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Method Article
Este protocolo descreve a síntese e caracterização de um trans- cyclooctene (TCO)-anticorpo e uma 177tetrazine Lu-rotulado (Tz) radioligantes para pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) modificados. Além disso, ele detalha o uso dessas duas construções para na vivo biodistribuição e estudos longitudinais terapia em um modelo murino de câncer colorretal.
Enquanto radioimmunotherapy (RIT) é uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, o Half-Life longo farmacocinético de anticorpos radiolabeled pode resultar em doses de radiação para os tecidos saudáveis. Talvez não surpreendentemente, várias estratégias diferentes foram desenvolvidas para contornar esta limitação preocupante. Uma das mais promissoras dessas abordagens é pretargeted radioimmunotherapy (Thayse). Thayse baseia-se na dissociação entre o radionuclídeo de imunoglobulina a, injetá-las separadamente e em seguida, permitindo-lhes combinar na vivo no tecido-alvo. Esta abordagem aproveita as propriedades excepcionais do tumor-direcionamento de anticorpos enquanto contornando seus inconvenientes farmacocinéticos, desse modo reduzindo a doses de radiação para os tecidos não-alvo e facilitar o uso de radionuclídeos com meias-vidas considerado demasiado curto para uso em radioimmunoconjugates tradicionais. Nos últimos cinco anos, nosso laboratório e outros desenvolveram uma abordagem na vivo pretargeting baseado na reação de Diels-Alder (IEDDA) de elétrons-demanda inversa entre trans- cyclooctene (TCO) e tetrazine (Tz). Esta estratégia tem sido aplicada com sucesso a pretargeted tomografia por emissão de pósitrons (PET) e de emissão de fóton único computadorizada (SPECT) de imagem com uma variedade de sistemas de antígeno-anticorpo. Em um par de publicações recentes, temos demonstrado a eficácia de Thayse IEDDA-baseado em modelos murino de adenocarcinoma ductal do pâncreas e carcinoma colorrectal. Neste protocolo, descrevemos os protocolos para Thayse usando um radioligantes tetrazine Lu-DOTA-rotulado de 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e uma variante de TCO-modificado do câncer colorretal direcionamento anticorpo huA33 (huA33-TCO). Mais especificamente, iremos descrever a construção de huA33-TCO, a síntese e radioativos de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz e o desempenho de biodistribuição no vivo e estudos longitudinais terapia em modelos murino de carcinoma colorretal.
Radioimmunotherapy (RIT) — o uso de anticorpos para a entrega de radionuclídeos terapêuticos para tumores — tem sido uma abordagem atraente para o tratamento de câncer1,2. Com efeito, esta promessa tem sido sublinhada pelos Estados Unidos, Food and Drug Administration da aprovação de dois radioimmunoconjugates para o tratamento de linfoma não-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan e 131tositumomab eu3 , 4. ainda mesmo desde seus primeiros dias, as perspectivas clínicas de RIT foram dificultadas por uma complicação crítica: taxas de dose alta de radiação para os tecidos saudáveis5,6. De um modo geral, radioimmunoconjugates para RIT são rotulados com radionuclídeos de vida longa (por exemplo, 131eu [t½ = 8,0 dias] e 90Y [t½ = 2,7 dias]) com meia-vida física que se encaixam bem com o farmacocinéticas longa semi-vida de imunoglobulinas. Isto é essencial, pois garante que radioatividade suficiente permanece, uma vez que o anticorpo alcançou sua biodistribuição ideal após vários dias de circulação. No entanto, esta combinação de tempos de residência de longa no sangue e tempo físico de meia-vida inevitavelmente resulta na irradiação dos tecidos saudáveis, desse modo reduzindo relações terapêuticas e limitando a eficácia da terapia7. Várias estratégias têm sido exploradas para contornar este problema, incluindo a utilização de fragmentos de anticorpos truncado como Fab, Fab', F(ab')2, minibodies e nanobodies8,9,10. Uma das mais promissoras e fascinante, no entanto, abordagens alternativas, inegavelmente complexas é na vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting é uma abordagem de imagem nuclear e terapia que visa aproveitar o requintado afinidade e seletividade de anticorpos enquanto contornando seus inconvenientes farmacocinéticos11,12,13. Para este fim, o anticorpo radiolabeled usado em radioimmunotherapy tradicional é desconstruído em dois componentes: uma pequena molécula radioligantes e um immunoconjugate que pode ligar tanto um antígeno tumoral e o radioligantes acima mencionados. O immunoconjugate é injetado primeiro e dado um 'avanço', muitas vezes de vários dias, durante o qual ele se acumula no tecido-alvo e limpa o sangue. Posteriormente, a pequena molécula radioligantes é administrado e combina com o immunoconjugate do tumor ou rapidamente limpa do corpo. Em essência, na vivo pretargeting depende de realização de radioquímica dentro do próprio corpo. Ao reduzir a circulação de radioatividade, esta abordagem simultaneamente reduz a doses de radiação para os tecidos saudáveis e facilita o uso de radionuclídeos (por exemplo, 68Ga, t½ = 68 min211; Como, t½ = 7,2 h) com meias-vidas que são normalmente considerados incompatíveis com vetores baseados em anticorpos.
Começando na década de 1980, um punhado de diferentes abordagens na vivo pretargeting foram desenvolvidos, incluindo estratégias baseadas em anticorpos bispecific, a interação entre streptavidin e biotina e a hibridação de complementares os oligonucleotides14,15,16,17,18. Ainda cada uma foi realizada a volta em diferentes graus por complicações, a mais famosa a imunogenicidade potente de anticorpos streptavidin-modificado19,20. Nos últimos cinco anos, o nosso grupo e outros desenvolveram uma abordagem na vivo pretargeting baseia o rapid e opaco elétron inversa demanda Diels-Alder ligadura entre trans- cyclooctene (TCO) e tetrazine (Tz) 21,22,23,24. A mais bem sucedida destas estratégias empregaram um anticorpo TCO-modificado e um radioligantes Tz-rolamento, como TCO é geralmente mais estável na vivo do que seu parceiro (Figura 1) de Tz25,26. Como em outras metodologias pretargeting, o immunoconjugate mAb-TCO é administrado primeiro e dado tempo para limpar de circulação e se acumulam no tecido do tumor. Posteriormente, a pequena molécula Tz radioligantes é injetado, após o qual ele clica com o immunoconjugate dentro do tecido-alvo ou limpa rapidamente do corpo. Esta na vivo pretargeting estratégia provou altamente eficaz para PET e SPECT de imagem com vários sistemas diferentes de antígeno/anticorpo, consistentemente produzir imagens com alto contraste e permitindo o uso de radionuclídeos de vida curto, tais como 18 F (t½ = 109 min) e Cu de 64(t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Mais recentemente, demonstrou-se a eficácia do clique-baseado pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) em modelos murino de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) e carcinoma colorrectal27,28. Para este fim, o radionuclídeo terapêutico 177Lu (βmáx = 498 keV, t1/2 = 6,7 dias) foi empregado em conjunto com dois anticorpos diferentes: 5B1, que tem como alvo o antígeno de carboidrato 19,9 (CA19.9) expressado ubiquitously no PDAC , e huA33, que tem como alvo a A33, uma glicoproteína transmembrana expressos em > 95% dos cancros colo-rectais. Em ambos os casos, esta abordagem a 177Lu-Thayse rendeu concentrações de alta atividade no tecido do tumor, criou um efeito terapêutico dose-dependente e simultaneamente reduzidas concentrações de actividade em tecidos saudáveis em relação ao tradicional radioimmunoconjugates diretamente-rotulados.
Neste artigo, descrevemos os protocolos para Thayse usando um radioligantes tetrazine Lu-DOTA-rotulado de 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e uma variante de TCO-modificado do anticorpo huA33 (huA33-TCO). Mais especificamente, nós descrevemos a construção de huA33-TCO (Figura 2), a síntese e radioativos de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figura 3 e Figura 4) e o desempenho da vivo em biodistribuição e estudos longitudinais terapia em modelos murino de carcinoma colorrectal. Além disso, na discussão e resultados representativos, apresentamos um conjunto de dados de amostra, possíveis estratégias de endereço para a otimização desta abordagem e considerar esta estratégia no contexto mais vasto na vivo pretargeting e Thayse. Finalmente, é importante notar que enquanto nós escolhemos focar pretargeting usando huA33-TCO e [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz no presente protocolo, esta estratégia é altamente modular e pode ser adaptado para atender uma ampla gama de anticorpos e radionuclidos.
Todos na vivo as experiências com animais descritas neste trabalho foram realizadas de acordo com protocolos aprovados e executadas sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center e Hunter College Institucional cuidados com animais e uso de comitês (IACUC).
1. a preparação do huA33-TCO
Nota: A síntese de huA33-TCO tem sido relatado anteriormente29. No entanto, para a facilidade do leitor, ela é replicada aqui com ajustes para condições ideais.
2. a síntese de Tz-PEG7- NHBoc
3. a síntese de Tz-PEG7-NH2
4. síntese de Tz-PEG7- DOTA
5. 177Lu radioativos de Tz-PEG7- DOTA
Atenção: Esta etapa do protocolo envolve a manipulação e a manipulação de radioatividade. Antes de executar essas etapas — ou realizando qualquer outro trabalho com radioactividade — pesquisadores devem consultar com departamento do sua instituição de origem de segurança de radiação. Tome todas as medidas possíveis para minimizar a exposição a radiações ionizantes.
Nota: Quando se trabalha com pequenas quantidades de radiometals é recomendável que todos os buffers isentos de metais para evitar a interferência na ligação de site de coordenação.
6. estudos in vivo
Cuidado: Como na seção 5, esta etapa do protocolo envolve a manipulação e a manipulação de radioatividade. Antes de executar essas etapas, os investigadores devem consultar com departamento do sua instituição de origem de segurança de radiação. Tome todas as medidas possíveis para minimizar a exposição a radiações ionizantes.
A conjugação de TCO para huA33 baseia-se o acoplamento entre o TCO-NHS-amina reativos e os resíduos de lisina na superfície da imunoglobulina a. Este método é altamente robusto e reprodutível e confiável, produz um grau de-rotulagem de 2-4 TCO/mAb. Neste caso, a espectrometria de massa MALDI-ToF foi empregada para confirmar um grau de rotulagem de aproximadamente 4.0 TCO/mAb; um valor semelhante foi obtido usando um fluoróforo-modificado tetrazine como um repórter
Um dos pontos fortes desta abordagem na vivo pretargeting — especialmente em relação às estratégias baseia bispecific anticorpos e radiolabeled haptens — é sua modularidade: trans- cyclooctene partes podem ser anexados a qualquer anticorpo, e tetrazine radioligands pode ser radiolabeled com uma extraordinária variedade de radionuclídeos, sem prejudicar a sua capacidade de reagir com os seus parceiros de clique. Ainda a adaptação desta abordagem para outro sistema de antígeno/anticorpo não...
Os autores não têm nada para divulgar.
Os autores agradecer Dr. Jacob Houghton conversas úteis. Os autores também gostaria de agradecer o NIH para seu financiamento generoso (R00CA178205 e U01CA221046).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
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