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Résumé

Ce protocole décrit la synthèse et la caractérisation d’un trans- cyclooctène (TCO)-modification des anticorps et un radioligand de Lu marqué tetrazine (Tz) 177pour pretargeted radio-immunothérapie (Amel). En outre, il décrit en détail l’utilisation de ces deux concepts pour in vivo de biodistribution et études de thérapie longitudinale dans un modèle murin de cancer colorectal.

Résumé

Alors que radio-immunothérapie (RIT) est une approche prometteuse pour le traitement du cancer, la demi-vie longue pharmacocinétique des anticorps radiomarqués peut entraîner des doses élevées de rayonnement aux tissus sains. Peut-être sans surprise, plusieurs stratégies différentes ont été développés pour contourner cette limitation troublante. L’un des plus prometteurs de ces approches est pretargeted radio-immunothérapie (Amel). TRIOUX repose sur découplage le radionucléide de l’immunoglobuline, y injecter séparément et ensuite leur permettant de combiner in vivo dans le tissu cible. Cette approche exploite les propriétés exceptionnelles de ciblage tumoral des anticorps tout en longeant leurs inconvénients pharmacocinétiques, ainsi réduisant les doses de rayonnement aux tissus non ciblés et facilitant l’utilisation des radionucléides ayant une demi-vie qui sont considéré comme trop court pour utilisation en radioimmunoconjugates traditionnel. Au cours des cinq dernières années, notre laboratoire et autres ont mis au point une approche en vivo pretargeting basée sur la réaction de Diels-Alder (DADEI) inverse la demande électronique entre trans- cyclooctène (TCO) et tetrazine (Tz). Cette stratégie a été appliquée avec succès à pretargeted par émission de positrons (TEP) et d’émission monophotonique une tomodensitométrie (SPECT) d’imagerie avec une variété de systèmes d’anticorps-antigène. Dans une paire de publications récentes, nous avons démontré l’efficacité de base DADEI PRIT dans des modèles murins d’adénocarcinome ductal pancréatique et carcinome colorectal. Dans ce protocole, nous décrivons des protocoles pour TRIOUX utilisant un radioligand de Lu-DOTA-étiqueté tetrazine 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) et une variante modifiée de TCO du cancer colorectal ciblant les anticorps huA33 (huA33-TCO). Plus précisément, nous allons décrire la construction de huA33-TCO, la synthèse radiolabeling de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz et la performance in vivo la biodistribution des études longitudinales de la thérapie dans des modèles murins de carcinome colorectal.

Introduction

Radio-immunothérapie (RIT) — l’utilisation d’anticorps pour la prestation de radionucléides thérapeutiques aux tumeurs — est depuis longtemps une approche alléchante au traitement du cancer1,2. En effet, cette promesse a été soulignée par l’United States Food and Drug Administration approbation de deux radioimmunoconjugates pour le traitement du lymphome Non hodgkinien : 90Y-ibritumomab tiuxétan et 131tositumomab-j’ai3 , 4. pourtant, dès ses débuts, les perspectives cliniques de RIT ont été entravés par une complication critique : débits de dose de rayonnement élevée aux tissus sains5,6. En général, radioimmunoconjugates de RIT sont étiquetés avec des radionucléides à vie longue (p. ex., 131j’ai [t½ = 8,0 jours] et 90Y [t½ = 2,7 jours]) ayant une demi-vie physique qui conjugue bien avec les demi-vie longue pharmacocinétiques des immunoglobulines. C’est essentiel, car il garantit que la radioactivité suffisante reste une fois que l’anticorps a atteint sa biodistribution optimale après plusieurs jours de circulation. Toutefois, cette combinaison des temps de séjour prolongé dans le sang et la demi-vie longue physique entraîne inévitablement l’irradiation des tissus sains, ce qui réduit les rapports thérapeutiques et limitant l’efficacité de la thérapie7. Plusieurs stratégies ont été explorées pour contourner ce problème, y compris l’utilisation de fragments d’anticorps tronqué comme Fab, Fab', f2, minibodies et nanocorps8,9,10. Un des plus prometteurs et fascinant, mais indéniablement complexe des approches alternatives est en vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting est une approche d’imagerie nucléaire et thérapie qui cherche à exploiter l’affinité exquise et la sélectivité des anticorps en longeant leurs inconvénients pharmacocinétiques11,12,13. À cette fin, l’anticorps radiomarqués utilisé en radio-immunothérapie traditionnel est déconstruit en deux composantes : une petite molécule radioligands et un immunoconjugué pouvant lier aussi bien un antigène tumoral et au radioligand susmentionné. L’immunoconjugué est injecté tout d’abord et donné une « longueur d’avance », souvent de plusieurs jours, au cours de laquelle il s’accumule dans le tissu cible et efface dans le sang. Par la suite, la petite molécule radioligand est administré et combine avec l’immunoconjugué à la tumeur ou efface rapidement de l’organisme. En substance, en vivo pretargeting invoque effectuant la radiochimie dans le corps lui-même. En réduisant la circulation de la radioactivité, cette approche a simultanément réduit les doses de rayonnement aux tissus sains et facilite l’utilisation des radionucléides (p. ex., 68Ga, t½ = 68 min211; Comme, t½ = 7,2 h) ayant une demi-vie qui est généralement considérées comme incompatible avec les vecteurs de base d’anticorps.

À partir de la fin des années 1980, une poignée de différentes approches in vivo pretargeting ont été développées, y compris des stratégies fondées sur des anticorps bispécifiques, l’interaction streptavidine / biotine et l’hybridation des complémentaires oligonucléotides14,15,16,17,18. Encore chacun a été freiné à des degrés divers par des complications, le plus célèbre est l’immunogénicité puissante des anticorps streptavidine-modified19,20. Au cours des cinq dernières années, notre groupe et autres ont développé une approche en vivo pretargeting basé sur le rapide et bioorthogonal électron inversée demande Diels-Alder ligature entre trans- cyclooctène (TCO) et tetrazine (Tz) 2122,de,23,24. Les plus réussis de ces stratégies ont employé un anticorps modifiés TCO et un radioligand Tz-roulement, comme le TCO est généralement plus stable en vivo que ses Tz partenaire (Figure 1)25,26. Comme dans d’autres méthodologies pretargeting, l’immunoconjugué mAb-TCO est administré d’abord et le temps pour effacer de la circulation et s’accumuler dans les tissus tumoraux. Par la suite, la petite molécule Tz radioligand est injecté, après quoi il clique avec l’immunoconjugué dans le tissu cible ou efface rapidement de l’organisme. Cette in vivo pretargeting stratégie a prouvé très efficace pour PET et SPECT imaging avec plusieurs systèmes différents anticorps/antigène, constamment produisant des images avec un contraste élevé et permettant l’utilisation de courte durées radionucléides tels que 18 F (t½ = 109 min) et 64Cu (t1/2 = h 12,7)21,22,24. Plus récemment, l’efficacité de click-basé pretargeted radio-immunothérapie (Amel) a été démontrée dans des modèles murins d’adénocarcinome ductal pancréatique (ACPE) et carcinome colorectal27,28. À cette fin, le radionucléide thérapeutique 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 jours) a été employé en conjonction avec deux types d’anticorps : 5 b 1, qui cible l’antigène glucidique 19,9 (CA19.9) ubiquitaire exprimée en ACPE , et huA33, qui s’adresse l’A33, une glycoprotéine transmembranaire exprimée en > 95 % des cancers colorectaux. Dans les deux cas, cette approche à 177Lu-Justine ont donné des concentrations d’activité élevé dans le tissu tumoral, créé un effet thérapeutique de la dose-dépendante et réduit simultanément les concentrations d’activité dans les tissus sains par rapport aux traditionnels directement marqués radioimmunoconjugates.

Dans cet article, nous décrivons les protocoles pour TRIOUX utilisant un radioligand de Lu-DOTA-étiqueté tetrazine 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) et une variante modifiée de TCO de l’anticorps huA33 (huA33-TCO). Plus précisément, les auteurs décrivent la construction de huA33-TCO (Figure 2), la synthèse radiolabeling de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figure 3 et Figure 4) et la performance de in vivo la biodistribution et études longitudinales de la thérapie dans des modèles murins du cancer colorectal. En outre, dans les résultats représentatifs et de la discussion, nous présentons un ensemble de données d’échantillons, stratégies possibles d’adresse pour l’optimisation de cette approche et considérer cette stratégie dans le contexte plus large d’en vivo pretargeting et PRIT. Enfin, il est important de noter que tandis que nous avons choisi de mettre l’accent sur pretargeting en utilisant huA33-TCO et [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz dans le présent protocole, cette stratégie est très modulaire et peut être adapté pour répondre à un large éventail d’anticorps et radionucléides.

Protocole

Tous in vivo des expérimentations animales décrites dans cet ouvrage ont été réalisées selon les protocoles approuvés et exécutées sous les directives éthiques du Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center et Hunter College Soins institutionnels des animaux et utilisation des comités (IACUC).

1. la préparation du huA33-TCO

NOTE : La synthèse du huA33-TCO a été précédemment rapporté29. Toutefois, pour la facilité du lecteur, il est reproduit ici avec les ajustements pour des conditions optimales.

  1. Dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL, préparer une solution de 125 μL de (E) - cyclooct - 4-ényle 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) à sec de diméthylformamide (DMF) à une concentration de 40 mg/mL (0,15 M). Cette solution peut être aliquoté et congelé à-80 ° C pour une utilisation dans des expériences futures.
  2. Dans un tube de microcentrifuge distinct 1,7 mL, préparer une solution de 5 mg/mL d’huA33 dans 1 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 2,7 mM chlorure de potassium, chlorure de sodium de 137 mM et phosphate de potassium 11,9 mM, pH 7,4).
  3. À l’aide de petites parties aliquotes (< 5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajuster le pH de la solution d’anticorps de 1,2 Step à 8,8-9.0. Utilisez papier pH ou un pH-mètre avec une microélectrode à surveiller le pH et la diligence que le pH ne dépasse pas 9.0.
  4. À la solution d’anticorps décrite au point 1.3 de l’étape, ajouter lentement un volume correspondant à 40 équivalents molaires de TCO-NHS par rapport à la quantité d’anticorps. Par exemple, si 5 mg (30 nmol) de huA33 est la solution, ajouter 9,0 μL (1,20 μmol) de la solution de 40 mg/mL (0,15 M) du TCO-NHS.
    NOTE : TCO-NHS est hydrophobe. Lorsque vous l’ajoutez à la solution d’anticorps, ajouter lentement et en agitant le mélange pour éviter la précipitation. Ne pas dépasser 10 % DMF en volume de la solution finale de réaction.
  5. Permettre la réaction d’incubation à 25 ° C sur un thermomixer pendant 1 h avec agitation légère (500 tr/min).
  6. Après 1 h, purifier l’immunoconjugué huA33-TCO en utilisant une colonne de dessalement exclusion préemballages jetables taille.
    1. Equilibrer la colonne d’exclusion de taille tel que décrit par le fournisseur à supprimer tous les préservatifs présents dans la colonne pendant le stockage. Une procédure typique consiste à laver la colonne 5 x avec un volume de PBS qui correspond au volume de la colonne : 5 x 2,5 mL de PBS.
    2. Ajouter le mélange réactionnel à la colonne d’exclusion de taille notant le volume du mélange réactionnel.
    3. Une fois le mélange réactionnel est entré dans la colonne, ajouter une quantité appropriée de PBS pour porter le volume total de solution ajoutée à la colonne à 2,5 mL. Par exemple, si la réaction de conjugaison conduit à un volume total de 1,3 mL, ajouter 1,2 mL de PBS supplémentaires à la colonne.
    4. Recueillir le produit à l’aide de 2 mL de PBS comme l’éluant.
      Remarque : Cette étape permet d’obtenir la construction finale huA33-TCO dans 2 mL de PBS, pH 7,4.
  7. Mesurer la concentration de l’huA33-TCO à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, suivi de la longueur d’onde nm 280. Le coefficient d’extinction molaire pour la plupart IgG (ε280) est de 210 000 M-1cm-1.
  8. Si vous souhaitez une solution avec une concentration plus élevée d’immunoconjugué, concentrer la solution huA33-TCO en utilisant une unité de filtration centrifuge avec un seuil de 50 000 poids moléculaire suivant instructions du fabricant.
    Remarque : De nombreux anticorps ont été connus pour agréger ou précipiter lors de la concentration. Lorsque vous essayez cette procédure avec un nouvel anticorps, les chercheurs devraient s’en remettre à la littérature ou de leur propre expérience manutention l’anticorps en question.
  9. Stocker l’immunoconjugué huA33-TCO terminé à 4 ° C dans l’obscurité s’il est nécessaire immédiatement. Si elle doit être utilisée plus de 4 jours dans le futur, stockez-le à-80 ° C dans l’obscurité.
    NOTE : Ceci est un point d’arrêt acceptable dans la procédure. L’immunoconjugué huA33-TCO dûment rempli doit être stable pour le stockage d’au moins 6 mois à-80 ° C dans l’obscurité.

2. la synthèse de Tz-PEG7- NHBoc

  1. Dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL, dissoudre 5 mg de tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS ; 12,6 μmol) à 0,15 mL d’anhydre diméthyl sulfoxyde (DMSO).
  2. Dans un tube de microcentrifuge distinct 1,7 mL, dissoudre 8 mg de Boc protégé amino PEG polymère, glycol de O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) à 0,15 mL de DMSO anhydre.
  3. À la solution de Tz-NHS, ajouter 3 μL (21,3 μmol, 1,7 équivalents molaires) de triéthylamine (TEA) et bien mélanger.
  4. Ajoutez la solution de tetrazine rose à la solution NHBoc-PEG7-NH2 du point 2.2 et incuber le mélange réactionnel pendant 30 min à température ambiante (RT) avec agitation douce.
  5. Après 30 minutes, diluer la réaction 1:1 H2O et purifier la réaction en phase inverse C18 haute performance par chromatographie liquide (HPLC) à séparer tout Tz-NHS n’a pas réagi de la Tz-PEG7- NHBoc. Utiliser des solvants sans acide pour empêcher la suppression prématurée de la Boc groupe protecteur. Surveiller les deux Tz-PEG7- NHBoc et Tz-NHS à une longueur d’onde de 525 nm.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (les deux sans aucun additif) 95 : 5 MeCN/H2O pendant 30 min, un débit de 1 mL/min et une colonne de18analytique 4,6 mm x 250 mm C sont utilisées , les temps de rétention de Tz-NHS et Tz-PEG7- NHBoc sont autour de 16 min à 18 min, respectivement.
  6. Geler l’éluant HPLC recueillie à l’aide d’azote liquide et enroulez le tube de prélèvement gelé en papier d’aluminium. Place le tube de prélèvement congelé sur un lyophilisateur durant la nuit pour enlever la phase mobile CLHP. Le produit sera un solide rose brillant caractéristique.
    Remarque : Si l’azote liquide n’est pas disponible, geler l’éluant HPLC recueillie dans la glace sèche ou pendant la nuit dans un congélateur à-80 ° C.

3. la synthèse de Tz-PEG7-NH2

  1. Le produit de l’étape 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, ajouter 1,5 mL de dichlorométhane (DCM) et transférer cette solution dans un petit ballon à fond rond.
  2. Ajouter 0,25 mL d’acide trifluoroacétique (TFA) goutte à goutte la solution rose d’étape 3.1.
  3. Permettre la réaction à incuber 30 min à ta par une légère agitation.
  4. Après 30 min, faire évaporer le solvant par évaporateur rotatif. Ne pas dépasser une température de bain de l’eau 37 ° c.
  5. Reconstituer le produit visqueux rose dans 0,5 mL d’eau.
  6. Purifier le produit à l’aide de phase inverse C18 HPLC séparer Tz-PEG7-NH2 le précurseur Boc-protégé. Surveiller les deux Tz-PEG7- NHBoc et Tz-PEG7-NH2 à une longueur d’onde de 525 nm.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) 95 : 5 MeCN/H2O pendant 30 min, un débit de 1 mL/min et une colonne de18analytique 4,6 mm x 250 mm C sont utilisées , les temps de rétention de Tz-PEG7- NHBoc et Tz-PEG7-NH2 sont environ 18 min et 13 min, respectivement.
  7. Geler l’éluant HPLC recueillie à l’aide d’azote liquide et enroulez le tube de prélèvement gelé en papier d’aluminium. Place le tube de prélèvement congelé sur un lyophilisateur durant la nuit pour enlever la phase mobile CLHP. Le produit sera un solide rose vif.
  8. Reconstituer le produit de l’étape 3.7, Tz-PEG7-NH2, avec 150 μl de DMSO et transférez dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL.
  9. Mesurer la concentration de Tz-PEG7-NH2 à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, suivi de la longueur d’onde nm 525. Le coefficient d’extinction molaire pour Tz-PEG7-NH2 (ε525) est de 535 M-1cm-1.

4. la synthèse de Tz-PEG7- DOTA

  1. Dissoudre le Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6,9 μmol) à 0,15 mL de DMSO (ou simplement aller de l’avant avec la solution créée dans étape 3,8).
  2. Ajouter 22 équivalents molaires de thé (21 μL, 0,15 mmol) de la solution contenant tetrazine d’étape 4.1.
  3. Ajouter 10 mg (14,2 μmol) de p- SCN-Bn-DOTA comme un solide et un vortex la solution pendant environ 2 minutes ou jusqu'à ce que le matériel est entièrement dissous.
  4. Permettre la réaction à incuber 30 min à ta par une légère agitation.
  5. Après 30 min, diluer la réaction 1:1 H2O et purifier le produit à l’aide de phase inverse C18 HPLC pour supprimer n’ayant pas réagi p- SCN-Bn-DOTA. Le p- SCN-Bn-DOTA peut être surveillé à une longueur d’onde de 254 nm, tandis que le Tz-PEG7- DOTA est mieux surveillée à une longueur d’onde de 525 nm.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) 95 : 5 MeCN/H2O pendant 30 min et une colonne de18analytique 4,6 x 250 mm C sont utilisées, Tz-PEG7- DOTA et p-SCN-Bn-DOTA ont des temps de rétention des autour de 15,6 min et 16,1 min, respectivement.
  6. Geler l’éluant HPLC recueillie à l’aide d’azote liquide et enroulez le tube de prélèvement gelé en papier d’aluminium. Place le tube de prélèvement congelé sur un lyophilisateur durant la nuit pour enlever la phase mobile CLHP. Le produit sera une poudre rose vif.
  7. Reconstituer le produit à 0,15 mL de DMSO et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, suivi de la longueur d’onde nm 525. Le coefficient d’extinction molaire pour Tz-PEG7- DOTA (ε525) est de 535 M-1cm-1.
  8. Analyser le composé final par résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse à haute résolution (SGRH) pour vérifier que la synthèse a été un succès. Voir le tableau 1 pour les déplacements chimiques déterminées expérimentalement et poids moléculaires de tous les composés mentionnés dans cet ouvrage.
  9. Stocker la solution DOTA - Tz-PEG7purifiée dans l’obscurité à-80 ° C.
    NOTE : Ceci est un point d’arrêt acceptable dans la procédure. Le rempli7Tz-PEG - DOTA précurseur est stable pendant au moins 1 an dans ces conditions.

5. 177Lu radiomarquage de Tz-PEG7- DOTA

Attention : Cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d’effectuer ces étapes — ou d’effectuer toute autre tâche à la radioactivité, les chercheurs devraient consulter Radiation Safety Department de leur établissement d’origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants.

Remarque : Lorsque vous travaillez avec de petites quantités de radiometals, il est recommandé que tous les tampons sont exempts de métaux-traces pour éviter toute interférence dans la liaison de site de coordination.

  1. Dans un tube à centrifuger 1,7 mL, ajouter 200 μl de tampon d’acétate d’ammonium 0,25 M ajusté avec parties aliquotes de 1 M HCl, Ph 5,5.
    Remarque : Si vous utilisez moins de 370 MBq d’activité pour l’étiquetage, le volume de mémoire tampon utilisée devrait être réduit à 100 µL.
  2. Ajoutez la quantité désirée de [177Lu] LuCl3 à la solution tampon. Le montant ajouté sera fonction du nombre de sujets dans l’expérience et les doses radioactives administrés. Il est recommandé d’ajouter 1 à 2 doses supplémentaires d’une valeur de la radioactivité par mesure de précaution pour compenser la perte potentielle de radioactivité pendant les étapes de purification.
  3. Ajouter Tz-PEG7- DOTA dans le DMSO au mélange radioactif au point 5.2. Le montant de Tz-PEG7- DOTA est fonction du nombre de sujets mis à l’essai. Plus de détails sur ce sujet se trouvent à l’étape 6.2.2.2.
  4. Laisser la solution d’incubation à 37 ° C pendant 20 min.
  5. Vérifiez que le radiomarquage est complet à l’aide de chromatographie en phase instantanée fine couche de radio (radio-technologique) avec 50 mM EDTA, pH 5,5 comme phase mobile. L’étiquette [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz restera à la ligne de base — Rf = 0 — bien que libre [177Lu] Lu3 + sera coordonné par l’EDTA et voyagera avec le front de solvant, Rf = 1,0 (Figure 3 b).
  6. Si l’étiquetage quantitatif n’est pas atteint, ajouter ligand supplémentaire afin de coordonner la radiometal libre. Vous pouvez également purifier l’étiquette [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz en utilisant une cartouche de18 C. Suivez les instructions du fabricant pour l’utilisation. Un exemple de procédure est donné ci-dessous.
    1. Amorcer la cartouche en passant lentement par 5 mL d’éthanol à travers la cartouche avec une grande seringue. Ensuite, passer par 5 mL d’acétonitrile, puis 5 mL de désionisée (DI) H2O.
    2. Rédiger la solution radioligands de 5,3 étape dans une petite seringue et injecter lentement sur la cartouche de18 C. Ensuite, laver la cartouche avec 10 mL de DI H2O pour supprimer les éléments non consolidé [177Lu] LuCl3.
    3. Éluer avec 500 µL d’éthanol. Retirer tout l’éthanol du produit final en passant sur le navire avec un faible débit d’azote sec ou de l’argon pendant 10-15 min. Par la suite, remettre en suspension le radioligand dans une solution saline dans un volume déterminé à l’étape 6.2.2.2.

6. études in vivo

Attention : Comme dans l’article 5, cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d’effectuer ces étapes, les chercheurs devraient consulter Radiation Safety Department de leur établissement d’origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants.

  1. Préparation des animaux
    1. Chez la souris nude athymique femelle, par voie sous-cutanée de l’implant suspendues à 150 μL d’un mélange de 1:1 de médias de la cellule et la matrice de cellules du cancer colorectal de6 SW1222 5 x 10 (e.g., Matrigel) et permettre à ceux-ci d’évoluer vers une xénogreffe de3 100 à 150 mm (14-18 jours après l’inoculation).
    2. Tri des animaux pour une expérience de biodistribution
      1. Une fois que les tumeurs sont de taille suffisante, telle que déterminée par la mesure de calibre, trier les animaux pour s’assurer que chaque cohorte a environ le même volume de tumeur moyenne. Les animaux peuvent être distinguées dans chaque cage par des marques sur la queue à l’encre indélébile (une seule bande, deux bandes, etc.).
    3. Tri des animaux pour une étude longitudinale de la thérapie
      1. Une fois que les tumeurs sont de taille suffisante, telle que déterminée par la mesure de calibre, fixer des marques auriculaires pour chacun des animaux afin d’assurer un suivi correct tout au long de l’expérience.
        NOTE : Les marques auriculaires numérique peuvent tomber tout au long de l’expérience. En conséquence, il est recommandé d’accompagner ces balises physiques avec les encoches de l’oreille de manière systématique (i.e., droite, gauche, bilatéraux, droit x 2, gauche x 2).
      2. Trier les animaux afin que le volume tumoral moyen dans chaque cohorte est à peu près égal. La méthode suivante pour le tri des animaux peut être effectuée à l’aide d’un tableur.
        1. Liste des numéros d’identification des animaux, modèle encoche oreille et volume de la tumeur en trois colonnes distinctes.
        2. Trier les données du plus petit au plus grand volume de la tumeur.
        3. Dans une quatrième colonne, affectez chaque animal un cycle dans les cages en forme de polochon et le nombre de cage. Par exemple, si il y a 5 cages, cette colonne est remplie « 5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5... » jusqu'à ce que tous les animaux sont assignés à une cage.
        4. Une fois que les cages sont assignés, trier les données par numéro de cage. Si les encoches de l’oreille sont utilisés, veiller à ce que chaque animal dans une cage donnée a un modèle d’encoche oreille unique. Si des doublons (deux ou plus du même modèle) dans une cage donnée, un souris swap avec celle d’une autre cage avec le modèle manquant jusqu'à ce que chaque cage a animaux présentant des motifs encoche oreille unique.
  2. Formulations et Injections
    Remarque : La séquence d’injection pour l’étude de biodistribution et la thérapie se déroule comme suit : huA33-TCO est injecté en premier lieu, suivi par [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz après un intervalle prédéterminé.
    1. Immunoconjugué
      1. Diluer une aliquote de la solution huA33-TCO de 1,9 étape à une concentration de 0,8 mg/mL dans une solution saline stérile de 0,9 %.
      2. Dessiner des doses de 150 µL (100 µg) de solution huA33-TCO en seringues prétraités avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS et stocker ces seringues sur la glace.
        Remarque : Le traitement de la BSA réduit la liaison non spécifique de l’anticorps aux parois de la seringue.
      3. Réchauffer les animaux sous une lampe de chaleur pendant 3 minutes afin de dilater la veine caudale.
      4. Injecter la solution huA33-TCO dans la veine caudale de la souris portant des xénogreffes. 24h (ou un intervalle de temps prédéterminé différentes) permettant le huA33-TCO à s’accumuler dans la tumeur de la souris.
    2. Radioligands
      1. Radiolabel Tz-PEG7- DOTA tel qu’indiqué dans la Section 5.
      2. Dessiner des doses dans 150 μl de 0,9 % stérile saline contenant 1,1 équivalents molaires de Tz-PEG7- DOTA par rapport à la quantité de huA33-TCO administré. Par exemple, si 100 μg (0,67 nmol) de huA33-TCO a été injecté dans l’animal et le mélange de réaction [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz a été effectué avec une activité spécifique de 12,4 GBq/μmol, puis doses seront dessinés contenant 9,14 MBq d’activité chaque. Cela correspond à 0,74 nmol de Tz (1,1 EQ molaire par rapport au huA33-TCO).
      3. Réchauffer les animaux sous une lampe de chaleur pendant 3 min à se dilater la veine caudale.
      4. Injecter la dose du radioligand dans la veine de la queue de la souris portant des xénogreffes. Le montant de l’activité à doser est déterminé par le chercheur. Données publiées ont montré des effets thérapeutiques dose-dépendante sur la taille de la tumeur dans une fourchette de 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribution
    1. Au point d’heure après l’administration du radioligand, euthanasier chaque cohorte de souris en utilisant un 2 % O2 / mélange de gaz de 6 % de CO2 .
      Remarque : Suivez les exigences institutionnelles concernant les méthodes d’euthanasie physique secondaire (p. ex., la dislocation cervicale).
    2. Pour chaque animal, retirer tous les organes d’intérêt, les laver dans un bain d’eau pour enlever tout excès sanguin et les faire sécher sur une serviette en papier en plein air pour orgue voir échantillon 5 min. dans l’ordre suggéré : sang, tumeur, coeur, poumons, foie, rate, estomac, intestin grêle , gros intestin, reins, muscles, OS, peau, queue.
    3. Une fois suffisamment sec, placez les organes dans des tubes à culture jetables pré-pesés. Peser les tubes remplis maintenant une fois de plus pour obtenir la masse de chaque organe ou tissu.
    4. Mesurer l’activité dans chacun des tubes à l’aide d’un compteur gamma. Calibrer l’activité mesurée dans le compteur gamma au détecteur utilisé pour mesurer la dose dessinée. Compter les normes radioactives de 177Lu sur chaque instrument et déterminer un facteur d’étalonnage pour l’interconversion entre l’activité et les chefs d’accusation par minute (cpm).
    5. Tracer les données de biodistribution comme un graphique à barres (voir Figure 5) avec la moyenne normalisée de capture pour chaque organe affichée avec une barre qui dénote un écart. Des différences significatives dans l’absorption entre groupes d’échantillons peuvent être évaluées par un test t non apparié, dans lequel la signification est atteint lorsque p < 0,05.
  4. Surveillance de la thérapie
    1. À l’aide d’étriers, mesurer le côté le plus long de la tumeur oblongue (longueur) ainsi que la largeur, qui est perpendiculaire à la longueur. Calculer le volume à l’aide de la formule pour le volume d’un ellipsoïde : πL· (4/3) W· H, ce qui se simplifie en ½L· W2, en supposant que la hauteur est égale à la largeur.
      Remarque : Il est également possible d’utiliser une ordinateur de poche tumeur appareil de mesure si l'on est disponible (voir Table des matières).
    2. Peser chaque souris sur une balance pour effectuer le suivi de poids ou perte de poids au fil du temps.
    3. Ce qui est important, surveiller l’apparence physique de chaque animal pour des signes de détresse, comme penché en arrière ou de la rupture des vaisseaux sanguins cutanés (ce qui peut indiquer une hématotoxicité).
      NOTE : Les mesures tumorales doivent être recueillis tous les jours 1-2 au cours de l’étude longitudinale de la thérapie.
    4. Tracer les données longitudinales traitement à l’étudient comme moyenne des volumes des tumeurs au fil du temps et normaliser à partir du volume de la tumeur si vous le souhaitez. Des différences statistiques capture le jour même entre groupes d’échantillons peuvent être évaluées par un test t non apparié, dans lequel la signification est atteint lorsque P < 0,05. Analyses statistiques plus poussées peuvent et devraient être effectuées tel que recommandé par un biostatisticien formé.

Résultats

La conjugaison du TCO à huA33 repose sur le couplage entre le TCO-NHS amine-réactive et les résidus de lysine sur la surface de l’immunoglobuline. Cette méthode est très fiable et reproductible et fiable donne un degré de-marquage de 2-4 TCO/mAb. Dans ce cas, la spectrométrie de masse MALDI-ToF a été utilisée pour confirmer un degré d’étiquetage d’environ 4,0 TCO/mAb ; une valeur similaire a été obtenue en utilisant un fluorophore modifiés tetrazine comme un journali...

Discussion

L’un des points forts de cette approche en vivo pretargeting — en particulier en ce qui concerne les stratégies fondées sur des anticorps bispécifiques et radiomarqué haptènes — est sa modularité : trans- cyclooctène fractions peuvent être ajoutées à n’importe quel anticorps, et tetrazine radioligands peut être radioactif avec une extraordinaire variété de radionucléides sans nuire à leur capacité à réagir avec leurs partenaires de clic. Pourtant, l’adaptation de cette appro...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Dr Jacob Houghton pour les conversations utiles. Les auteurs tiens également à remercier le NIH pour leur généreuse contribution (R00CA178205 et U01CA221046).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)Sigma-Aldrich764523Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)Fisher ScientificA998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)Sigma-Aldrich70023Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)Fisher ScientificD143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrousFisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter UnitFisher ScientificUFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting ColumnsFisher Scientific45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrousFisher ScientificAC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)Fisher ScientificAC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)Fisher ScientificA116-50
Tumor measuring devicePeira TM900Peira TM900

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