Un modelo de cultivo de tejidos Ex Vivo para las complicaciones Fibrovascular en la retinopatía diabética proliferativa

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa mediante el uso de los tejidos derivados del paciente quirúrgico suprimido, fibrovasculares de tejido nativo tridimensional caracterización y ex vivo la cultura. Esta ex modelo de cultura vivo también es favorable para probar o desarrollar nuevos tratamientos.

Resumen

Retinopatía diabética (RD) es la complicación microvascular más frecuente de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en adultos en edad de trabajar. No actuales modelos animales de diabetes y la retinopatía inducida por el oxígeno convierten los cambios progresivos de gama completa que se manifiesta en humana retinopatía diabética proliferativa (PDR). Por lo tanto, comprensión de la patogénesis de la enfermedad y la patofisiología ha dependido en gran medida el uso de secciones histológicas y muestras de vítreas en planteamientos que sólo proporcionan información de estado de equilibrio en los factores patogénicos implicados. Creciente evidencia indica que célula dinámica e interacciones de la matriz extracelular de la célula (MEC) en el contexto de microambientes (3D) tridimensionales son esenciales para los estudios mecanicistas y funcionales para el desarrollo de nuevos estrategias de tratamiento. Por lo tanto, la hipótesis de que el tejido fibrovascular patológico suprimido quirúrgico de ojos con RDP podría utilizarse confiablemente desentrañar los mecanismos celulares y moleculares de esta enfermedad devastadora y poner a prueba el potencial clínico de la novela intervenciones. Hacia este fin, hemos desarrollado un novedoso método para 3D ex vivo cultura de suprimido quirúrgico derivados del paciente tejido fibrovascular (FT), que servirá como un modelo relevante de Fisiopatología humana de PDR. La FTs se diseca en explantes y embebida en matriz de fibrina para ex vivo cultura y 3D caracterización. Conjunto Monte inmunofluorescencia de la FTs nativos y culturas punto final permite investigación exhaustiva de la composición tisular y procesos multicelulares, destacando la importancia de la caracterización de nivel tejido 3D para descubrir características relevantes de Fisiopatología de la PDR. Este modelo permite la evaluación simultánea de los mecanismos moleculares, celulares y tejidos procesos y las respuestas al tratamiento en el contexto complejo de interacciones bioquímicas y físicas dinámicas dentro de la arquitectura del tejido PDR y el microambiente. Este modelo recoge Fisiopatología PDR, también será favorable para pruebas o desarrollo de nuevos tratamientos.

Introducción

DR es una grave complicación ocular de la diabetes, una enfermedad que ha alcanzado proporciones enormes en los últimos tres décadas¹. Veinte años después de diagnosis, prácticamente todos los pacientes con diabetes tipo 1 y el 60% de los pacientes con tipo 2 diabetes presente las muestras de la retinopatía, que diabetes por sí uno de los principales causas de ceguera en adultos de edad²de trabajo. Según el nivel de degeneración microvascular y daño isquémico, DR se clasifica en RD no proliferativa (no democrática) y Rd proliferativa (RDP). La enfermedad, PDR, se caracteriza por la neovascularización inducida por la isquemia y la inflamación y respuesta fibrótica en la interfase vítreo-retina. En condiciones no tratadas, estos procesos conducirá a la ceguera debido a hemorragia vítrea, fibrosis retiniana, la separación retiniana del tractional y neovascular glaucoma^3,4. A pesar de los avances recientes, las opciones actuales de tratamiento objetivo sólo DR etapas, incluso el edema macular diabético y PDR, daño retiniano ha ya se produjo. Por otra parte, una gran proporción de pacientes del Dr. no se beneficia del actual arsenal terapéutico de tratamiento, lo que indica una necesidad urgente de mejores terapias^4,5,6.

Otros yovivo n modelos de enfermedad, del desarrollo y múltiples modelos animales diabéticos se han desarrollado hasta la fecha, pero ninguno de ellos recoge toda la gama de características patológicas observadas en humanos PDR^7,8. Además, la creciente evidencia indica que las respuestas al tratamiento están conectadas firmemente a la composición del ECM, así como el arreglo espacial y la interacción entre el microambiente celular y acelular⁹. Nosotros, por lo tanto, para desarrollar un modelo clínico relevante de PDR humana utilizando el material patológico de FT que es suprimido comúnmente de ojos sometidos a vitrectomía como parte de la gerencia quirúrgica del PDR¹⁰.

Este manuscrito describe el protocolo para el 3D ex vivo cultura y caracterización de la quirúrgico-suprimido, PDR pies patológicos derivados del paciente. El método aquí descrito se ha utilizado en una publicación reciente que demostró éxito deconstrucción del nativo paisaje de tejido 3D de PDR y recapitulación de las características de la patofisiología PDR angiogénicos como respuesta fibrótica de la anormal estructuras vasculares¹¹. Este modelo también reveló características novedosas que no pueden ser fácilmente apreciadas desde finas secciones histológicas, tales como espacialmente limitan apoptosis y proliferación, así como formación de islotes vasculares¹¹. Líquido vítreo se ha utilizado con éxito por otras culturas esferoide endotelial 3D para evaluar su potencial angiogénico y la eficacia de angiostatic moléculas¹². Cuando se combina con un esferoide de células endoteliales linfáticas 3D (LEC) en vitro brotación ensayo utilizando vítreo PDR como estimulante, nuestro modelo reveló que la contribución de ambos vitreal soluble factores claves así como locales en el tejido neovascular de la todavía mal entendida implicación de LEC en PDR Fisiopatología^3,11. En la gestión de PDR, cirugía vitreorretiniana es un procedimiento rutinario realizado pero desafiante. Como instrumentación quirúrgica y técnicas están viendo continuo adelanto y sofisticación, eliminación oportuna y conservador de muestra proliferativo fibrovascular no sólo mejora el resultado de la visión sino que también proporciona material de tejido muy valiosa para la investigación de respuestas de la patofisiología y el tratamiento de la PDR en los aspectos complejos de la traslación del microambiente del tejido humano vivo.

Protocolo

Esta investigación fue aprobada por la Junta de revisión institucional y Comité de ética del Hospital Universitario de Helsinki. Firmado el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.

1. preparación de soluciones, medios y equipos

1. Preparar el siguiente equipo antes de la obtención del tejido fibrovascular (FT) para asegurar un procesamiento rápido.
   1. Pinzas de microdisección estéril-autoclave dos.
   2. Preparar 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) disolviendo 1 tableta de PBS previamente pesada (0.14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO₄^-3) en 900 mL de agua desionizada y mezclar para disolver. Ajustar el volumen de agua hasta 1 L y estéril-autoclave la solución preparada. Tienda a TA.
   3. Recoger la solución mencionado y el equipo en una cesta, junto con un bisturí estéril de un solo uso, una placa de cultivo estéril de 6 cm de célula y cinco placas estériles celular 12-bien.
2. Preparar un 6 mg/mL solución de fibrinógeno en Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) disolver 30 mg de fibrinógeno humano plasminógeno-agotado en 5 mL de HBSS, usando un tubo de 50 mL sumergido en un baño de agua a 37 ° C, durante al menos 1 h.
   Nota: Esta solución puede conservarse en el baño de agua (37 ° C) durante 7 horas (máximo 10 h) antes de su uso.
3. Preparar el ex vivo medio de cultivo mediante la adición de 5% de suero fetal de ternero (FCS) o 5% de suero humano, 0.4% suplemento para crecimiento celular endotelial, 10 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona μg/mL 1 y 50 μg/mL gentamicina a comercialmente disponibles medio de cultivo de células endoteliales y mantener en baño de agua a 37 ° C hasta su uso. Almacenar a 4 ° C por hasta un mes.

2. disección del tejido fibrovascular

1. Recoger el tejido fibrovascular (FT) que ha sido suprimido de los sujetos humanos sometidos a la cirugía de vitreoretinal microincision trans conjuntival, por 23 o 20 calibre tres-puerto equipara el plana vitrectomy como parte de la gerencia quirúrgica del vitreoretinal del PDR.
   Nota: El FT es suprimido mediante segmentación y delaminación, cortar si es necesario con microscissors y quitado de la cavidad vítrea con Micro-pinzas agarre extremo intraocular por cirujano experimentado. Extremo cuidado debe ser tomado para eliminar pies intactos y en perfecto estado sin dañar las estructuras oculares incluyendo el nervio óptico o la arcada vascular temporal donde se encuentra comúnmente el tejido patológico neovascular. El tamaño del tejido suprimido es variable, generalmente que van entre 3 y 50 mm².
2. Mantener los pies en una placa de cultivo celular de 6 cm o en tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de PBS estéril colocada en hielo húmedo y transferirla inmediatamente a la investigación de laboratorio para el procesamiento.
   Nota: Es imprescindible que la unidad de investigación (instalaciones de laboratorio) está físicamente cerca de la sala de operaciones del hospital (OR) para reducir al mínimo los tiempos de traslado de los pequeños pies suprimido. En este caso la transferencia toma menos de 5 minutos y los explantes se encajan dentro de fibrina generalmente en 1-1.5 h (máximo 2 h) después de la extirpación quirúrgica. El impacto del tiempo de transferencia en la cultura 3D tendría que ser probado.
3. Coloque los pies en una placa de cultivo celular de 6 cm que contiene 1 mL de PBS a temperatura ambiente (RT, 25 ° C) y adquirir imágenes del tejido mediante un microscopio de epifluorescencia invertida con un objetivo de 5 x.
   Nota: Se adquieren imágenes de documentación y evaluación cualitativa. Será posible observar el tamaño del tejido, la densidad y la composición general (p. ej., estructuras vasculares).
4. Cortar los pies ~ 1 mm² piezas bajo un estereomicroscopio de disección vertical, usando una pinza estéril de bisturí y microdisección. Mantener el tejido, bien sumergido en PBS, utilizando una pinza de microdisección y realizar cortes claros con un bisturí estéril. Evite rasgado FT, ya que esto alteraría las estructuras nativas fibrovasculares.
5. Coloque cada pieza en un pozo de una placa de cultivo celular 12-bien que contiene 1 mL de PBS estéril.
   Nota: Si es necesario, extender suavemente el FT en la placa, usando pinzas de microdisección, antes de realizar cortes.

3. gotas de Gel de fibrina vertical del bastidor para la caracterización de FT nativa y cultivo Ex Vivo

1. Filtro estéril la solución de fibrinógeno listo preparado en el paso 1.2 con filtro de 0.22 micras montada en una jeringa de 10 mL.
2. Preparar alícuotas de la solución de fibrinógeno (25 μL por tubo de 1.5 mL) y mantener en RT. Prepare una alícuota para fibrina gel cada pieza FT obtenidos después de la disección, y un par de alícuotas adicionales para probar la fibrina formación del gel.
3. Prepare una solución de HBSS conteniendo 4 unidades/mL de trombina y 400 μg/mL de aprotinina, llamada en adelante TA solución y mantener en RT. preparar solución como mucho TA según sea necesario, dependiendo del número de piezas obtenidas después de la disección (25 μL de solución de TA se utiliza para cada uno Gel de FT/fibrin) y una cantidad adicional (por ejemplo, 250 μL) para probar la formación del gel de fibrina y asegurar que suficiente solución está disponible a través de la fundición de las gotas de gel de fibrina.
   Nota: La trombina es necesaria para la polimerización de la fibrina mientras que la aprotinina se añade para prevenir la degradación del gel de fibrina por proteasas celulares expresadas por los FTs^13,14.
4. Probar el tiempo de formación de gel de fibrina: Añadir 25 μL de solución de TA para la solución de fibrinógeno alícuotas de 25 μL preparada en el paso 3.2, con otra pipeta a 50 μL, se mezclan y en el tubo mediante pipeteo dispensar en una placa de cultivo celular de 6 cm , formando una gota vertical.
   Nota: La formación del gel de fibrina debe ocurrir en ~ 1 min. Si esto toma más 1,5 min, la concentración de trombina en la solución de TA preparada en el paso 3.3 puede incrementarse mediante la adición de solución stock de más trombina. Una décima parte del volumen inicialmente utilizado de solución stock de trombina se puede Agregar, repetidas veces, hasta la formación del gel de fibrina se produce dentro de 1,5 minutos. El tiempo de formación de gel de fibrina es crítico para las tres dimensión de la cultura, como gel de rápida formación (en 1,5 minutos) impide que la pieza de pies de hundimiento en la parte inferior del gel de fibrina y así entre en contacto con la superficie de plástico 2D de la célula placa de cultivo, que puede conducir a la adhesión celular 2D y consecuencia.
5. Colocar pies una pieza en el centro de un pozo de una placa de 24 pocillos usando una pinza estéril y retire cualquier exceso PBS mediante pipeteo con una pipeta de 0.5-10 μL para evitar la fuerza de succión en los pies. En el caso que el tejido se pega a la pinza, utilice una pinza adicional para facilitar la colocación de la pieza de tejido en la placa.
   Nota: Geles FT/fibrina también pueden lanzarse en placa de 48 pozos para reducir el uso de reactivos. Sin embargo, esto es más difícil ya que el espacio es más limitado y fibrina se extenderá si entra en contacto con la pared bien.
6. Añadir 25 μL de solución de TA a la solución de fibrinógeno μL 25 alícuotas en el paso 3.2, y con otra pipeta establece en 50 μL mezcla en el tubo de pipeteo. Dispensar en el pedazo de pies colocado en la placa bien y pipeta arriba y abajo 2 - 3 veces para incluir el pedazo de pies dentro de la gota vertical, proporcionando una 3D matriz circundante hasta los pies.
   Nota: Asegúrese de que el FT no es aspirado durante el pipeteo y que no se forman burbujas de aire. Asegúrese también de que mezcla, dispensación y uso se realizan rápidamente como se forma el gel de fibrina dentro de 1,5 min, ya probado en el paso 3.4. Si casting geles de fibrina en la placa de 48 pozos, utilice 20 μL de solución de fibrinógeno y 20 μL de solución de TA.
7. Repita los pasos del 3.5 y 3.6 para todas las piezas de los pies.
8. Permita que los geles de fibrina solidificar por incubar las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO₂.
9. Después de 0.5-1 h, compruebe que el gel de fibrina está formado totalmente por cuidadosamente inclinando la placa. Proceda al paso 3.10 cuando el gel no se mueve como se inclina la placa, lo que indica que la formación del gel de fibrina es completa.
10. Sobreponer los geles FT/fibrina con ex vivo de medio de cultivo (600 μL/pocillo en placa de 24 pocillos) o 300 μL/pocillo en placa de 48 pozos con 100 μg/mL aprotinina. Pipetee suavemente el medio de dispensación drop-wise.
    Nota: Aquí, la aprotinina se utiliza para prevenir la degradación del gel de fibrina por proteasas celulares expresadas por los FTs^13,14. El ex vivo medio de cultivo Además pueden complementarse con factores de crecimiento recombinantes, como la VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (véase Tabla de materiales)¹¹.
11. Coloque FT ex vivo placa de cultivo a 37 ° C, 5% CO₂ célula cultura la incubadora y la cultura para el período de tiempo deseado (por ejemplo, 2 - 18 días, más cultura períodos tendrá que ser probado). Reemplazar el 50% de la media con la dulce ex vivo medio de cultivo cada tres días.

4. "en matriz" proyección de imagen de

1. Adquirir imágenes del FT ex vivo de culturas en el mismo día (día 0) y en intervalos fijos (por ejemplo, cada dos días), utilizando un microscopio de epifluorescencia invertida, para seguir el crecimiento del 3D.
   Nota: Las imágenes obtenidas pueden utilizarse para la cuantificación de la consecuencia FT como la longitud total de dos diámetros perpendiculares en el explante¹¹.

5. FT nativo y punto final de cultivo Ex Vivo

Nota: Los geles de fibrina/FT pueden ser cultivados ex vivo para el período de tiempo deseado (FT ex vivo culturas) o fijo en el mismo día (nativo FT) nativo de caracterización FT¹¹.

1. Fijar el FT nativo o el FT ex vivo culturas mediante la sustitución del medio de cultivo con 1 mL/pozo de paraformaldehído al 4% en solución de PBS, por 1 h a TA. Para los geles nativos de FT/fibrina, fijar 0.5-1 h después de la adición del ex de vivo la cultura medio (si los geles de fibrina no han estado en remojo en medio, la fijación dañarlas).
   Nota: Realice este paso en campana como paraformaldehido es corrosivo, tóxico y cancerígeno.
2. Enjuague los geles de fibrina/FT con tres lavados de 5 minutos en PBS (2 mL/pocillo).
3. Vuelva a colocar el PBS con 2 mL/de PBS con azida sódica al 0.02% y guardar los geles de fibrina fija a 4 ° C hasta el procesamiento posterior. Sellar las placas con la película de parafina para asegurarse de que los geles de fibrina/FT no sequen en almacenamiento de información.
   Nota: Realice este paso en campana como la azida sódica es tóxica.

6. tinción de inmunofluorescencia whole-Mount

Nota: Este protocolo dura 5 días y puede ser interrumpido con incubaciones de noche donde se indica. No deje que la fibrina geles secos en cualquier momento. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Preparar las siguientes soluciones antes de iniciar el protocolo de tinción.
   1. Posteriores a la fijación solución: preparar 50: 50 acetona: metanol solución mezclando cantidades iguales de acetona y metanol (p. ej., 50 mL). Almacenar a-20 ° C. Preparar esta solución última en el día antes de la tinción. Esta solución puede conservarse a-20 ° C y utilizarse para stainings posterior.
      Nota: Preparar esta solución en campana como acetona y metanol son inflamables y peligrosos para la salud.
   2. Solución de bloqueo: preparar un 15% suero bovino fetal (FBS), 0.3% octil fenol etoxilado solución en PBS por primera agregar 15% FBS a PBS. Agregar octil fenol etoxilado y revolver hasta para disolver. Almacenar a 4 ° C.
      Nota: Esta solución puede prepararse en gran cantidad por adelantado, almacenados en aliquotes de 15 mL a-20 ° C y descongelar antes de su uso, en el día cuando se inicia el protocolo de tinción. Utilice un recién preparado o recién descongelado alícuotas para cada protocolo de tinción.
   3. Solución de lavado: preparar 1 L de PBS suplementado con 0.45% octil fenol etoxilado al agregar 4,5 mL de octil fenol etoxilado a 995,5 mL de PBS. Remover para disolver. Tienda a TA.
2. Levante las gotitas cuidadosamente de la placa con una espátula de acero inoxidable con bordes cuadrados. Separar primero la gota de los bordes antes de levantar el centro y transferir a un pozo de placa de 12 pozos que contienen 1 mL de PBS.
   Nota: Realizar la fijación, lavados y pasos bloqueo en este formato de placa.
3. -Fijar las gotitas con 1 mL de solución de helado de 50: 50 acetona: metanol para ~ 1 min (la frontera de las gotitas se convertirá blanco).
   Nota: Realice este paso en campana como acetona y metanol son peligrosas para la salud.
4. Enjuague con lavado de 3-5 en 2 mL de PBS (las gotas se hundirán en la solución de PBS cuando la rehidratación es completa).
   Nota: Evite tocar las gotas con la punta de la pipeta como, después de la fijación, son pegajosos al plástico. A lo largo del Protocolo, evitar aspiración post fix, anticuerpo, bloqueo y soluciones de lavado por succión, como esto puede dañar o destruir completamente las gotas. En cambio, la inclinación de la placa y retire cuidadosamente con una pipeta de 500-5.000 μL de soluciones.
5. Centrifugue la solución de bloqueo durante 15 min a 21.000 x g y 4 ° C para eliminar la suciedad.
   Nota: La solución puede ser alícuotas en tubos de 1,5 mL para centrifugación. La solución no utilizada puede ser almacenada a 4 ° C y utilizada para todos los pasos posteriores pertinentes.
6. Incubar las gotas de 500 μL bloqueando la solución por 2 h a TA.
   Nota: Para reducir el volumen de solución de bloqueo, la placa puede inclinarse sobre un soporte y puede ser utilizado lo menos 300 μL de solución/gotas.
7. Preparar la mezcla de anticuerpo primario (menos de 30 μL/gota) en dilución en el bloqueo de solución y centrifugar durante 15 min a 21.000 x g a 4 ° C.
8. Transferencia de las gotas en redonda (U)-placa de 96 pocillos de fondo usando una espátula de borde redondo e incubar con al menos 30 μL/gota de la mezcla del anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
9. Transferencia de las gotas en 12-bien la placa que contiene 2 mL de solución/bien, se lava, al día siguiente enjuague con tres 5 min lava primero y después con nueve 30 min lavados. Deje el último lavado (2 mL) durante la noche a 4 ° C.
10. Al día siguiente, enjuague tres veces con PBS y transferencia de las gotas en redonda (U)-placa de 96 pocillos de fondo.
11. Durante los lavados, preparar la mezcla de anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo apropiado (diluido 1: 500, por lo menos 30 μL/gota) en el bloqueo de solución y centrifugar durante 15 min a 21.000 x g a 4 ° C.
12. Transferencia de las gotas en una ronda (U)-placa de 96 pocillos de fondo usando una espátula de borde redondo e incubar con al menos 30 μL de la mezcla del anticuerpo secundario, durante 4 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
    Nota: Realice todas las incubaciones posteriores y pasos de lavado protegidos de la luz.
13. Transferencia de las gotas en la placa de 12 pozos que contienen 2 mL de lavado solución/pozo usando una espátula de borde redondo, enjuague con tres lavados de 5 minutos primero y luego con cuatro lavados de 30 minutos. Deje el último lavado (2 mL) durante la noche a 4 ° C.
14. Al día siguiente, enjuague los geles con cinco lavados de 30 min y luego tres veces con PBS. Deje el último lavado (2 mL) durante la noche a 4 ° C.
15. Al día siguiente, transferir las gotitas en una ronda (U)-placa de 96 pocillos de fondo mediante el uso de un núcleos de espátula y contratinción redondo-afilado por incubar con 10 μg/mL Hoechst tinción nuclear (al menos 30 μL/gota) durante 30 minutos a TA.
    Nota: Montaje suplementado con 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para núcleos contratinción puede alternativamente utilizarse. En cuyo caso, se saltan este paso y paso 6.16, proceder directamente al paso 6.17.
16. Transferencia de las gotas en la placa de 12 pozos que contienen 2 mL de PBS/bien con una espátula con borde redondo y enjuagar tres veces con PBS.
17. Monte las gotitas sobre portaobjetos como sigue:
    1. Aplicar una capa estrecha de medio de montaje rápido endurecimiento en los bordes de un cubreobjetos cuadrado 22 x 22 mm y deje secar por ~ 1 minuto. Realizar este paso para cada gota individualmente, para evitar el excesivo endurecimiento del medio de montaje.
       Nota: Realice este paso en campana como el endurecimiento rápido montaje medio es peligroso para la salud.
    2. Enjuague la gota sumergiendo en un pozo de una placa de 12 pozos que contiene 2 mL de agua desionizada y transferir a un portaobjetos de microscopio, utilizando una espátula de borde redondo. Usando un pequeño pedazo de papel absorbente para quitar exceso de agua.
    3. Dispensar 15 μL de medio de montaje antifade no se endurezca en la gota.
       Nota: Alternativamente, si no ha utilizado tinción nuclear de Hoechst, que contiene 4', medio de montaje 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) puede utilizarse.
    4. Suavemente Coloque el vidrio de cubierta, con el medio de montaje rápido-endureciendo frente a la diapositiva microscópica, sobre la gota y deje instalarse.
       Nota: El medio de endurecimiento rápido del palillo a la diapositiva microscópica y mantenga la gota en su lugar.
18. Repita el paso 6.17 gotitas todas. Monte dos gotitas en cada portaobjetos.
19. Deje que los portaobjetos secar al aire a temperatura ambiente durante 2 h y almacenar a 4 ° C durante la noche. Asegúrese de que las diapositivas son en posición horizontal y protegidas de la luz.
20. Imagen natural teñido o punto final FT ex vivo culturas utilizando un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una función seccionamiento óptica 20 x y objetivo 40 x. Utilice la función de azulejo para capturar un área del tejido a la vez.

Resultados

Comprensión más profunda de las propiedades del tejido fibrovascular de PDR y expresión de la proteína se ha basado principalmente en muestras de vítreas y finas histológicas FT secciones^3,15,16,17. Para desarrollar un método para la investigación exhaustiva de la organización de tejido 3D y pluricelulares procesos fisiopatológicos de la RDP, nos propu...

Discusión

Considerando la importancia del microambiente del tejido relevante para celular funcional confiable y resultados mecanismos moleculares, es imperativo encontrar modelos experimentales apropiados que proporcionan el ambiente de este tejido. El PDR aquí descrito ex vivo cultura modelo de la FTs de fibrina incrustado permite la investigación de los mecanismos de la patofisiología PDR en el contexto nativo, complejo y pluricelular de las muestras clínicas del PDR.

Pasos críticos en e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Microforceps	Medicon	07.60.03	Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile	Swann-Morton	0513	Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)	Greiner Bio-One	391-3210	Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well	Greiner Bio-One	392-0049	Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL	Greiner Bio-One	391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL	Greiner Bio-One	525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF	Millipore	SLGV033RS	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL	Braun	4606108V	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Fisher	FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well	Nunc	142475	Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Used for mounting
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Calbiochem	341578
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9394-500ML	Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	Used for preparing the blocking solution
Human Serum	Sigma-Aldrich	H4522	Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml	Biowest	L0011-100
Endothelial cell media MV Kit	Promocell	C-22120	Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	T9549-500UN	Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder	Sigma	A3428	Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	Used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope	Zeiss		For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope	Olympus		For FT dissection
LSM 780 confocal microscope	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT