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Resumen

Este protocolo describe la síntesis y caracterización de un transporte- cyclooctene (TCO)-modifica un radioligando de Lu-labeled tetrazina (Tz) 177para radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) y el anticuerpo. Además, detalla el uso de estas dos construcciones en vivo biodistribución y estudios longitudinales de la terapia en un modelo murino de cáncer colorrectal.

Resumen

La radioinmunoterapia (RIT) es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer, la vida media larga farmacocinética de anticuerpos radiactivos puede resultar en altas dosis de radiación a los tejidos sanos. Tal vez no es de extrañar varias estrategias diferentes se han desarrollado para eludir esta limitación preocupante. Uno de los más prometedores de estos enfoques es pretargeted radioinmunoterapia (PRIT). PRIT se basa en disociar el radionúclido de la inmunoglobulina, inyectarlas por separado y luego lo que les permite combinar en vivo en el tejido diana. Este enfoque aprovecha las propiedades excepcionales de tumor targeting de anticuerpos mientras que bordea sus inconvenientes farmacocinéticos, bajar las dosis de radiación a los tejidos no Diana y facilitar el uso de radionúclidos con vidas medias que son considerado demasiado corto para uso en radioimmunoconjugates tradicional. En los últimos cinco años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la reacción de Diels-Alder (IEDDA) de demanda electrónica inversa entre transporte- cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz). Esta estrategia se ha aplicado con éxito a pretargeted tomografía por emisión de positrones (PET) y computarizada por emisión de fotón único tomografía (SPECT) proyección de imagen con una variedad de sistemas antígeno-anticuerpo. En un par de publicaciones recientes, hemos demostrado la eficacia de PRIT IEDDA basado en modelos murinos de adenocarcinoma ductal de páncreas y carcinoma colorrectal. En este protocolo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7- Tz) y una variante modificada de TCO del cáncer colorrectal a anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más concretamente, vamos a describir la construcción de huA33-TCO, la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7- Tz y el rendimiento de biodistribución en vivo y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal.

Introducción

La radioinmunoterapia (RIT), el uso de anticuerpos para la entrega de los radionucleidos terapéuticos para tumores — ha sido un enfoque atractivo para el tratamiento de cáncer1,2. De hecho, esta promesa ha sido puesto de relieve por la aprobación de los Estados Unidos administración de alimentos y drogas de dos radioimmunoconjugates para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan y 131-tositumomab3 , 4. sin embargo, incluso desde sus primeros días, las perspectivas clínicas de RIT han visto obstaculizadas por una complicación crítica: las tasas de dosis alta de radiación a tejidos sanos5,6. En general, radioimmunoconjugates de RIT están marcados con radionucleidos de larga vida (p. ej., 131I [t½ = 8,0 días] y 90Y [t½ = 2,7 días]) con vida media física que encajar bien con la largo farmacocinética vida media de las inmunoglobulinas. Esto es esencial, como asegura que eso suficiente radiactividad sigue siendo una vez que el anticuerpo ha alcanzado su biodistribución óptimos después de varios días de circulación. Sin embargo, esta combinación de tiempos de residencia largos en la sangre y vida media larga física resulta inevitablemente en la irradiación de los tejidos sanos, lo que reducir la relación terapéutica y limitar la eficacia de la terapia7. Se han explorado diversas estrategias para evitar este problema, incluyendo el uso de fragmentos de anticuerpos truncado como Fab, Fab', F(ab')2, minibodies y nanobodies8,9,10. Una de las más prometedoras y fascinante, pero indudablemente complejos enfoques alternativos es en vivo pretargeting11.

En vivo pretargeting es una aproximación a la proyección de imagen nuclear y la terapia que busca aprovechar la exquisita afinidad y selectividad de anticuerpos mientras bordeando sus inconvenientes farmacocinéticos11,12,13. Para ello, los anticuerpos radiactivos utilizados en la radioinmunoterapia tradicional es deconstruido en dos componentes: un radioligando de molécula pequeña y un immunoconjugate que puede enlazar tanto un antígeno de tumor y el ya mencionado así. El immunoconjugate se inyecta primero y da una ventaja, a menudo varios días, durante el cual se acumula en el tejido diana y elimina de la sangre. Posteriormente, se administra el radioligando de molécula pequeña y combina con el immunoconjugate en el tumor o elimina rápidamente del cuerpo. En esencia, en vivo pretargeting se basa en realizar radiochemistry dentro del propio cuerpo. Al reducir la circulación de la radiactividad, este enfoque reduce la dosis de radiación a los tejidos sanos y simultáneamente facilita el uso de radionucleidos (p. ej., 68Ga, t½ = min 68211; Como t½ = 7,2 h) con vida media que normalmente se considera incompatible con vectores basados en anticuerpos.

A partir de la década de 1980, un puñado de diferentes enfoques en vivo pretargeting han sido desarrollados, incluyendo estrategias basadas en la interacción estreptavidina-biotina, tienen anticuerpos y la hibridación de complementarios oligonucleótidos14,15,16,17,18. Pero cada uno se ha celebrado nuevamente en diversos grados por complicaciones, más famosa la inmunogenicidad potente de anticuerpos modificados de estreptavidina19,20. En los últimos cinco años, nuestro grupo y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la ligadura rápido y bioorthogonal inversa electrónica demanda Diels-Alder entre transporte- cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz) 2122,de,23,24. La más exitosa de estas estrategias ha utilizado un anticuerpo modificado de TCO y un radioligando Tz-cojinete, como TCO es normalmente más estable en vivo que su Tz socio (figura 1)25,26. Como en otras metodologías pretargeting, el immunoconjugate mAb-TCO es administrado en primer lugar y dado el tiempo para borrar de la circulación y se acumulan en el tejido del tumor. Posteriormente, se inyecta el radioligando Tz de molécula pequeña, después de lo cual hace clic con el immunoconjugate dentro del tejido de destino o elimina rápidamente del cuerpo. Esta en vivo pretargeting estrategia ha demostrado ser altamente eficaz para PET y SPECT proyección de imagen con varios sistemas diferentes anticuerpos/antígeno, constantemente produciendo imágenes con alto contraste y que permite el uso de radionuclides de breve duración tales como 18 F (t½ = 109 min) y 64(t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Más recientemente, la eficacia de la base haga clic en la radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) ha demostrado en modelos murinos de la adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) y carcinoma colorrectal27,28. Para ello, la terapéutica con radionúclidos 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 días) fue empleado junto con dos anticuerpos diferentes: 5B1, que apunta a antígeno carbohidrato 19.9 (CA19.9) ubicuo expresado en PDAC , y huA33, que dirige el A33, una glicoproteína transmembrana expresa en > 95% de los cánceres colorrectales. En ambos casos, este enfoque 177Lu-PRIT produjo concentraciones de alta actividad en tejido tumoral creó un efecto terapéutico dependiente de la dosis y al mismo tiempo reduce las concentraciones de actividad en los tejidos sanos en comparación con el tradicional directamente-con la etiqueta radioimmunoconjugates.

En este artículo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7- Tz) y una variante modificada de TCO del anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más específicamente, se describe la construcción de huA33-TCO (figura 2), la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7- Tz (figura 3 y figura 4) y el rendimiento de en vivo biodistribución y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal. Además, en los resultados representativos y discusión, presentamos un conjunto de datos de muestra, posibles estrategias de dirección para la optimización de este enfoque y considerar esta estrategia en el contexto más amplio de en vivo pretargeting y PRIT. Por último, es importante tener en cuenta que si bien hemos optado por centrarse en pretargeting con huA33-TCO y [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz en este protocolo, esta estrategia es altamente modular y se puede adaptar a una amplia gama de anticuerpos y radionúclidos.

Protocolo

Todos en vivo animal los experimentos descritos en este trabajo fueron realizados según protocolos aprobados y ejecutados bajo los lineamientos éticos del Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center y Hunter College Cuidado institucional de los animales y los comités de uso (IACUC).

1. la preparación de huA33-TCO

Nota: La síntesis de huA33-TCO ha sido previamente reportado29. Sin embargo, para facilidad del lector, que es replicado aquí con ajustes para las condiciones óptimas.

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare una solución de 125 μL de (E) - cyclooct - 4-propenil 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonato (TCO-NHS) en seco dimetil formamida (DMF) en una concentración de 40 mg/mL (0,15 M). Esta solución puede alícuotas congeladas a-80 ° C para su uso en futuros experimentos.
  2. En un tubo de microcentrífuga separada 1,7 mL, prepare una solución de 5 mg/mL de huA33 en 1 mL de tampón fosfato salino (PBS; 2,7 mM cloruro de potasio, cloruro de sodio de 137 mM y 11,9 mM fosfato potasio, fosfato, pH 7,4).
  3. Utilizando pequeñas alícuotas (< 5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajustar el pH de la solución de anticuerpo de paso 1.2 8.8-9.0. Utilizar papel pH o un medidor de pH con un microelectrodo para vigilar el pH y tenga cuidado que el pH no sea mayor a 9.0.
  4. A la solución de anticuerpo descrita en el paso 1.3, agregue lentamente un volumen correspondiente a 40 molares equivalentes de TCO-NHS en relación con la cantidad de anticuerpos. Por ejemplo, si 5 mg (30 nmol) de huA33 está en la solución, añadir 9,0 μL (1,20 μmol) de la solución de 40 mg/mL (0,15 M) de TCO-NHS.
    Nota: TCO-NHS es hidrofóbico. Cuando se agrega a la solución de anticuerpo, agregar lentamente y con agitación para evitar la precipitación. No exceda 10% DMF en volumen de la solución de reacción final.
  5. Permite la reacción a incubar a 25 ° C en un Termomezcladores de 1 h con suave agitación (500 rpm).
  6. Después de 1 h, purificar el immunoconjugate huA33-TCO usando una columna de desalación de exclusión de tamaño desechable empacadas.
    1. Equilibrar la columna de exclusión de tamaño como se describe por el proveedor para eliminar conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. Un procedimiento típico consiste en lavar la columna 5 x con un volumen de PBS que corresponde al volumen de la columna: 5 x 2, 5 mL de PBS.
    2. Añadir la mezcla de reacción a la columna de exclusión de tamaño teniendo en cuenta el volumen de la mezcla de reacción.
    3. Después de la mezcla de reacción ha entrado en la columna, agregar una cantidad apropiada de PBS para llevar el volumen total de solución añadida a la columna a 2,5 mL. Por ejemplo, si la reacción verbal dio lugar a un volumen total de 1,3 mL, agregar 1,2 mL de PBS adicional a la columna.
    4. Recoger el producto con 2 mL de PBS como eluyente.
      Nota: Este paso dará el final de la construcción huA33-TCO en 2 mL de PBS, pH 7,4.
  7. Medir la concentración de la TCO de huA33 usando un espectrofotómetro UV-Vis, control de la longitud de onda de 280 nm. El coeficiente de extinción molar para IgGs la mayoría (ε280) es de 210.000 M-1cm-1.
  8. Si se desea una solución con una concentración más alta de immunoconjugate, concentrar la solución de huA33-TCO con una unidad de filtro centrífugo de un corte de peso molecular 50.000 siguiendo las instrucciones del fabricante.
    Nota: Muchos anticuerpos se han sabido para agregado o precipitar durante la concentración. Al intentar este procedimiento con un nuevo anticuerpo, los investigadores deben aplazar hasta la literatura o su propia experiencia el anticuerpo en cuestión.
  9. Almacenar el immunoconjugate terminado huA33-TCO a 4 ° C en la oscuridad, si es necesario inmediatamente. Si se va a utilizar más de 4 días en el futuro, almacenar a-80 ° C en la oscuridad.
    Nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El immunoconjugate terminado huA33-TCO debe ser estable para el almacenamiento de al menos 6 meses a-80 ° C en la oscuridad.

2. la síntesis de Tz-PEG7- NHBoc

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, disolver 5 mg de tetrazina N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) de 0.15 mL de anhidro dimetil sulfóxido (DMSO).
  2. En un tubo de microcentrífuga separada 1,7 mL, disolver 8 mg de Boc-protegido amino PEG polímero, glicol O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol) de 0.15 mL de DMSO anhidro.
  3. A la solución de Tz-NHS, agregar 3 μL (21,3 μmol, 1,7 equivalentes molares) de trietilamina (TEA) y mezclar bien.
  4. Añadir la solución rosa tetrazina para la solución de PEG NHBoc7-NH2 del paso 2.2 e incubar la mezcla de reacción durante 30 min a temperatura ambiente (RT) con agitación suave.
  5. Después de 30 minutos, diluir la reacción 1:1 en H2O y purificar la reacción utilizando cromatografía líquida del alto rendimiento de la18 C fase inversa (CLAR) para separar cualquier Tz-NHS no reaccionado de la Tz-PEG7- NHBoc. Utilice disolventes sin ácido para evitar la eliminación prematura de la Boc protección de grupo. Monitorear ambos Tz-PEG7- NHBoc y Tz-NHS en una longitud de onda de 525 nm.
    Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etcetera), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos sin ningún aditivo) a 95: 5 MeCN/H2O más de 30 min, se utilizan un caudal de 1 mL/min y una columna de18analítica 4,6 x 250 mm C , los tiempos de retención de NHS Tz y Tz-PEG7- NHBoc son alrededor de 16 minutos y 18 minutos, respectivamente.
  6. Congelar el eluyente recogido de HPLC utilizando nitrógeno líquido y envuelva el tubo de la colección congelado ahora en papel de aluminio. Lugar el tubo de la colección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un sólido de color rosa brillante característico.
    Nota: Si no hay nitrógeno líquido congelar el eluyente HPLC recogido en hielo seco o durante la noche en un congelador de-80 ° C.

3. la síntesis de Tz-PEG7-NH2

  1. Al producto del paso 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, añadir 1,5 mL de diclorometano (DCM) y transferir esta solución a un matraz de fondo redondo pequeño.
  2. Añadir 0,25 mL de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota a la solución de rosa de paso 3.1.
  3. Permite la reacción a incubar por 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  4. Después de 30 min, evaporar el solvente a través de evaporación rotatoria. No exceda una temperatura de baño de agua de 37 ° C.
  5. Reconstituir el producto viscoso rosado en 0,5 mL de agua.
  6. Purificar el producto usando fase inversa C18 HPLC para separar Tz-PEG7-NH2 del precursor Boc-protegido. Monitorear ambos Tz-PEG7- NHBoc y Tz-PEG7NH -2 en una longitud de onda de 525 nm.
    Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etcetera), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0.1% TFA) a 95: 5 MeCN/H2O más de 30 min, se utilizan un caudal de 1 mL/min y una columna de18analítica 4,6 x 250 mm C , los tiempos de retención de Tz-PEG7- NHBoc y Tz-PEG7-NH2 son alrededor de 18 minutos y 13 minutos, respectivamente.
  7. Congelar el eluyente recogido de HPLC utilizando nitrógeno líquido y envuelva el tubo de la colección congelado ahora en papel de aluminio. Lugar el tubo de la colección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un sólido de color rosa brillante.
  8. Reconstituir el producto de paso 3.7, Tz-PEG7-NH2, con 150 μL de DMSO y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
  9. Medir la concentración de PEG de Tz7-NH2 usando un espectrofotómetro UV-Vis, control de la longitud de onda de 525 nm. El coeficiente de extinción molar para Tz-PEG7-NH2 (ε525) es 535 M-1cm-1.

4. la síntesis de Tz-PEG7- DOTA

  1. Disolver Tz-PEG7-NH2 (4.5 mg, 6,9 μmol) de 0.15 mL de DMSO (o simplemente proceder con la solución creada en paso 3.8).
  2. Añadir 22 equivalentes molares de té (μL 21, 0,15 mmol) a la solución que contiene la tetrazina del paso 4.1.
  3. Añadir 10 mg (14.2 μmol) de p- SCN-Bn-DOTA como un sólido y agitar la solución durante unos 2 minutos o hasta que se haya disuelto completamente el material.
  4. Permite la reacción a incubar por 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  5. Después de 30 min, diluir la reacción 1:1 en H2O y purificar el producto usando fase inversa C18 HPLC para quitar p- SCN-Bn-DOTA. El p- SCN-Bn-DOTA puede ser monitoreado en una longitud de onda de 254 nm, mientras que la Tz-PEG7- DOTA se controla mejor a una longitud de onda de 525 nm.
    Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etcetera), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0.1% TFA) a 95: 5 MeCN/H se utilizan2O más de 30 min y una columna de18analítica 4.6 x 250 mm C, Tz-PEG7- DOTA y p-SCN-Bn-DOTA tienen tiempos de retención de alrededor de 15,6 min y min 16,1, respectivamente.
  6. Congelar el eluyente recogido de HPLC utilizando nitrógeno líquido y envuelva el tubo de la colección congelado ahora en papel de aluminio. Lugar el tubo de la colección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un polvo de color rosa brillante.
  7. Reconstituir el producto en 0,15 mL de DMSO y medir la concentración usando un espectrofotómetro UV-Vis, control de la longitud de onda de 525 nm. El coeficiente de extinción molar para Tz-PEG7- DOTA (ε525) es 535 M-1cm-1.
  8. Analizar el compuesto final por resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) para verificar esa síntesis era acertado. Vea la tabla 1 para el determinado experimentalmente cambios químicas y pesos moleculares de todos los compuestos que se discuten en este trabajo.
  9. Tienda la solución purificada de - DOTA de7Tz-PEG en la oscuridad a-80 ° C.
    Nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El precursor de - DOTA completo de Tz-PEG7es estable durante al menos 1 año en estas condiciones.

5. 177Lu Radiolabeling de Tz-PEG7- DOTA

Atención: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, o realizar cualquier otro trabajo con la radiactividad, los investigadores deben consultar con el Departamento de seguridad de radiación de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.

Nota: Cuando se trabaja con pequeñas cantidades de radiometals se recomienda que todos los búferes está libre de metales traza para evitar interferencia en el enlace de la página de coordinación.

  1. En un tubo de centrífuga de 1,7 mL, añadir 200 μL de tampón de acetato de amonio de 0,25 M ajustado con alícuotas de 1 M de HCl a pH 5.5.
    Nota: Si utiliza menos de 370 MBq de actividad para el etiquetado, debe reducirse el volumen de tampón usado a 100 μl.
  2. Añadir la cantidad deseada de [177Lu] LuCl3 a la solución tampón. La cantidad añadida será dependiente en el número de sujetos en el experimento y la dosis radiactiva se administra. Se recomienda agregar 1-2 dosis adicionales vale la pena de la radiactividad como medida de precaución para compensar la posible pérdida de radiactividad durante los pasos de purificación.
  3. Añadir Tz-PEG7- DOTA en DMSO a la mezcla radiactiva paso 5.2. La cantidad de Tz-PEG7- DOTA es dependiente en el número de sujetos de prueba. Más detalles sobre este tema pueden encontrarse en el paso 6.2.2.2.
  4. Deje que la solución de incubar a 37 ° C durante 20 minutos.
  5. Verificar que el radiolabeling es completa con cromatografía de capa fina instantánea de radio (radio-objetivo) de 50 mM EDTA, pH 5.5 como fase móvil. La etiqueta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz se mantendrá en la línea de base: Rf = 0, mientras gratis [177Lu] Lu3 + será coordinada por el EDTA y viajará con el frente del disolvente, Rf = 1.0 (figura 3B).
  6. Si no se logra el etiquetado cuantitativo, agregar adicional ligando para coordinar el radiometal gratis. Alternativamente, purificar la etiqueta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz con un cartucho de18 C. Siga las instrucciones del fabricante para su uso. Un procedimiento de la muestra se expone a continuación.
    1. Cebe el cartucho lentamente pasando por 5 mL de etanol a través del cartucho con una jeringa grande. Luego, pasar 5 mL de acetonitrilo y 5 mL de desionizada (DI) H2O.
    2. Elaborar la solución así de paso 5.3 en una jeringa más pequeña e inyectar lentamente en el cartucho de18 C. Luego, lavar el cartucho con 10 mL de DI H2O para quitar cualquier desatado [177Lu] LuCl3.
    3. Eluir con 500 μl de etanol. Quite cualquier etanol del producto final pasando por encima el vaso con un bajo caudal de nitrógeno seco o argón de 10-15 minutos. Posteriormente, Resuspender el radioligando en solución salina en un volumen determinado en el paso 6.2.2.2.

6. estudios in vivo

PRECAUCIÓN: Al igual que en la sección 5, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, los investigadores deben consultar con el Departamento de seguridad de radiación de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.

  1. Preparación de animales
    1. En ratones desnudos athymic femeninos, implante subcutáneo 5 x 106 SW1222 células de cáncer colorrectal en 150 μL de una mezcla 1:1 de los medios de comunicación de la célula y la matriz (e.g., Matrigel) y permiten crecer en un xenoinjerto de3 100-150 m m (14-18 días después de la inoculación).
    2. Clasificación de los animales para un experimento de biodistribución
      1. Una vez que los tumores son de tamaño suficiente según lo determinado por la medición del calibre, ordenar los animales para cada cohorte tiene aproximadamente el mismo volumen de tumor promedio. Los animales pueden ser distinguidos en cada jaula por las marcas en la cola con tinta indeleble (dos bandas, una banda, etc.).
    3. Clasificación de los animales para un estudio longitudinal de la terapia
      1. Una vez que los tumores son de tamaño suficiente según lo determinado por la medición del calibre, adjuntar etiquetas de oreja a cada uno de los animales para asegurar el correcto seguimiento durante todo el experimento.
        Nota: Marcas auriculares numéricos pueden caerse en el transcurso del experimento. Como resultado, se recomienda para acompañar estas etiquetas físicas con las muescas de la oreja de manera sistemática (es decir., derecha, izquierda, bilateral, derecho x 2, x 2 de la izquierda).
      2. Clasificar los animales por lo que el volumen promedio del tumor en cada cohorte es aproximadamente igual. El siguiente método para la clasificación de animales puede realizarse con un programa de hoja de cálculo.
        1. Lista de los números de identificación de animales, diseño de ranuras de oído y volumen del tumor en tres columnas separadas.
        2. Ordenar los datos de menor a mayor volumen de tumor.
        3. En la cuarta, asignar cada animal un número de jaula y ciclo a través de las jaulas en forma de serpiente. Por ejemplo, si hay 5 jaulas, esta columna sería lleno "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." hasta que todos los animales se les asigna una jaula.
        4. Una vez que se asignan las jaulas, ordenar los datos por número de jaula. Si se utilizan muescas de oreja, asegúrese de que cada animal en una jaula dada tiene un patrón de ranura única oreja. Si hay duplicados (dos o más del mismo patrón) en una determinada jaula, intercambio un ratón con una de la otra jaula con el patrón que falta hasta cada jaula tiene animales con patrones de muesca único oído.
  2. Formulaciones y las inyecciones
    Nota: La secuencia de inyección para el estudio de biodistribución y terapia procede como sigue: huA33-TCO se inyecta en primer lugar, seguido por [177Lu] Lu-DOTA-PEG7Tz - después de un intervalo determinado.
    1. Immunoconjugate
      1. Diluir una alícuota de la solución de huA33-TCO de 1,9 de paso a una concentración de 0,8 mg/mL en solución salina estéril 0,9%.
      2. Extraer la dosis de 150 μL (100 μg) de solución de huA33-TCO en jeringuillas pretratadas con 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS y almacenar las jeringas en el hielo.
        Nota: BSA el tratamiento reduce el atascamiento no específico de los anticuerpos a las paredes de la jeringa.
      3. Caliente los animales bajo una lámpara de calor durante 3 minutos dilatar la vena de la cola.
      4. Inyectar la solución de huA33-TCO en la vena de la cola del ratón xenoinjerto-cojinete. Permitir 24 h (o un intervalo de tiempo determinado diferentes) para que el huA33-TCO se acumule en el tumor del ratón.
    2. Así
      1. Radiolabel Tz-PEG7- DOTA como se indica en la sección 5.
      2. Llamar la dosis en 150 μL de 0.9% estéril salina que contiene 1,1 equivalentes molares de Tz-PEG7administrado - DOTA en relación con la cantidad de huA33-TCO. Por ejemplo, si 100 μg (0.67 nmol) de huA33-TCO fue inyectada en el animal y la mezcla de reacción [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz fue hecha con una actividad específica de 12,4 GBq/μmol, luego dosis se dibujarán con 9.14 MBq de actividad cada. Esto corresponde a 0,74 nmol de Tz (1.1 ecuación molar relativa a huA33-TCO).
      3. Caliente los animales bajo una lámpara de calor de 3 min dilatar la vena de la cola.
      4. Inyectar la dosis de radioligando en la vena de la cola del ratón xenoinjerto-cojinete. La cantidad de actividad a inyectar es determinada por el investigador. Datos publicados han demostrado efectos terapéuticos dosis dependiente en el tamaño del tumor dentro de un rango de 7.4-55.5 MBq.
  3. Biodistribución
    1. En el momento deseado después de la administración de la así, eutanasia cada cohorte de ratones utilizando un 2% O2 / 6% CO2 gas mezcla.
      Nota: Siga los requisitos institucionales sobre métodos de eutanasia física secundaria (por ejemplo, la dislocación cervical).
    2. Para cada animal, quiten todos los órganos de interés, en un baño de agua para quitar cualquier exceso de sangre y secarlos en una toalla de papel al aire libre por 5 minutos muestra órgano lista sugerida orden: sangre, tumor, corazón, pulmones, hígado, bazo, estómago, intestino delgado , intestino, riñones, músculo, hueso, piel, cola.
    3. Una vez suficientemente seco, colocar los órganos en tubos de cultivo desechables previamente pesado. Pesar los tubos llenos de ahora una vez más para obtener la masa de cada órgano o tejido.
    4. Medir la actividad en cada uno de los tubos mediante un contador gamma. Calibrar la actividad medida en el contador gamma para el detector utilizado para medir la dosis dibujada. Cuenta estándares radioactivos de 177Lu en cada instrumento y determinar un factor de calibración para la interconversión entre la actividad y las cuentas por minuto (cpm).
    5. Parcela los datos de biodistribución como un gráfico de barras (ver figura 5) con la media normalizada captación de cada órgano junto con un bar que denotan una desviación estándar. Diferencias estadísticas en la absorción entre los grupos de la muestra pueden evaluarse por una prueba de t no pareada, en la que se obtiene significación cuando p < 0.05.
  4. Seguimiento farmacoterapéutico
    1. Utilizando pinzas, medir el lado más largo del tumor oblongo (longitud) así como la anchura, que es perpendicular a la longitud. Calcular volumen utilizando la fórmula para el volumen de un elipsoide: πL· (4/3) W· H, lo que simplifica a ½L· W2, suponiendo que la altura es aproximadamente igual a la anchura.
      Nota: También es posible utilizar un tumor mano medidor si uno está disponible (véase Tabla de materiales).
    2. Pesar cada ratón en un equilibrio para seguir el aumento de peso o pérdida de peso con el tiempo.
    3. Lo importante es controlar el aspecto físico de cada animal para detectar signos de peligro, tales como encorvada hacia atrás o rotos vasos sanguíneos cutáneos (que puede indicar hematotoxicidad).
      Nota: Las medidas del Tumor deben ser recogidas cada 1-2 días durante el curso del estudio longitudinal de la terapia.
    4. Datos de la terapia longitudinal estudian volúmenes tumorales como promedio en el tiempo y normalizan a partir de volumen del tumor si se desea. Diferencias estadísticas en la absorción en el mismo día entre los grupos de la muestra pueden evaluarse por una prueba de t no pareada, en la que se obtiene significación cuando P < 0.05. Análisis estadísticos más extensos pueden y deben llevarse a cabo según las recomendaciones de un bioestadístico entrenado.

Resultados

La conjugación de TCO a huA33 se basa en el acoplamiento entre el amina reactiva TCO-NHS y los residuos de lisina en la superficie de la inmunoglobulina. Este método es altamente robusta y reproducible y fiable produce un grado de-etiquetas de 2-4 TCO/mAb. En este caso, espectrometría de masas MALDI-ToF se empleó para confirmar un grado de etiquetado de aproximadamente 4.0 TCO/mAb; se obtuvo un valor similar utilizando un tetrazina fluoróforo modificado como un reportero

Discusión

Uno de los puntos fuertes de este enfoque en vivo pretargeting — especialmente en lo referente a estrategias basadas en anticuerpos tienen y radiactiva haptenos, es su modularidad: transporte- cyclooctene fracciones pueden ser añadidos a cualquier anticuerpo, y tetrazina radioligands puede ser radiactiva con una extraordinaria variedad de radionucleidos sin deteriorar su capacidad de reaccionar con sus socios de clic. Sin embargo la adaptación de este enfoque a otros sistema de antígeno anticuerpo ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Dr. Jacob Houghton para conversaciones útiles. Los autores quisieran agradecer a los NIH para su financiación generosa (R00CA178205 y U01CA221046).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)Sigma-Aldrich764523Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)Fisher ScientificA998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)Sigma-Aldrich70023Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)Fisher ScientificD143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrousFisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter UnitFisher ScientificUFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting ColumnsFisher Scientific45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrousFisher ScientificAC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)Fisher ScientificAC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)Fisher ScientificA116-50
Tumor measuring devicePeira TM900Peira TM900

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