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Resumo

Este protocolo descreve a síntese e caracterização de um trans- cyclooctene (TCO)-anticorpo e uma 177tetrazine Lu-rotulado (Tz) radioligantes para pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) modificados. Além disso, ele detalha o uso dessas duas construções para na vivo biodistribuição e estudos longitudinais terapia em um modelo murino de câncer colorretal.

Resumo

Enquanto radioimmunotherapy (RIT) é uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, o Half-Life longo farmacocinético de anticorpos radiolabeled pode resultar em doses de radiação para os tecidos saudáveis. Talvez não surpreendentemente, várias estratégias diferentes foram desenvolvidas para contornar esta limitação preocupante. Uma das mais promissoras dessas abordagens é pretargeted radioimmunotherapy (Thayse). Thayse baseia-se na dissociação entre o radionuclídeo de imunoglobulina a, injetá-las separadamente e em seguida, permitindo-lhes combinar na vivo no tecido-alvo. Esta abordagem aproveita as propriedades excepcionais do tumor-direcionamento de anticorpos enquanto contornando seus inconvenientes farmacocinéticos, desse modo reduzindo a doses de radiação para os tecidos não-alvo e facilitar o uso de radionuclídeos com meias-vidas considerado demasiado curto para uso em radioimmunoconjugates tradicionais. Nos últimos cinco anos, nosso laboratório e outros desenvolveram uma abordagem na vivo pretargeting baseado na reação de Diels-Alder (IEDDA) de elétrons-demanda inversa entre trans- cyclooctene (TCO) e tetrazine (Tz). Esta estratégia tem sido aplicada com sucesso a pretargeted tomografia por emissão de pósitrons (PET) e de emissão de fóton único computadorizada (SPECT) de imagem com uma variedade de sistemas de antígeno-anticorpo. Em um par de publicações recentes, temos demonstrado a eficácia de Thayse IEDDA-baseado em modelos murino de adenocarcinoma ductal do pâncreas e carcinoma colorrectal. Neste protocolo, descrevemos os protocolos para Thayse usando um radioligantes tetrazine Lu-DOTA-rotulado de 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e uma variante de TCO-modificado do câncer colorretal direcionamento anticorpo huA33 (huA33-TCO). Mais especificamente, iremos descrever a construção de huA33-TCO, a síntese e radioativos de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz e o desempenho de biodistribuição no vivo e estudos longitudinais terapia em modelos murino de carcinoma colorretal.

Introdução

Radioimmunotherapy (RIT) — o uso de anticorpos para a entrega de radionuclídeos terapêuticos para tumores — tem sido uma abordagem atraente para o tratamento de câncer1,2. Com efeito, esta promessa tem sido sublinhada pelos Estados Unidos, Food and Drug Administration da aprovação de dois radioimmunoconjugates para o tratamento de linfoma não-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan e 131tositumomab eu3 , 4. ainda mesmo desde seus primeiros dias, as perspectivas clínicas de RIT foram dificultadas por uma complicação crítica: taxas de dose alta de radiação para os tecidos saudáveis5,6. De um modo geral, radioimmunoconjugates para RIT são rotulados com radionuclídeos de vida longa (por exemplo, 131eu [t½ = 8,0 dias] e 90Y [t½ = 2,7 dias]) com meia-vida física que se encaixam bem com o farmacocinéticas longa semi-vida de imunoglobulinas. Isto é essencial, pois garante que radioatividade suficiente permanece, uma vez que o anticorpo alcançou sua biodistribuição ideal após vários dias de circulação. No entanto, esta combinação de tempos de residência de longa no sangue e tempo físico de meia-vida inevitavelmente resulta na irradiação dos tecidos saudáveis, desse modo reduzindo relações terapêuticas e limitando a eficácia da terapia7. Várias estratégias têm sido exploradas para contornar este problema, incluindo a utilização de fragmentos de anticorpos truncado como Fab, Fab', F(ab')2, minibodies e nanobodies8,9,10. Uma das mais promissoras e fascinante, no entanto, abordagens alternativas, inegavelmente complexas é na vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting é uma abordagem de imagem nuclear e terapia que visa aproveitar o requintado afinidade e seletividade de anticorpos enquanto contornando seus inconvenientes farmacocinéticos11,12,13. Para este fim, o anticorpo radiolabeled usado em radioimmunotherapy tradicional é desconstruído em dois componentes: uma pequena molécula radioligantes e um immunoconjugate que pode ligar tanto um antígeno tumoral e o radioligantes acima mencionados. O immunoconjugate é injetado primeiro e dado um 'avanço', muitas vezes de vários dias, durante o qual ele se acumula no tecido-alvo e limpa o sangue. Posteriormente, a pequena molécula radioligantes é administrado e combina com o immunoconjugate do tumor ou rapidamente limpa do corpo. Em essência, na vivo pretargeting depende de realização de radioquímica dentro do próprio corpo. Ao reduzir a circulação de radioatividade, esta abordagem simultaneamente reduz a doses de radiação para os tecidos saudáveis e facilita o uso de radionuclídeos (por exemplo, 68Ga, t½ = 68 min211; Como, t½ = 7,2 h) com meias-vidas que são normalmente considerados incompatíveis com vetores baseados em anticorpos.

Começando na década de 1980, um punhado de diferentes abordagens na vivo pretargeting foram desenvolvidos, incluindo estratégias baseadas em anticorpos bispecific, a interação entre streptavidin e biotina e a hibridação de complementares os oligonucleotides14,15,16,17,18. Ainda cada uma foi realizada a volta em diferentes graus por complicações, a mais famosa a imunogenicidade potente de anticorpos streptavidin-modificado19,20. Nos últimos cinco anos, o nosso grupo e outros desenvolveram uma abordagem na vivo pretargeting baseia o rapid e opaco elétron inversa demanda Diels-Alder ligadura entre trans- cyclooctene (TCO) e tetrazine (Tz) 21,22,23,24. A mais bem sucedida destas estratégias empregaram um anticorpo TCO-modificado e um radioligantes Tz-rolamento, como TCO é geralmente mais estável na vivo do que seu parceiro (Figura 1) de Tz25,26. Como em outras metodologias pretargeting, o immunoconjugate mAb-TCO é administrado primeiro e dado tempo para limpar de circulação e se acumulam no tecido do tumor. Posteriormente, a pequena molécula Tz radioligantes é injetado, após o qual ele clica com o immunoconjugate dentro do tecido-alvo ou limpa rapidamente do corpo. Esta na vivo pretargeting estratégia provou altamente eficaz para PET e SPECT de imagem com vários sistemas diferentes de antígeno/anticorpo, consistentemente produzir imagens com alto contraste e permitindo o uso de radionuclídeos de vida curto, tais como 18 F (t½ = 109 min) e Cu de 64(t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Mais recentemente, demonstrou-se a eficácia do clique-baseado pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) em modelos murino de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) e carcinoma colorrectal27,28. Para este fim, o radionuclídeo terapêutico 177Lu (βmáx = 498 keV, t1/2 = 6,7 dias) foi empregado em conjunto com dois anticorpos diferentes: 5B1, que tem como alvo o antígeno de carboidrato 19,9 (CA19.9) expressado ubiquitously no PDAC , e huA33, que tem como alvo a A33, uma glicoproteína transmembrana expressos em > 95% dos cancros colo-rectais. Em ambos os casos, esta abordagem a 177Lu-Thayse rendeu concentrações de alta atividade no tecido do tumor, criou um efeito terapêutico dose-dependente e simultaneamente reduzidas concentrações de actividade em tecidos saudáveis em relação ao tradicional radioimmunoconjugates diretamente-rotulados.

Neste artigo, descrevemos os protocolos para Thayse usando um radioligantes tetrazine Lu-DOTA-rotulado de 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e uma variante de TCO-modificado do anticorpo huA33 (huA33-TCO). Mais especificamente, nós descrevemos a construção de huA33-TCO (Figura 2), a síntese e radioativos de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figura 3 e Figura 4) e o desempenho da vivo em biodistribuição e estudos longitudinais terapia em modelos murino de carcinoma colorrectal. Além disso, na discussão e resultados representativos, apresentamos um conjunto de dados de amostra, possíveis estratégias de endereço para a otimização desta abordagem e considerar esta estratégia no contexto mais vasto na vivo pretargeting e Thayse. Finalmente, é importante notar que enquanto nós escolhemos focar pretargeting usando huA33-TCO e [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz no presente protocolo, esta estratégia é altamente modular e pode ser adaptado para atender uma ampla gama de anticorpos e radionuclidos.

Protocolo

Todos na vivo as experiências com animais descritas neste trabalho foram realizadas de acordo com protocolos aprovados e executadas sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center e Hunter College Institucional cuidados com animais e uso de comitês (IACUC).

1. a preparação do huA33-TCO

Nota: A síntese de huA33-TCO tem sido relatado anteriormente29. No entanto, para a facilidade do leitor, ela é replicada aqui com ajustes para condições ideais.

  1. Em um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL, preparar uma solução de 125 μL de (E) - cyclooct - 4-enilo 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonato (TCO-NHS) em seco dimetil formamida (DMF) em uma concentração de 40 mg/mL (0,15 M). Esta solução pode ser aliquotadas e congeladas a-80 ° C para uso em experimentos futuros.
  2. Em um tubo de microcentrifuga separado 1,7 mL, prepare uma solução de 5 mg/mL de huA33 em 1 mL de solução salina de tampão fosfato (PBS; 2,7 mM cloreto de potássio, cloreto de sódio de 137 milímetros e fosfato de potássio de 11,9 mM, pH 7,4).
  3. Usando pequenas alíquotas (< 5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajustar o pH da solução de anticorpo passo 1,2 a 8,8-9.0. Use papel de pH ou um medidor de pH com um microeléctrodo para monitorar o pH e o cuidado especial que o pH não ultrapasse 9.0.
  4. Para a solução de anticorpo descrita na etapa 1.3, lentamente, adicione um volume correspondente a 40 equivalentes molares de TCO-NHS em relação à quantidade de anticorpos. Por exemplo, se 5 mg (30 nmol) de huA33 na solução, adicione 9.0 μL (1,20 μmol) da solução de 40 mg/mL (0,15 M) de TCO-NHS.
    Nota: TCO-NHS é hidrofóbica. Ao adicioná-lo à solução de anticorpo, adicioná-lo lentamente e com agitação para evitar a precipitação. Não exceda 10% DMF pelo volume da solução final da reação.
  5. Permitir que a reação a incubar a 25 ° C, em um thermomixer para 1 h com agitação suave (500 rpm).
  6. Depois de 1 h, purifica o immunoconjugate de huA33-TCO usando uma coluna do desalting exclusão de tamanho descartáveis pré-embalados.
    1. Equilibrar a coluna de exclusão de tamanho, conforme descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Um procedimento típico envolve lavar a coluna 5 x com um volume de PBS que corresponde ao volume da coluna: 5 x 2,5 mL de PBS.
    2. Adicione a mistura de reação à coluna de exclusão de tamanho, observando o volume da mistura de reação.
    3. Após a mistura de reação entrou a coluna, adicionar uma quantidade adequada de PBS para trazer o volume total da solução adicionado à coluna de 2,5 mL. Por exemplo, se a reação de conjugação resultou em um volume total de 1,3 mL, adicione 1,2 mL de PBS adicionais à coluna.
    4. Recolha o produto usando 2 mL de PBS como eluente.
      Nota: Este passo irá produzir o construção final huA33-TCO em 2 mL de PBS, pH 7,4.
  7. Medir a concentração do huA33-TCO usando um espectrofotômetro UV-Vis, monitorando o comprimento de onda nm 280. O coeficiente de extinção molar para a maioria das IgGs (ε280) é 210.000 M-1cm-1.
  8. Se uma solução com uma concentração mais elevada de immunoconjugate é desejada, concentrar a solução de huA33-TCO usando uma unidade de filtro centrífugo com um limite de 50.000 peso molecular seguindo as instruções do fabricante.
    Nota: Muitos anticorpos foram conhecidos para agregar ou precipitar durante a concentração. Ao tentar este procedimento com um novo anticorpo, pesquisadores devem adiar para a literatura ou a sua própria experiência em lidar com o anticorpo em questão.
  9. Armazene o immunoconjugate de huA33-TCO concluído a 4 ° C no escuro, se for necessário imediatamente. Se é para ser usado mais de 4 dias no futuro, armazene-o a-80 ° C, no escuro.
    Nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O immunoconjugate de huA33-TCO concluído deve ser estável para o armazenamento de pelo menos 6 meses a-80 ° C, no escuro.

2. a síntese de Tz-PEG7- NHBoc

  1. Em um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL, dissolva 5 mg de tetrazine N- hydroxysuccinimidyl éster (Tz-NHS; 12.6 μmol) em 0,15 mL de anidro dimetilsulfóxido (DMSO).
  2. Em um tubo de microcentrifuga separado 1,7 mL, dissolva 8 mg do Boc-protegido amino PEG polímero, glicol de O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol) em 0,15 mL de DMSO anidro.
  3. Para a solução de Tz-NHS, adicione 3 μL (μmol 21.3, 1,7 equivalentes molares) de trietilamina (TEA) e misture bem.
  4. Adicionar a solução de tetrazine-de-rosa para a solução do PEG-NHBoc7-NH2 da etapa 2.2 e incubar a mistura de reação durante 30 min à temperatura ambiente (RT) com leve agitação.
  5. Após 30 minutos, diluir a reação 1:1 em H2O e purificar a reação usando fase inversa C18 alto-cromatografia líquida (HPLC) para separar qualquer Tz-NHS não tenha reagido da Tz-PEG7- NHBoc. Use solventes sem ácido para impedir a remoção prematura do Boc protegendo o grupo. Monitorar ambos Tz-PEG7- NHBoc e Tz-NHS no comprimento de onda de 525 nm.
    Nota: Tempos de retenção são obviamente altamente dependentes do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), e controles apropriados devem ser executados antes da purificação. No entanto, apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos sem qualquer aditivo) para 95:5 MeCN/H2O mais de 30 min, uma taxa de fluxo de 1 mL/min e uma coluna de18analítico 4,6 x 250 mm C são usados , os tempos de retenção de Tz-NHS e Tz-PEG7- NHBoc são em torno de 16 min e 18 min, respectivamente.
  6. Congelar o eluente HPLC coletado usando nitrogênio líquido e enrolar o tubo congelado agora coleção em papel de alumínio. O tubo de coleta congelado em um Liofilizador de lugar durante a noite para remover a fase móvel para HPLC. O produto será um sólido de cor de rosa brilhante característico.
    Nota: Se não houver nitrogênio líquido, congelar o eluente HPLC coletado em gelo seco ou durante a noite em um freezer-80 ° C.

3. a síntese de Tz-PEG7-NH2

  1. Para o produto do passo 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, adicionar 1,5 mL de diclorometano (DCM) e transferir esta solução para um balão de fundo redondo pequeno.
  2. Adicione 0,25 mL de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota à solução rosa de passo 3.1.
  3. Permitir que a reação de incubar durante 30 min à RT com leve agitação.
  4. Depois de 30 min, evapore a solvente através de evaporação rotativa. Não exceder a temperatura do banho de água de 37 ° C.
  5. Reconstitua o produto viscoso rosa em 0,5 mL de água.
  6. Purifica o produto usando fase inversa C18 HPLC para separar o precursor protegido Boc Tz-PEG7-NH2 . Monitorar ambos Tz-PEG7- NHBoc e Tz-PEG7-NH2 no comprimento de onda de 525 nm.
    Nota: Tempos de retenção são obviamente altamente dependentes do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), e controles apropriados devem ser executados antes da purificação. No entanto, apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos com 0,1% TFA) para 95:5 MeCN/H2O mais de 30 min, uma taxa de fluxo de 1 mL/min e uma coluna de18analítico 4,6 x 250 mm C são usados , os tempos de retenção dos Tz-PEG7- NHBoc e Tz-PEG7-NH2 são em torno de 18 min e 13 min, respectivamente.
  7. Congelar o eluente HPLC coletado usando nitrogênio líquido e enrolar o tubo congelado agora coleção em papel de alumínio. O tubo de coleta congelado em um Liofilizador de lugar durante a noite para remover a fase móvel para HPLC. O produto será um sólido de cor de rosa brilhante.
  8. Reconstitua o produto de etapa 3.7, Tz-PEG7-NH2com 150 μL de DMSO e transferir para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL.
  9. Medir a concentração de PEG-Tz7-NH2 usando um espectrofotômetro UV-Vis, o comprimento de onda nm 525 de monitoramento. O coeficiente de extinção molar para Tz-PEG7-NH2 (ε525) é 535 M-1cm-1.

4. síntese de Tz-PEG7- DOTA

  1. Dissolver o Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6.9 μmol) em 0,15 mL de DMSO (ou simplesmente prosseguir com a solução criada no passo 3.8).
  2. Adicione 22 equivalentes molares de chá (21 μL, 0,15 mmol) à solução contendo tetrazine da etapa 4.1.
  3. Adicione 10 mg (14,2 μmol) de p- SCN-Bn-DOTA como um sólido e vortex a solução para cerca de 2 minutos ou até que o material é totalmente dissolvido.
  4. Permitir que a reação de incubar durante 30 min à RT com leve agitação.
  5. Depois de 30 min, diluir a reação 1:1 em H2O e purificar o produto usando fase inversa C18 HPLC para remover não tenha reagido p- SCN-Bn-DOTA. O p- SCN-Bn-DOTA pode ser monitorado no comprimento de onda de 254 nm, enquanto o Tz-PEG7- DOTA é melhor monitorado no comprimento de onda de 525 nm.
    Nota: Tempos de retenção são obviamente altamente dependentes do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), e controles apropriados devem ser executados antes da purificação. No entanto, apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos com 0,1% TFA) para 95:5 MeCN/H2O mais de 30 min e uma coluna de18analítico 4,6 x 250 mm C são usados, Tz-PEG7- DOTA e p-SCN-Bn-DOTA têm tempos de retenção de em torno de 15,6 min e 16,1 min, respectivamente.
  6. Congelar o eluente HPLC coletado usando nitrogênio líquido e enrolar o tubo congelado agora coleção em papel de alumínio. O tubo de coleta congelado em um Liofilizador de lugar durante a noite para remover a fase móvel para HPLC. O produto será um pó-de-rosa brilhante.
  7. Reconstituir o produto em 0,15 mL de DMSO e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV-Vis, o comprimento de onda nm 525 de monitoramento. O coeficiente de extinção molar para Tz-PEG7- DOTA (ε525) é 535 M-1cm-1.
  8. Analisar o composto final por ressonância magnética nuclear (NMR) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) para verificar se essa síntese foi bem sucedida. Consulte a tabela 1 para as mudanças químicas determinadas experimentalmente e pesos moleculares de todos os compostos discutidos neste trabalho.
  9. Armazenar a solução DOTA -7Tz-PEG purificada no escuro a-80 ° C.
    Nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O precursor DOTA -7Tz-PEG concluído é estável pelo menos 1 ano nestas condições.

5. 177Lu radioativos de Tz-PEG7- DOTA

Atenção: Esta etapa do protocolo envolve a manipulação e a manipulação de radioatividade. Antes de executar essas etapas — ou realizando qualquer outro trabalho com radioactividade — pesquisadores devem consultar com departamento do sua instituição de origem de segurança de radiação. Tome todas as medidas possíveis para minimizar a exposição a radiações ionizantes.

Nota: Quando se trabalha com pequenas quantidades de radiometals é recomendável que todos os buffers isentos de metais para evitar a interferência na ligação de site de coordenação.

  1. Num tubo de centrífuga 1,7 mL, adicione 200 μL de tampão de acetato de amônio 0,25 M ajustado com alíquotas de 1 M HCl para pH 5,5.
    Nota: Se usar menos de 370 MBq de atividade para a rotulagem, o volume do buffer usado deve ser reduzido a 100 µ l.
  2. Adicione a quantidade desejada de [177Lu] LuCl3 para a solução-tampão. A quantidade adicionada será dependente do número de assuntos com a experiência e as doses radioactivas sendo administradas. Recomenda-se que doses extras de 1-2 vale de radioactividade ser adicionado como uma precaução para compensar a perda potencial de radioactividade durante as etapas de purificação.
  3. Adicionar Tz-PEG7- DOTA em DMSO à mistura radioativa no passo 5.2. A quantidade de Tz-PEG7- DOTA é dependente do número de indivíduos sendo testado. Mais detalhes sobre este tema podem ser encontrados na etapa 6.2.2.2.
  4. Permitir que a solução incubar a 37 ° C por 20 min.
  5. Verifique se que o radioativos é concluída usando cromatografia de camada fina instantânea de rádio (rádio-iTLC) com 50 mM de EDTA, pH 5.5 como fase móvel. O rotulado [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz permanecerá na linha de base — Rf = 0 — enquanto livre [177Lu] Lu3 + será coordenado pelo EDTA e vai viajar com a frente do solvente, Rf = 1,0 (Figura 3B).
  6. Se rotulando quantitativa não é alcançado, adicione ligante adicional para coordenar o radiometal livre. Alternativamente, purificar o rotulado [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz usando um cartucho de18 C. Siga as instruções do fabricante para uso. Um procedimento de exemplo é dado abaixo.
    1. Encha o cartucho, passando lentamente 5 mL de etanol através do cartucho com uma seringa grande. Em seguida, passar por 5 mL de acetonitrilo e, em seguida, 5 mL de deionizada (DI) H2O.
    2. Elaborar a solução de radioligantes de passo 5.3 numa seringa menor e injetá-lo lentamente para o cartucho de18 C. Em seguida, lavar o cartucho com 10 mL de DI H2O para remover qualquer desassociada [177Lu] LuCl3.
    3. Eluir com 500 µ l de etanol. Remova qualquer etanol do produto final, passando sobre o navio com uma baixa taxa de fluxo de nitrogênio seco ou argônio para 10-15 min. Posteriormente, resuspenda o radioligantes em solução salina em um volume determinado na etapa 6.2.2.2.

6. estudos in vivo

Cuidado: Como na seção 5, esta etapa do protocolo envolve a manipulação e a manipulação de radioatividade. Antes de executar essas etapas, os investigadores devem consultar com departamento do sua instituição de origem de segurança de radiação. Tome todas as medidas possíveis para minimizar a exposição a radiações ionizantes.

  1. Preparação de animais
    1. Em camundongos modelo feminino, 5 x 106 SW1222 células de cancro colo-rectal, suspendidas em 150 μL de uma mistura 1:1 da mídia de célula e matriz do implante por via subcutânea (EG., Matrigel) e permitir que estas crescer em um transplante de3 100-150 mm (14-18 dias após a inoculação).
    2. Classificação dos animais para um experimento de biodistribuição
      1. Uma vez que os tumores são de tamanho suficiente, conforme determinado pela medição do compasso de calibre, classificar os animais para garantir que cada coorte tem aproximadamente o mesmo volume de tumor médio. Os animais podem ser distinguidos em cada gaiola por marcações na cauda com tinta indelével (uma banda, duas bandas, etc.).
    3. Classificação dos animais para um estudo longitudinal de terapia
      1. Uma vez que os tumores são de tamanho suficiente, conforme determinado pela medição do compasso de calibre, anexe marcas auriculares para cada um dos animais para garantir o correto acompanhamento durante todo o experimento.
        Nota: As marcas auriculares numérica podem cair ao longo do experimento. Como resultado, é recomendável para acompanhar essas marcas físicas com entalhes de orelha de forma sistemática (i. e., direita, esquerda, bilateral, direito x 2, esquerda x 2).
      2. Classificar os animais para que o volume médio de tumor em cada coorte é aproximadamente igual. O seguinte método para classificação de animais pode ser realizado usando um programa de planilha.
        1. Lista os números de identificação dos animais, padrão de entalhe de orelha e volume do tumor em três colunas separadas.
        2. Classificar os dados do menor para o maior volume do tumor.
        3. Em uma quarta coluna, atribua a cada animal um número de gaiola e percorrer as gaiolas em um padrão snakelike. Por exemplo, se há 5 gaiolas, esta coluna seria preenchido "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." até que todos os animais são atribuídos a uma gaiola.
        4. Uma vez que as gaiolas são atribuídas, classificar os dados pelo número de gaiola. Se entalhes de orelha estão sendo usados, certifique-se de que cada animal em uma gaiola dada tem um padrão de entalhe de orelha exclusivo. Se houver duplicatas (dois ou mais do mesmo padrão) em uma gaiola dada, troca um rato com uma outra gaiola com o padrão ausente até cada gaiola tem animais com padrões de entalhe de orelha exclusivo.
  2. Formulações e injeções
    Nota: A sequência de injeção para estudo tanto biodistribuição e terapia procede da seguinte forma: huA33-TCO é injetado em primeiro lugar, seguido por [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz após um intervalo pré-determinado.
    1. Immunoconjugate
      1. Dilua uma alíquota da solução huA33-TCO de 1,9 passo a uma concentração de 0,8 mg/mL em solução salina estéril 0,9%.
      2. Desenhar a doses de 150 µ l (100 µ g) de solução de huA33-TCO em seringas pré-tratados com 1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS e armazenar essas seringas no gelo.
        Nota: BSA tratamento reduz a ligação não-específica do anticorpo para as paredes da seringa.
      3. Aquecer os animais sob uma lâmpada de calor por 3 minutos dilatar a veia da cauda.
      4. Injete a solução de huA33-TCO a veia da cauda do rato xenoenxertos-rolamento. Permitir que 24h (ou um intervalo de tempo pré-determinado diferente) para o huA33-TCO acumular no tumor do mouse.
    2. Radioligantes
      1. Radiolabel Tz-PEG7- DOTA conforme descrito na seção 5.
      2. Desenhe doses em 150 μL de 0,9% estéril salina contendo 1,1 molares equivalentes de Tz-PEG7- DOTA em relação a quantidade de huA33-TCO administrado. Por exemplo, se 100 μg (0.67 nmol) de huA33-TCO foi injetado o animal e a mistura de reação [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz foi feita com uma actividade específica de 12.4 GBq/μmol, então doses serão desenhados contendo 9,14 MBq de atividade de cada. Isso corresponde a 0,74 nmol de Tz (1.1 EQ. molar relativo ao huA33-TCO).
      3. Aquecer os animais sob uma lâmpada de calor por 3 min dilatar a veia da cauda.
      4. Injete a dose de radioligantes a veia da cauda do rato xenoenxertos-rolamento. A quantidade de atividade a ser injetado é determinada pelo pesquisador. Dados publicados têm demonstrado efeitos terapêuticos de dose-dependente no tamanho do tumor dentro de um intervalo de 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribuição
    1. No ponto de tempo desejado após a administração da radioligantes, eutanásia em cada coorte de ratos usando uma de 2% O2 / 6% CO2 mistura de gás.
      Nota: Siga todas as exigências institucionais sobre métodos de eutanásia física secundária (por exemplo, deslocamento cervical).
    2. Para cada animal, remover todos os órgãos de interesse, lave-os em um banho de água para remover qualquer excesso de sangue e secá-las com uma toalha de papel ao ar livre para a lista de órgãos de amostra de 5 min. na ordem sugerida: sangue, tumor, coração, pulmões, fígado, baço, estômago, intestino delgado , intestino, rins, músculo, osso, pele, cauda.
    3. Uma vez suficientemente seco, coloque os órgãos em tubos de cultura descartável pré-pesados. Pese os tubos cheios agora mais uma vez para obter a massa de cada órgão ou tecido.
    4. Medir a atividade em cada um dos tubos usando um contador gama. Calibre a atividade medida no contador gama ao detector usado para medir a dose desenhada. Contagem radioativas padrões de 177Lu em cada instrumento e determinar o fator de calibração para interconversão entre atividade e contagens por minuto (cpm).
    5. Plotar os biodistribuição dados como um gráfico de barras (consulte a Figura 5) com a média normalizada de absorção para cada órgão exibido junto com um bar que denota um desvio padrão. Diferenças estatísticas na captação entre grupos de amostra podem ser avaliadas por um teste t pareado, no qual significado é alcançado quando p < 0,05.
  4. Monitoramento de terapia
    1. Com pinças, meça o lado maior do tumor oblongo (comprimento) bem como a largura, que é perpendicular ao comprimento. Calcular o volume utilizando a fórmula para o volume de um elipsoide: πL· (4/3) W· H, o que simplifica a ½L· W2, assumindo que a altura é aproximadamente igual à largura.
      Nota: Também é possível usar um tumor portátil, dispositivo de medição, se um estiver disponível (veja a Tabela de materiais).
    2. Pese cada rato sobre uma balança para controlar o ganho de peso ou perda de peso ao longo do tempo.
    3. Importante, monitore a aparência física de cada animal para sinais de perigo, tais como curvado para trás ou rompidos vasos sanguíneos cutâneos (que pode indicar haematotoxicity).
      Nota: As medições do Tumor devem ser coletadas a cada 1-2 dias no decurso do estudo longitudinal de terapia.
    4. Dados do enredo da terapia longitudinal estudar como médios volumes de tumor ao longo do tempo e normalizar para o volume de tumor inicial, se desejado. Diferenças estatísticas na captação no mesmo dia, entre grupos de amostra podem ser avaliadas por um teste t pareado, no qual significado é alcançado quando P < 0,05. Análises estatísticas mais extensas podem e devem proceder conforme recomendado por um biostatistician treinado.

Resultados

A conjugação de TCO para huA33 baseia-se o acoplamento entre o TCO-NHS-amina reativos e os resíduos de lisina na superfície da imunoglobulina a. Este método é altamente robusto e reprodutível e confiável, produz um grau de-rotulagem de 2-4 TCO/mAb. Neste caso, a espectrometria de massa MALDI-ToF foi empregada para confirmar um grau de rotulagem de aproximadamente 4.0 TCO/mAb; um valor semelhante foi obtido usando um fluoróforo-modificado tetrazine como um repórter

Discussão

Um dos pontos fortes desta abordagem na vivo pretargeting — especialmente em relação às estratégias baseia bispecific anticorpos e radiolabeled haptens — é sua modularidade: trans- cyclooctene partes podem ser anexados a qualquer anticorpo, e tetrazine radioligands pode ser radiolabeled com uma extraordinária variedade de radionuclídeos, sem prejudicar a sua capacidade de reagir com os seus parceiros de clique. Ainda a adaptação desta abordagem para outro sistema de antígeno/anticorpo não...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Dr. Jacob Houghton conversas úteis. Os autores também gostaria de agradecer o NIH para seu financiamento generoso (R00CA178205 e U01CA221046).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)Sigma-Aldrich764523Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)Fisher ScientificA998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)Sigma-Aldrich70023Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)Fisher ScientificD143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrousFisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter UnitFisher ScientificUFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting ColumnsFisher Scientific45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrousFisher ScientificAC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)Fisher ScientificAC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)Fisher ScientificA116-50
Tumor measuring devicePeira TM900Peira TM900

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