JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Özet

Kinaz-substrat ilişkileri Bu enzimler ve aşağı akım hedeflerine fizyolojik ve patolojik Birleşik Devletleri fonksiyonları tam bir anlayış kazanmak için önemli bir çalışmadır. CK2 bir evrimsel korunmuş serin/treonin kinaz ile gittikçe artan sayıda yüzeylerde birden çok hücresel süreçlerinde yer alan yüzlerce var. Pleiotropic özellikleri nedeniyle belirlenmesi ve CK2 yüzeylerde kapsamlı bir dizi karakterize özellikle zor olmuştur ve bu önemli enzim çalışmada bir engel olarak kalır. Bu sorun adrese hedeflenen zenginleştirme ve sözde CK2 yüzeylerde tanımlaması sağlayan çok yönlü bir deneysel strateji geliştirmiştir. Bu iletişim kuralı, bir hücre veya doku onun yüzeylerde özel thiophosphorylation için lysate izin benzersiz Çift ortak substrat özgüllüğü CK2 yararlanır. Daha sonra bu substrat proteinler vardır, immunoprecipitated, alkylated ve sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) tarafından tespit edilmiştir. Biz daha önce bu yaklaşım başarılı bir şekilde CK2 yüzeylerde Drosophila yumurtalıklar üzerinden tanımlamak için kullanılan ve burada araştırmak için bu yöntemin uyum gösteren insan glioblastoma hücreleri, bu iletişim kuralını uygulamaya uzatmak Bu kinaz çeşitli model organizmalar ve deneysel sistemleri biyolojik rolleri.

Giriş

Protein kinaz sinyal iletim cascades anahtar bileşenleridir. Fosforilasyon tarafından Bu enzim substrat proteinlerin biyolojik yanıt-e doğru kontrol hücre bölünmesi, metabolizma ve farklılaşma, diğerleri arasında kritik olayları düzenleyen ortaya çıkarır. Bu Maya insanlar için korunmuş ve bu transkripsiyon Yönetmeliği hücre döngüsü ilerleme apoptosis1 kadar uzanan birçok hücresel süreçler önemli roller oynar ubiquitously ifade, acidophilic serin/treonin kinaz CK2 olduğunu ,2,3. İki katalitik α oluşan bir heterotetramer enzimdir (veya α') alt birimleri ve iki düzenleyici β alt birimleri4. Son derece pleiotropic olmasının yanı sıra, CK2, analizleri, karmaşık hale iki diğer sıradışı özellikleri Yani bünye etkinlik5 ve ikili ortak substrat özgüllüğü6sergiler. Bu ikinci özellik GTP hem de ATP substrat protein fosforilasyon için kullanma yeteneği ile CK2 endows.

Embriyonik ölümcül geliştirme ve organogenesis7,8sırasında çok önemli roller oynayan gösteren CK2 katalitik veya düzenleyici altbirimden farelerde genetik silinmesiyle sonuçlanır. CK2 de kanser çeşitli overexpressed ve böylece gelecek vaat eden bir terapötik hedef9,10,11temsil eder. Gerçekten de, belirli inhibitörleri bu hedef CK2 kinaz aktivitesi vardır şu anda bu amaç12,13,14soruşturma altında. Süre CK2 inhibisyonu pleiotropic doğası, alternatif verilen uygun bir seçenek ve belki de daha akılcı yaklaşım bazı kanserler ilerlemesini altında yatan kritik CK2 yüzeylerde hedef olacaktır. Bu nedenle, kapsamlı kimlik ve CK2 yüzey proteinleri karakterizasyonu bu kinaz belirli bir doku veya tümör tür içinde belirli function(s) elucidating için önemli yararı olacaktır.

Burada, bir hücre veya doku lysate gibi karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden CK2 yüzeylerde tanımlamak için çok yönlü bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı CK2 ikili ortak substrat özgüllüğü GTP analog GTPγS (diğer endojen kinaz kullanamazsınız guanozin 5'-[γ-thio]triphosphate). kullanımı tarafından yararlanır Bu etkili bir şekilde "onun yüzeylerde içinde bu örnek sonraki yalıtım ve kimlik için etiketlemek" kinaz sağlar.

Protokol

Not: gerekli malzemeler kullanılabilir ve düzgün hazırlanmış olduğundan emin olun ( Tablo malzemelerigörmek).

1. hazırlık

  1. Mekanik olarak doku örneği (1-2 mg 100 µL lizis arabelleği, Tablo 1doku) koşullar veya toplam 900 µL deney için örnek toplamak için amaç ile hücreleri (10 cm tabak), lizis arabelleği 350 µL % 80-90 birleşmesi olan kültürlü. Bu birim ne aşağıda açıklanan deney için gerekli olduğu hafif fazla olduğuna dikkat edin.
  2. 4 ° C'de 3 dakika 17.500 x g de Santrifüjü tarafından örnekleri spin Tamamlandıktan sonra her üç yeni 1.7 mL microcentrifuge tüpler süpernatant ile 270 µL aktarın. Yaklaşık 90 µL kalan olacak. Bir "giriş denetimi" ve yeni bir tüp yerde kullanılmak üzere 40 µL kaldırın. Tüm örneklerini Buza koyun.

2. kinaz tahlil: thiophosphorylation ve alkillenme

  1. 270 µL aşağıdaki gibi içeren üç tüpler etiket: "kinaz rxn", "Sadece GTPγS", ve "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) sadece". Kinaz reaksiyonlar hazırlayın.
    1. "Kinaz rxn" tüp CK2, 2.7 µL (1350 U eşdeğer) ekleyin, sonra 2.5 mm GTPγS 2.7 µL ekleyin.
    2. "Sadece GTPγS" tüp 2.5 mm GTPγS 2.7 µL ekleyin ve sonra lizis arabelleği 2.7 µL ekleyin.
    3. "Sadece PNBM" tüp lizis arabelleği 5.4 µL ekleyin. Tüm tüplere karıştırın ve daha sonra hemen yere buz üzerinde hafifçe vur.
  2. Tüm üç tüpler 30 ° C su banyosunda 1 dk. için kuluçkaya. Kuluçka 12 mg/ml PNBM 13.5 µL tüm üç tüpler için ekleyin. Örnekleri karıştırmak için ters çevir. Bu örnekler, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  3. Kuluçka adım 2.2 başlattıktan sonra desalting sütun işlemi yaklaşık 45 dakika sürer gibi en kısa zamanda hazır olun.

3. sütun desalting hazırlık

  1. Başlangıçta sütun (3 Bu örnek deneme için) her sütunu yeniden askıya Sephadex G-25 reçine depolama arabellek birkaç kez ters çevirme hazırlayın. Reçine her sütun için bir kelepçe stand ekleyerek ve yaklaşık 5 dakika için rahatsız edilmeden oturmak izin tarafından yerleşmek izin verir.
  2. Sephadex G-25 reçine yerleşme aşağıdaki düşük yerçekimi tarafından drenaj ve akışı üzerinden atmak için toplamak için alt açıklıklı aşağıda yerleştirilen bir tüp var depolama arabellek sütunun alt ve üst kapaklar kaldırabilirsiniz.
  3. Depolama arabellek tükendiğinde, yaklaşık 2.7 mL lizis arabellek sütunları equilibrate için ekleyin. Akışı aracılığıyla toplamak ve atın. 3 kez tekrarlayın. Son denge sütunları 4.1 adım için hazır.

4. PNBM kaldırılması

  1. 1 h kuluçka (Adım 2.2) ve sütun hazırlık (Adım 3) tamamlandıktan sonra örnekleri sütunlarla. Her sütun aşağıdaki gibi etiketleyin: "kinaz rxn", "Sadece GTPγS" ve "Sadece PNBM". Yük tüm ilgili sütuna her örneğinin. Toplamak ve akışı aracılığıyla atın.
  2. Örnekleri her sütun için 420 µL lizis arabelleği ekleyerek yıkayın. Lizis arabellek sütun filtre ve akışı üzerinden atmak için toplamak izin. Bu yıkama adım tüpler örnekleri topluluğu için pozisyon yerleştirin.
  3. Örnekleri her sütun için 500 µL lizis arabelleği ekleyerek elute. Akış-şimdi thiophosphorylated ve alkylated CK2 yüzeylerde içeren aracılığıyla toplamak.

5. Immunoprecipitation: Bölüm ı

  1. Örnekleri immunoprecipitation için ilk kaldırma 80 µL her ("kinaz rxn", "Sadece GTPγS" ve "Sadece PNBM") ilgili elutions adım 4.3 toplanan "elüsyon denetim giriş" örnek için hazırlayın. Her örnek üzerinden 80 µL kaldırılmasını, örnek kalan yaklaşık 420 µL olacak.
    1. Her örnek 200 µL içeren 2 tüpler içine bölünmüş. İlgili her tüpün etiket: "kinaz rxn anti-thiophosphate ester", "kinaz rxn IgG", "GTPγS anti-thiophosphate ester", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" ve "PNBM IgG".
  2. Anti-thiophosphate ester antikor her anti-thiophosphate ester etiketli tüplerinin 2.8 µg ve izotip kontrol antikor IgG etiketli tüpler herbiri için 2.8 µg ekleyin. Tüpler 4 ° C 2 h için bir rotator yerleştirin.
  3. Protein A/G boncuk hazırlanması sırasında son 15 dk, 2 h kuluçka adım 5.2 başlar.

6. protein A/G özel boncuk hazırlık

  1. Kısaca girdap boncuk sağlamak için depolama tüp tamamen yeniden askıya alınmış. Bir P200 ucunu kesmek pipet ucu artırmak için temiz bir jilet kullanarak boyutu ölçer. Damlalıklı 100 µL boncuk Bulamaç başına yeni bir 1,7 mL microcentrifuge tüp içine immunoprecipitation. Bu örnekte, toplam 6 tüplerinin ihtiyaç vardır.
  2. 17500 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırmak ve atın. Boncuk lizis arabellek ve kısaca girdap 200 µL yeniden askıya alma. Spin yineleyin ve adımları 3 kez yıkayın.
  3. Adım 5.2 kuluçka tamamlanana kadar son yıkama boncuk Buza koyun.

7. Immunoprecipitation: Part II

  1. 5.2. adımdaki 2 h kuluçka sonra spin aşağı 17.500 x g 4 ° C'de 3 dk de örnekleri Santrifüjü 200 µL yıkanmış boncuk tüplerini her örnek ekleyin. Tüpler 4 ° C için 1 h bir rotator yerleştirin.
  2. 1 h kuluçka 17.500 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tüpler santrifüj kapasitesi Sonraki 40 µL süpernatant, her örnekten kaldırmak ve "tükenmesi denetimi" olarak kaydetmek (Toplam 6 tüpler). Süpernatant ve atma kısmı kaldırın. Boncuk bozmamaya özen.
  3. Örnekleri lizis arabellek ve vortexing 200 µL kısaca ekleyerek yıkayın. 17500 x g 4 ° C'de 1 dk. için de santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırmak ve atın. Yıkama tekrarlayın ve adımları 3 kere dön. Boncuk bu adımları uyguladığınızda bozmamaya özen.
  4. Yıkama adımları tamamladıktan sonra 2 x örnek arabelleği 50 µL boncuk içeren her örnek ekleyin. Diğer örnekler için örnek arabellek x 6 8 µL ekleyin: "giriş", "elüsyon giriş denetimleri" ve "tükenmesi denetimi".
  5. Bir kez arabellek tüpler, yukarı ve aşağı karıştırmak ve tüm örneklerini SDS-sayfa işlemine devam etmeden önce 5 min için 95 ° c ısı damlalıklı eklenir.

8. sonuçlarının analizi/doğrulama

  1. Başarılı CK2 bağlı thiophosphorylation ve alkillenme doğrulayın.
    1. CK2-aracılı thiophosphorylation adım 2.2 etkinliğini belirlemek için SDS-sayfa ve Western Blot 15-20 µL "Adım %5.1 12,5 polyacrylamide jel üzerinde toplanan elüsyon giriş denetimleri" çalıştırarak gerçekleştirin.
    2. Membranlar aşağıdaki antikorlar ile yoklama: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α ve anti-GAPDH (veya diğer uygun yükleme denetimi). Bu adım başarılı olursa, bir gelişmiş anti-thiophosphate ester sinyal diğer iki şeritli (Şekil 2) göre "kinaz rxn" şeritte belirgin olmalıdır.
  2. CK2 zenginleştirilmiş sözde yüzeylerde görselleştirmek ve protein kimliği belirlenemedi.
    1. İmmunoprecipitation adım başarılı olursa değerlendirmek için 25-30 µL kimden adım 7,4 üzerinde ayrı bir % 12,5 polyacrylamide jel boncuklar eluted örnekleri çalıştırın. Tüm ekipmanları temiz ve giyim eldiven her zaman bu adımı sırasında kontaminasyon en aza indirmek için emin olun.
    2. Jel Coomassie ile zenginleştirilmiş proteinler (şekil 3) deneysel protokol çeşitli aşamalarında gelen görselleştirmek için mavi leke. Yeni razorblades kullanarak, dikkatli bir şekilde onların yaklaşık moleküler ağırlık belirterek "kinaz rxn anti-thiophosphate ester IP" şeritte tüketim benzersiz grup mevcut.
    3. Bu grup protein tanımlama için sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) (şekil 4) gönderin. Yönetmen saptanan proteinler karşı antikor yoksa, SDS-sayfa tarafından kütle spektrometresi sonuçlarını ve immunoblotting, onaylayın giriş, tükenmiş ve IP kesirler Protokolü (şekil 4) boyunca toplanan.

Sonuçlar

Deneysel işlemin bir şematik diyagramı şekil 1' de verilmiştir. Temel teknik GTP phosphoryl grup transferi için alışılmadık kullanabilme, CK2 temelidir. Ayrıca eksojen CK2 holoenzyme ile birlikte bir hücreye lysate GTP analog, GTPγS, endojen CK2 yüzeylerde thiophosphorylation içinde sonuçlanır. Sonraki tedavi etmen reaktif p- nitrobenzyl (PNBM) mesylate ile lysate, o zaman bir anti-thiophosphate ester antikor kullanarak immunoprecipi...

Tartışmalar

Burada, karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden protein kinaz CK2 yüzeylerde tanımlamak için nispeten basit bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol kritik adımları CK2 enzimatik sıradışı özelliklerini temel alan ve CK2 bağlı thiophosphorylation GTPγS ve onların sonraki immunoprecipitation ve kimlik kullanarak belirli yüzey proteinleri içerir. Şimdi bu strateji insan glioblastoma hücreleri ve Drosophila yumurtalık18uyguladığınız gibi bu s...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser kısmen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı T.I.S. bir İngiliz Milletler Topluluğu evrensel araştırma geliştirme hibe tarafından desteklenmiştir

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040.5 µL
2.5 mM GTPγSSigma-AldrichG8634-1MG5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibodyAbcamab227581:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibodyAbcamab92570Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºCThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protease InhibitorRoche11836170001
Lysis BufferSee recipe belowSee recipe below30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control)Cell Signaling Technology2729S Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap ColumnGE Healthcare28-9180-103 columns
Protein A/G Plus Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 µL
Recombinant human CK2 holoenzymeNew England BiolabsP6010S2.7 µL
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cellsATCCCRL-1690
Water bath pre-set to 30ºCShel LabH20 Bath Series Model# SWB15

Referanslar

  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 144kazein kinaz 2CK2protein kinazsubstrat kimlikfosforilasyonkinaz tahlilKimya Biyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır