati, immunoprecipitated e identificati mediante spettrometria di massa tandem/cromatografia liquida (LC-MS/MS). In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per identificare con successo CK2 substrati dalle ovaie di Drosophila e qui abbiamo estendere l'applicazione del presente protocollo alle cellule di glioblastoma umano, illustrando l'adattabilità di questo metodo per indagare il ruoli biologici di questa chinasi in vari organismi modello e sistemi sperimentali.

Introduzione

Chinasi di proteina sono componenti chiave delle cascate di trasduzione del segnale. La fosforilazione delle proteine substrato da questi enzimi suscita risposte biologiche che regolano gli eventi critici, controllo della divisione cellulare, il metabolismo e differenziazione, tra gli altri. CK2 è un'espressa ubiquitariamente, acidofilico serina/treonina chinasi che è conservata dal lievito all'uomo e che svolge i ruoli importanti in molti processi cellulari che vanno dalla regolazione trascrizionale di progressione del ciclo cellulare per apoptosi1 ,2,3. L'enzima è un heterotetramer composto da due α catalitico (o α') subunità e due di subunità β regolamentazione4. Oltre ad essere altamente pleiotropico, CK2 esibisce due altre caratteristiche insolite che complicano la sua analisi, vale a dire attività costitutiva5 e dual co-substrato specificità6. Quest'ultima proprietà dota CK2 con la possibilità di utilizzare GTP nonché ATP per fosforilazione delle proteine substrato.

Delezione genica delle subunità catalitica o regolamentazione di CK2 in topi provoca mortalità embrionale che indica che esso gioca un ruolo cruciale durante lo sviluppo e l'organogenesi7,8. CK2 anche overexpressed in diversi tipi di cancro e quindi rappresenta un promettente bersaglio terapeutico9,10,11. Infatti, inibitori specifici che attività di chinasi CK2 destinazione sono attualmente sotto inchiesta per questo scopo12,13,14. Mentre l'inibizione di CK2 è una valida opzione, data la sua natura pleiotropica, un'alternativa e forse più razionale approccio sarebbe target critici substrati CK2 che sottendono la progressione di alcuni tumori. Pertanto, la completa identificazione e caratterizzazione di proteine substrato CK2 sarebbe di beneficio significativo per delucidare le funzioni specifiche di questa chinasi all'interno di un particolare tipo di tessuto o del tumore.

Qui, descriviamo un metodo versatile biochimico per l'identificazione dei substrati di CK2 da un campione biologico complesso come una cellula o tessuto lisato. Questo protocollo sfrutta la specificità di co-substrato dual di CK2 dall'uso dell'analogo GTP GTPγS (guanosina 5'-[γ-thio]triphosphate) che non è possibile utilizzare altre chinasi endogene. Questo permette efficacemente la chinasi ad "etichettare" suoi substrati all'interno di questo campione per identificazione e isolamento successivo.

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Protocollo

Nota: Assicurarsi che i materiali necessari sono disponibili e adeguatamente preparati (Vedi Tabella materiali).

1. preparazione

  1. Meccanicamente lisare il campione di tessuto (1-2 mg di tessuto in 100 µ l di tampone di Lisi, tabella 1) o cellule (piastra di 10 cm che è 80-90% confluenti in 350 µ l di tampone di lisi), coltivate con l'obiettivo di raccogliere un totale di 900 µ l di campione per l'esperimento. Si noti che questo volume è in leggero eccesso di ciò che è richiesto per l'esperimento descritto di seguito.
  2. Rotazione verso il basso i campioni mediante centrifugazione a 17.500 x g per 3 minuti a 4 ° C. Al termine, è possibile trasferire 270 µ l del surnatante in ciascuna delle tre nuove microcentrifuga 1,7 mL. Ci saranno circa 90 µ l restanti. Rimuovere 40 µ l per essere utilizzato come un "controllo di input" e posto in un nuovo tubo. Mettere tutti i campioni sul ghiaccio.

2. analisi della chinasi di: thiophosphorylation e alchilazione

  1. Etichettare le tre provette contenenti 270 µ l ciascuna come segue: "chinasi rxn", "Solo GTPγS", e "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) solo". Preparare le reazioni di chinasi.
    1. Per il tubo "rxn chinasi", aggiungere 2,7 µ l (equivalente a 1.350 U) di CK2, quindi aggiungere 2,7 µ l di 2,5 mM GTPγS.
    2. Per il tubo "Solo GTPγS", aggiungere 2,7 µ l di 2,5 mM GTPγS e quindi aggiungere 2,7 µ l di tampone di lisi.
    3. Per il tubo "Solo PNBM", aggiungere 5,4 µ l di tampone di lisi. Scorri tutte le provette per mescolare e quindi collocare immediatamente sul ghiaccio.
  2. Incubare tutte le tre provette per 1 min in un bagno di acqua 30 ° C. A seguito di incubazione, è necessario aggiungere 13,5 µ l di 12 mg/mL PNBM a tutte le tre provette. Inverti per miscelare i campioni. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 1 h.
  3. Dopo aver avviato l'incubazione nel passaggio 2.2, preparare le colonne dissalazione più presto possibile, come il processo richiede circa 45 minuti.

3. preparazione di colonne di desalificazione

  1. Inizialmente preparare colonne (3 per questo esperimento di esempio) invertendo ogni colonna più volte per risospendere il Sephadex G-25 resina nel buffer di archiviazione. Lasciare che la resina a stabilirsi attaccando ogni colonna a un morsetto e lasciarlo riposare per circa 5 min.
  2. Dopo assestamento della resina Sephadex G-25, togliere i tappi dalla parte superiore e la parte inferiore della colonna per permettere al tampone di deposito di scarico per gravità e hanno un tubo posto sotto l'apertura inferiore per raccogliere il flusso continuo per l'eliminazione.
  3. Una volta che il buffer di memoria è esaurita, è possibile aggiungere circa 2,7 mL di tampone di lisi per equilibrare le colonne. Raccogliere il flusso continuo e scartare. Ripetere 3 volte. In seguito l'equilibratura finale, le colonne sono pronte per passo 4.1.

4. rimozione del PNBM

  1. Dopo l'incubazione di 1 h (punto 2.2) e preparazione della colonna (passaggio 3) sono state completate, è possibile applicare i campioni per le colonne. Etichetta ogni colonna come segue: "rxn chinasi", "Solo GTPγS" e "Solo PNBM". Carica tutti di ogni campione sulla sua rispettiva colonna. Raccogliere e gettare il flusso continuo.
  2. Lavare campioni aggiungendo 420 µ l di tampone di lisi per ogni colonna. Consentire il tampone di lisi filtrare attraverso la colonna e raccogliere il flusso continuo per l'eliminazione. A seguito di questo passaggio di lavaggio, è necessario inserire le provette in posizione per prelievo di campioni.
  3. Eluire campioni aggiungendo 500 µ l di tampone di lisi per ogni colonna. Raccogliere il flusso continuo che ora contiene thiophosphorylated e alchilati substrati di CK2.

5. immunoprecipitazione: Parte I

  1. Preparare i campioni per immunoprecipitazione prima rimozione µ l 80 per un campione di "controllo di input di eluizione" da ciascuno dei rispettivi eluizioni ("rxn chinasi", "Solo GTPγS" e "Solo PNBM") raccolti al punto 4.3. A seguito di rimozione di 80 µ l di ogni campione, ci saranno circa 420 µ l restanti per campione.
    1. Dividere ogni campione in 2 provette contenenti 200 µ l. Etichettare ogni rispettiva provetta: "estere di anti-thiophosphate rxn chinasi", "chinasi rxn IgG", "Ester anti-tiofosfato GTPγS", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" e "PNBM IgG".
  2. Aggiungere 2,8 µ g di anticorpo estere anti-thiophosphate a ciascuno dei tubi anti-thiophosphate estere-etichettati e 2,8 µ g di isotipo dell'anticorpo di controllo per ciascuna delle provette IgG-etichettati. Inserire le provette in un rotatore a 4 ° C per 2 h.
  3. Iniziare la preparazione del branello di proteina A/G durante gli ultimi 15 minuti dell'incubazione 2 h al punto 5.2.

6. preparazione della perla dell'agarosi A/G di proteine

  1. Brevemente il vortice il tubo di storage per garantire perline sono completamente ri-sospensione. Tagliare l'estremità di un P200 puntale utilizzando una lama di rasoio pulita al fine di aumentare il calibro dimensione. Pipettare 100 µ l del liquame perlina per immunoprecipitazione in un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL. In questo esempio, sono necessari un totale di 6 tubi.
  2. Centrifugare le provette a 17.500 x g per 1 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e scartare. Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di lisi e brevemente vortice. Ripetere lo spin e lavare passi 3 volte.
  3. Dopo il lavaggio finale, mettere le perline sul ghiaccio fino a quando l'incubazione nel passaggio 5.2 è completa.

7. immunoprecipitazione: Parte II

  1. Dopo l'incubazione di 2h dal punto 5.2, rallentare i campioni a 17.500 x g per 3 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione aggiungere 200 µ l di ogni campione per i tubi con le perline lavate. Posizionare i tubi sull'agitatore a 4 ° C per 1 h.
  2. Dopo l'incubazione di 1h, centrifugare le provette a 17.500 x g per 1 min a 4 ° C. Successivamente rimuovere 40 µ l di supernatante da ogni campione e salvare come un "controllo di svuotamento" (totale 6 tubi). Rimuovere il resto del surnatante e scartare. Fare attenzione a non per disturbare le perline.
  3. Lavare i campioni con l'aggiunta di 200 µ l di tampone di lisi e Vortex brevemente. Poi Centrifugare a 17.500 x g per 1 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere il lavaggio e spin passi 3 volte. Fare attenzione a non per disturbare le perle durante questi passaggi.
  4. Dopo aver completato le fasi di lavaggio, aggiungere 50 µ l di tampone di campione x 2 per ogni campione contenente microsfere. Per tutti gli altri campioni, aggiungere 8 µ l di sample buffer 6x: "controllo di input", "controlli di input di eluizione" e "controlli di svuotamento".
  5. Una volta che viene aggiunta ai tubi, dispensare su e giù per mescolare e riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 5 minuti prima di procedere con SDS-PAGE.

8. analisi/validazione dei risultati

  1. Convalidare l'alchilazione e successo CK2-dipendente thiophosphorylation.
    1. Per determinare l'efficacia di thiophosphorylation CK2-mediata nel passaggio 2.2, eseguire SDS-PAGE e Western blotting eseguendo 15-20 µ l dei "eluizione controlli di input" raccolti nel passaggio 5.1 su un gel di poliacrilammide del 12,5%.
    2. Sonda di membrane con i seguenti anticorpi: anti-thiophosphate estere, anti-CK2α e anti-GAPDH (o un altro controllo caricamento appropriato). Se questo passaggio è stato completato, un segnale di ester avanzata anti-thiophosphate dovrebbe essere evidente nella corsia "chinasi rxn" rispetto alle altre due corsie (Figura 2).
  2. Visualizzare substrati arricchiti putativi di CK2 e determinare l'identità della proteina.
    1. Per valutare se i passaggi di immunoprecipitazione riuscivano, eseguire 25-30 µ l dei campioni eluiti dalle perline nel passaggio 7.4 su un gel di poliacrilammide 12,5% separato. Assicurarsi che tutte le attrezzature sono pulita e indossare guanti in qualsiasi momento durante questo passaggio per minimizzare la contaminazione.
    2. Il gel con Coomassie. macchia blu per visualizzare proteine arricchite dalle varie fasi del protocollo sperimentale (Figura 3). Utilizzando lamette nuove, asportare accuratamente unici bande presenti nella corsia "chinasi rxn anti-thiophosphate estere IP", notando la loro pesi molecolari approssimativi.
    3. Presentare queste bande per identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa tandem/cromatografia liquida (LC-MS/MS) (Figura 4). Se gli anticorpi diretti contro le proteine identificate sono disponibili, confermare i risultati della spettrometria di massa da SDS-PAGE e immunoblotting di input, impoverito e frazioni IP raccolti durante il corso del protocollo (Figura 4).

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Risultati

Nella Figura 1viene fornito un diagramma schematico della procedura sperimentale. Alla base della tecnica è la capacità insolita di CK2 utilizzare GTP per trasferimento del gruppo fosforile. Aggiunta di esogeno CK2 holoenzyme insieme con l'analogo del GTP, GTPγS, per un lysate delle cellule provoca thiophosphorylation di substrati endogeni CK2. Il trattamento successivo del lisato con l'alchilanti reagente p- nitrobenzyl mesylate (PNBM) genera una...

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Discussione

Qui, descriviamo un metodo relativamente semplice biochimico per l'identificazione dei substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso. I passaggi critici del presente protocollo si basano sull'insolita proprietà enzimatiche di CK2 e includono CK2-dipendente thiophosphorylation delle proteine substrato specifico utilizzando GTPγS e loro successiva immunoprecipitazione e identificazione. Con questi risultati, abbiamo dimostrato l'utilità e la versatilità di questo approccio come ora...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione del Commonwealth universale ricerca Enhancement Pennsylvania dipartimento della sanità di t.i.s.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040.5 µL
2.5 mM GTPγSSigma-AldrichG8634-1MG5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibodyAbcamab227581:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibodyAbcamab92570Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºCThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protease InhibitorRoche11836170001
Lysis BufferSee recipe belowSee recipe below30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control)Cell Signaling Technology2729S Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap ColumnGE Healthcare28-9180-103 columns
Protein A/G Plus Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 µL
Recombinant human CK2 holoenzymeNew England BiolabsP6010S2.7 µL
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cellsATCCCRL-1690
Water bath pre-set to 30ºCShel LabH20 Bath Series Model# SWB15

Riferimenti

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