Un modèle de Culture tissulaire Ex Vivo pour fibrovasculaire Complications dans la rétinopathie diabétique proliférante

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier la physiopathologie de la rétinopathie diabétique proliférante en utilisant les tissus dérivés de patient, excisées chirurgicalement, fibrovasculaire pour tridimensionnelle native caractérisation et ex vivo vitroplants. Cela ex vivo modèle de culture est également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.

Résumé

Rétinopathie diabétique (RD) est la complication la plus fréquente microvasculaire du diabète et une des principales causes de cécité chez les adultes en âge de travailler. Aucun cours modèles animaux de diabète et de la rétinopathie induite par l’oxygène ne développent les gamme complète des changements progressifs manifestées dans la rétinopathie diabétique proliférative humaine (PDR). Par conséquent, la compréhension de la pathogenèse de la maladie et la physiopathologie s’est appuyé en grande partie sur l’utilisation de coupes histologiques et vitreux échantillons dans les approches qui seulement stationnaire renseignent sur les facteurs pathogènes impliqués. Augmentant la preuve indique que les cellules dynamiques et interactions cellule-extracellulaire (ECM) dans le cadre des trois dimensions (3D) micro-environnements sont essentielles pour les études mécanistiques et fonctionnels vers le développement de nouveau stratégies de traitement. Par conséquent, nous avons supposé que le tissu fibrovasculaire pathologique excisé chirurgicalement des yeux avec les PDR pourrait servir à démêler avec fiabilité les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette maladie dévastatrice et de tester le potentiel de roman clinique interventions. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode pour la 3D ex vivo culture d’excisées chirurgicalement dérivé de patient fibrovasculaire tissulaire (FT), qui servira comme un modèle pertinent de physiopathologie humaine de PDR. Les FTs sont disséqués dans les explants et incorporées dans la matrice de fibrine pour ex vivo characterization de culture et de la 3D. Immunofluorescence entier-montent des FTs natives et des cultures de point final permet une enquête approfondie de la composition du tissu et des processus multicellulaires, soulignant l’importance de la caractérisation au niveau du tissu 3D pour découvrir les caractéristiques pertinentes des Physiopathologie de la RDP. Ce modèle permettra l’évaluation simultanée des mécanismes moléculaires, les processus cellulaire/tissulaire et les réactions aux traitements dans le cadre complex des interactions biochimiques et physiques dynamiques au sein de l’architecture de tissu PDR et le microenvironnement. Étant donné que ce modèle reprend la physiopathologie de la RDP, il sera également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.

Introduction

DR est une complication oculaire grave de diabète, une maladie qui a atteint des proportions énormes dans les dernières trois décennies¹. Vingt ans après que le diagnostic, pratiquement tous les patients atteints de diabète de type 1 et 60 % des patients avec type 2 diabète présente des signes de rétinopathie, rendant le diabète en soi l’un des principaux causes de cécité dans le travail des adultes d’âge². Selon le degré de dégénérescence microvasculaire et dommages ischémiques, DR est classé dans non-Proliférante (non-PDR) et DR proliférative (PDR). La maladie terminale, Lao, se caractérise par une néovascularisation induite par l’ischémie et l’inflammation et réponses fibreux à l’interface vitréo-rétinienne. Dans des conditions non traitées, ces processus conduira à la cécité due à l’hémorragie vitréenne, rétinienne fibrose, décollement de rétine Tractionnel et néovasculaire glaucome^3,4. Malgré des progrès récents, les options thérapeutiques actuelles ciblent uniquement DR stades, y compris le œdème maculaire diabétique et PDR, lorsque les dommages rétiniens a déjà s’ensuivit. En outre, une grande proportion des patients du DR ne bénéficie pas actuel arsenal thérapeutique, ce qui indique un besoin urgent de traitements améliorés^4,5,6.

Plusieurs autres jen vivo maladie/développement modèles et modèles animaux diabétiques ont été développés à ce jour, mais aucun d’eux ne récapitule l’ensemble des caractéristiques pathologiques observées dans humain RDP^7,8. En outre, augmentant la preuve indique que les réactions aux traitements sont correctement raccordées à la composition de l’ECM ainsi que l’arrangement spatial et l’interaction entre le microenvironnement cellulaire et acellulaire⁹. Nous avons, par conséquent, entrepris d’élaborer un modèle cliniquement pertinent de RDP humain en utilisant le matériel pathologique FT qui est communément excisé d’yeux subissant la vitrectomie dans le cadre de la prise en charge chirurgicale des PDR¹⁰.

Ce manuscrit a décrit le protocole pour la 3D ex vivo culture et caractérisation de la chirurgicalement-excisés, PDR patient-dérivés FT pathologique. La méthode décrite ici a été utilisée dans une publication récente qui a démontré le succès déconstruction du paysage tissu PDR 3D native et récapitulation des éléments de physiopathologie PDR y compris angiogénique et réponses fibreuses de l’anormal ¹¹de structures vasculaires. Ce modèle a également révélé caractéristiques nouvelles qui ne peuvent pas être facilement appréciés de fines coupes histologiques, tels que dans l’espace confiné l’apoptose et la prolifération comme îlot vasculaire formation¹¹. Fluide vitreux a été utilisé avec succès par d’autres sur les cultures de sphéroïde endothéliales 3D pour évaluer son potentiel angiogénique et l’efficacité des molécules d’angiostatique¹². Lorsqu’il est combiné avec un sphéroïde 3D cellules endothéliales lymphatiques (LEC) in vitro test à l’aide de corps vitré PDR comme stimulant la germination, notre modèle a révélé que la contribution de ces deux Vitréennes soluble des facteurs aussi bien en tant que locales repères dans le tissu néovasculaire à la comme encore mal compris ESL participation aux PDR physiopathologie^3,11. Dans la gestion de RDP, chirurgie vitréo-rétinienne est une procédure régulièrement effectuée pourtant difficile. Comme techniques et instrumentations chirurgicales voient avancement continu et sophistication, opportune et prudente enlèvement de spécimen proliférative fibrovasculaire non seulement améliore l’issue de la vision, mais renferme aussi des documents de tissus précieux pour le enquête de PDR pathophysiologie et traitement réponses chez les aspects complexes et translationnelles du microenvironnement des tissus humains vivants.

Protocole

Cette recherche a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire de Helsinki. Le consentement éclairé signé a été obtenu chez chaque patient.

1. préparation des Solutions, des médias et des équipements

1. Préparer le matériel suivant avant le prélèvement du tissu fibrovasculaire (FT) pour assurer un traitement rapide.
   1. Pincettes de microdissection stérile-autoclave deux.
   2. Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dissoudre 1 comprimé de PBS pré-pesés (0,14 M NaCl, KCl, M 0,010 PO₄^-3de 0,0027 M) dans 900 mL d’eau désionisée et mélanger pour dissoudre. Ajuster le volume d’eau jusqu'à 1 L et stérile-autoclave la solution prêt. Magasin à température ambiante.
   3. Rassembler les solution mentionnée ci-dessus et les équipements dans un panier, avec un scalpel stérile à usage unique, une boîte de Petri stérile cellule de 6 cm et cinq plaques de culture de cellules de 12 puits stériles.
2. Préparer un 6 mg/mL solution de fibrinogène dans Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) en dissolvant 30 mg de fibrinogène humain appauvris en plasminogène dans 5 mL de HBSS, à l’aide d’un tube de 50 mL, plongé dans un bain d’eau à 37 ° C, pendant au moins 1 h.
   NOTE : Cette solution peut être conservée dans le bain d’eau (37 ° C) pendant 7 h (maximum 10 h) avant l’utilisation.
3. Préparer l’ex vivo milieu de culture en ajoutant 5 % de sérum de veau foetal (FCS) ou 5 % de sérum humain, supplément de croissance des cellules endothéliales 0,4 %, 10 ng/mL recombinant humain facteur de croissance épidermique, 1 hydrocortisone μg/mL et 50 μg/mL gentamicine à disponibles dans le commerce milieu de culture de cellules endothéliales et gardez au bain-marie à 37 ° C jusqu'à l’utilisation. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.

2. la Dissection des tissus fibrovasculaire

1. Recueillir le tissu fibrovasculaire (FT) qui ont été retirée des sujets humains en cours de chirurgie vitréo-rétinienne de micro-incision trans-conjonctivale, par 23 20 jauge trois ports pars plana vitrectomie ou dans le cadre de la gestion de chirurgie vitréo-rétinienne de RDP.
   Remarque : Le FT est excisé à l’aide de la segmentation et le délaminage, couper si nécessaire avec microciseaux et retirée de la cavité vitréenne avec intraoculaire micropinces fin-préhension par chirurgien expérimenté vitréo-rétinienne. Un soin extrême doit être pris pour retirer intact et non-endommagé FT sans endommager les structures oculaires y compris le nerf optique ou temporelle arcade vasculaire où se trouve plus souvent le tissu pathologique néovasculaire. La taille des tissus excisés est variable, généralement compris entre 3 et 50 mm².
2. Garder le pieds dans une boîte de Petri de cellule 6 cm ou un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBS stérile placée sur la glace humide et de le transférer immédiatement à la recherche de laboratoire pour le traitement.
   Remarque : Il est essentiel que l’unité de recherche (laboratoires) est physiquement à proximité de la salle d’opération de l’hôpital (OR) pour minimiser les temps de transfert de la petite FT excisé. Dans ce cas, le transfert prend moins de 5 minutes et les explants sont incorporées dans la fibrine habituellement en 1 à 1,5 h (maximum 2 h) après l’ablation chirurgicale. L’impact du temps de transfert plus long sur la culture 3D devront être testés.
3. Placez le pieds dans une boîte de Petri de 6 cm cellule contenant 1 mL de PBS à température ambiante (RT, 25 ° C) et acquisition d’images du tissu à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversé avec un objectif 5 x.
   Remarque : Les Images sont acquises pour la documentation et l’évaluation qualitative. Il sera possible d’observer la taille des tissus, la densité et la composition générale (p. ex., les structures vasculaires).
4. Couper le FT en ~ 1 mm² morceaux sous un stéréomicroscope de dissection verticale, à l’aide d’une pince à épiler bistouri et microdissection stérile. Maintenez le tissu, bien immergé dans du PBS, à l’aide d’une pince de microdissection et effectuer les coupes à blanc à l’aide d’un scalpel stérile. Éviter la déchirure FT, car cela altérerait les structures fibrovasculaire natives.
5. Placer chaque pièce dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 12 puits contenant 1 mL de PBS stérile.
   Remarque : Si nécessaire, délicatement étalées le FT sur la plaque, à l’aide de pincettes microdissection, avant d’exécuter des coupes.

3. coulée verticale fibrine Gel gouttelettes pour la caractérisation des FT Native et de la Culture de l’Ex Vivo

1. Stérile-filtrer la solution de fibrinogène prêt, préparée à l’étape 1.2 avec filtre 0,22 μm monté dans une seringue de 10 mL.
2. Préparer des aliquotes de, solution de fibrinogène (25 μL / tube 1,5 mL) et à RT. Prepare une partie aliquote de fibrine gel / chaque pièce FT obtenue après la dissection, et un couple d’aliquotes supplémentaires pour tester la fibrine gel formation.
3. Préparer une solution de HBSS contenant 4 unités/mL de thrombine et 400 μg/mL d’aprotinine, appelé ci-après TA solution et la garder au RT. Prepare autant solution TA selon les besoins, en fonction du nombre de pièces obtenues après dissection (25 μL de TA solution est utilisée pour chacun Gel de FT/fibrin) et un montant supplémentaire (par exemple, 250 μL) pour tester la formation de gel de fibrine et de veiller à ce que suffisamment de solution est disponible tout au long de la coulée des gouttelettes gel de fibrine.
   Remarque : Thrombine est nécessaire pour la polymérisation de la fibrine tandis que l’aprotinine est ajouté pour prévenir la dégradation de la fibrine gel par des protéases cellulaires exprimées par la FTs^13,14.
4. Tester le calendrier de formation de gel de fibrine : ajouter 25 μL de solution TA à la solution de fibrinogène 25 μL aliquotés préparée à l’étape 3.2 et, à l’aide d’une autre pipette la valeur 50 μL, mélanger dans le tube de pipetage et diluer dans une boîte de Petri de cellule de 6 cm , formant des gouttelettes d’un diamètre vertical.
   Remarque : La formation de gel de fibrine interviendrait dans ~ 1 min. Si cela prend plus de 1,5 min, la concentration de la thrombine dans la solution de TA préparée à l’étape 3.3 peut être augmentée en ajoutant plus solution mère de thrombine. Un dixième du volume de solution mère de thrombine initialement utilisé peuvent être ajouté, à plusieurs reprises, jusqu'à ce que la formation de gel de fibrine se produit moins de 1,5 min. Le temps de formation de gel de fibrine est critique pour les trois dimensions de la culture, comme gel rapide empêche la pièce de FT de couler au fond du gel de fibrine et donc entrer en contact avec la surface en plastique 2D de la cellule de formation (à moins de 1,5 minutes) plaque de culture, qui peut conduire à l’adhésion cellulaire 2D et une excroissance.
5. Placez des FT un morceau au centre d’un puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pince stérile et enlever tout excès PBS en pipettant également, avec une pipette μL de 0,5 à 10 afin d’éviter la force d’aspiration sur le central de FT. Dans le cas que le tissu colle à la pince à épiler, utilisez une pince supplémentaire pour faciliter le placement de la pièce de tissu sur la plaque.
   Remarque : Les gels de FT/fibrine peuvent également s’exprimer sur plaque 48 puits à réduire l’utilisation de réactifs. Cependant, c’est plus difficile car l’espace est plus restreint et fibrine se propage si elle entre en contact avec la paroi du puits.
6. Ajouter 25 μL de TA solution à la solution de fibrinogène 25 μL aliquotés à l’étape 3.2, et 50 μL de mélange dans le tube à l’aide de la pipette une autre valeur par pipetage. Répartir sur la pièce de pieds bien placée sur la plaque, et pipette de haut en bas de 2 - 3 fois afin d’y inclure la pièce FT dans la goutte verticale, en fournissant une matrice 3D environnante de la pi.
   Remarque : Veiller à ce que la PI n’est pas aspiré pendant le pipetage et qu’aucune bulle d’air ne se forment. S’assurer également que le mélange, la dispensation et pipetage sont effectuées rapidement comme le gel de fibrine formeront dans 1,5 min, qu’il est testé à l’étape 3.4. Si le casting des gels de fibrine sur plaque 48 puits, utilisez plutôt 20 μL de solution de fibrinogène et 20 μL de TA solution.
7. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour toutes les pièces FT.
8. Laissez les gels de fibrine se solidifier en incubant les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C en atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂.
9. Après 0,5 à 1 h, vérifier que le gel de fibrine est complètement formé par soigneusement l’inclinaison de la plaque. Passez à l’étape 3.10 quand le gel ne bouge pas lorsque la plaque est inclinée, ce qui indique que la formation de gel de fibrine est terminée.
10. Superposer les gels FT/fibrine avec ex vivo milieu de culture (600 μL/puits en plaque 24 puits) ou 300 μL/puits en plaque 48 puits additionnés de 100 μg/mL aprotinine. Pipetter doucement le milieu par goutte-à-goutte dispensation.
    NOTE : Ici, aprotinine sert à prévenir la dégradation de la fibrine gel par des protéases cellulaires exprimées par la FTs^13,14. L’ex vivo, milieu de culture peut en outre être complété avec des facteurs de croissance recombinants, tels que VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (voir Table des matières)¹¹.
11. Replacez le FT ex vivo plaque de culture dans les 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de₂ cellules et de la culture pour la période souhaitée (par exemple, 2 - 18 jours, la culture plus longue périodes devront être testés). Remplacez 50 % de la moyenne avec frais ex vivo milieu de culture tous les trois jours.

4. « dans la matrice » imagerie

1. Acquisition d’images de la FT ex vivo cultures sur le même jour (jour 0) et à intervalles réguliers (par exemple, tous les deux jours), en utilisant un microscope à épifluorescence inversé, pour suivre la croissance de 3D.
   Remarque : Les images obtenues peuvent être utilisés pour la quantification de l’excroissance FT, comme la longueur totale des deux diamètres perpendiculaires à travers l' explant¹¹.

5. native FT et Ex Vivo Culture point final

Remarque : Les gels FT/fibrine peuvent être cultivées ex vivo pour la période souhaitée (FT ex vivo cultures) ou fixés sur le même jour (native FT) pour native FT caractérisation¹¹.

1. Difficulté de la FT natif ou le FT ex vivo cultures en remplaçant le milieu de culture avec 1 mL/puits de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution de PBS, pendant 1 h à température ambiante. Pour les gels natifs de FT/fibrine, difficulté à 0,5 ou 1 h après l’addition de l’ex vivo culture moyen (si les gels de fibrine n’ont pas été imbibés dans le milieu, fixation les endommagera).
   Remarque : Exécutez cette étape sous hotte paraformaldéhyde étant corrosives, toxiques et cancérigènes.
2. Rincer les gels FT/fibrine avec trois lavages 5 min dans du PBS (2 mL/puits).
3. Remplacer le PBS avec 2 mL/puits de PBS contenant 0,02 % d’azide de sodium et de stocker les gels de fibrine fixe à 4 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure. Sceller les plaques avec du film de paraffine pour s’assurer que les gels FT/fibrine ne séchez pas en stock.
   Remarque : Exécutez cette étape sous hotte comme l’azoture de sodium est toxique.

6. ensemble-Mont Immunofluorescence souillant

Remarque : Ce protocole dure 5 jours et peut être interrompu par des incubations durant la nuit lorsque indiqué. Ne laissez pas la fibrine gels sécher à tout moment. Toutes les mesures sont effectuées à la RT, sauf indication contraire.

1. Préparer les solutions suivantes avant de commencer le protocole de coloration.
   1. Après fixation solution : préparer la solution de l’acétone : méthanol à 50/50 en mélangeant des quantités égales d’acétone et de méthanol (p. ex., 50 mL). Conserver à-20 ° C. Préparer cette solution plus tard le jour avant la coloration. Cette solution peut être stockée à-20 ° C et être utilisée pour les salissures.
      NOTE : Préparer cette solution sous hotte comme l’acétone et le méthanol sont inflammables et dangereux pour la santé.
   2. Bloquant la solution : préparer un 15 % foetale de sérum bovin (FBS), 0,3 % octyl phénol éthoxylate solution dans du PBS par premier ajout 15 % FBS à PBS. Ajouter octyl phénol éthoxylate et mélanger pour dissoudre. Conserver à 4 ° C.
      NOTE : Cette solution peut être préparée en grande quantité à l’avance, stockés en aliquotes de 15 mL à-20 ° C et décongelés avant utilisation, le jour où le protocole de coloration est démarré. Utilisez un Intervento fraîchement préparé ou fraîchement décongelée pour chaque protocole de coloration.
   3. Solution de lavage : préparer 1 L de PBS additionné de 0,45 % octyl phénol éthoxylate en ajoutant 4,5 mL d’octyle phénol éthoxylate à 995,5 mL de PBS. Mélanger pour dissoudre. Magasin à température ambiante.
2. Soulevez les gouttelettes délicatement de la plaque à l’aide d’une spatule de bout carré en acier inoxydable. Détacher la goutte tout d’abord les bords avant de soulever le centre et transférer dans un puits de la plaque de 12 puits contenant 1 mL de PBS.
   Remarque : Effectuez après fixation, les lavages et les mesures de blocage dans ce format de plaque.
3. Fixer les gouttes avec 1 mL de solution d’acétone : méthanol glacée 50/50 ~ 1 min (la frontière des gouttelettes tournera blanche).
   Remarque : Exécutez cette étape sous hotte comme l’acétone et le méthanol sont dangereux pour la santé.
4. Rincer avec 3 à 5 lavages dans 2 mL de PBS (les gouttelettes vont couler dans la solution de PBS lorsque la réhydratation est terminée).
   Remarque : Ne pas toucher les gouttelettes avec l’embout de la pipette comme, après après fixation, elles sont collantes au plastique. Dans tout le protocole, éviter l’aspiration après correction, anticorps, blocage et solutions de lavage par aspiration, car cela peut endommager ou détruire complètement les gouttelettes. Au lieu de cela, inclinaison de la plaque et retirer délicatement à l’aide d’une pipette de 500-5 000 μL des solutions.
5. Centrifuger la solution de saturation à 21 000 x g et 4 ° C pendant 15 minutes afin d’enlever les débris.
   Remarque : La solution peut être aliquotée dans des tubes de 1,5 mL pour la centrifugation. La solution inutilisée peut être conservée à 4 ° C et utilisée pour toutes les étapes ultérieures pertinentes.
6. Incuber les gouttelettes en suspension dans 500 μL bloquant la solution pendant 2 h à température ambiante.
   Remarque : Pour réduire le volume de bloquant la solution utilisée, la plaque peut être inclinée sur un support et aussi peu que 300 μL de solution/gouttelettes peut être utilisé.
7. Préparer le mélange d’anticorps primaire (au moins 30 μL/goutte) à dilution appropriée en bloquant la solution et centrifuger pendant 15 minutes à 21 000 x g et 4 ° C.
8. Transférer les gouttelettes en rond (U)-fond de plaque 96 puits à l’aide d’une spatule à bordure ronde et incuber au moins 30 μL/goutte du mélange anticorps primaire durant la nuit à 4 ° C.
9. Le lendemain, transfert les gouttelettes dans 12-puit sur plaque contenant 2 mL de solution/puits, de lavage, rinçage avec trois 5 min lave premier puis avec neuf 30 min lavages. Laisser le dernier lavage (2 mL) une nuit à 4 ° C.
10. Le lendemain, rincer trois fois avec du PBS et transférer les gouttelettes en rond (U)-fond de plaque à 96 puits.
11. Pendant les lavages, préparer le mélange de l’anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié (dilué 1/500, au moins 30 μL/goutte) en bloquant la solution et centrifuger pendant 15 minutes à 21 000 x g et 4 ° C.
12. Transférer les gouttelettes dans un rond (U)-bas plaque 96 puits à l’aide d’une spatule à bordure ronde et incuber au moins 30 μL du mélange anticorps secondaire, de 4 h à RT, abri de la lumière.
    Remarque : Effectuez toutes les incubations ultérieures et des étapes de lavage abri de la lumière.
13. Transférer les gouttelettes dans la plaque de 12 puits contenant 2 mL de lavage solution/puits avec une spatule à bordure ronde, rinçage avec trois lavages de 5 min tout d’abord, puis avec quatre lavages de 30 min. Laisser le dernier lavage (2 mL) une nuit à 4 ° C.
14. Le lendemain, rincez les gels avec cinq lavages de 30 min et puis trois fois avec du PBS. Laisser le dernier lavage (2 mL) une nuit à 4 ° C.
15. Le lendemain, transvaser les gouttelettes dans un tour (U)-fond de plaque 96 puits à l’aide d’un noyaux de spatule et contre-colorant tranchant ronde en incubant 10 μg/ml Hoechst nucléaire tache (au moins 30 μL/goutte) pendant 30 minutes à température ambiante.
    Remarque : Montage additionné de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour les noyaux contre-coloration peut aussi être utilisé. Dans ce cas, cette étape et 6.16 sont ignorés, procéder directement à l’étape 6.17.
16. Transférer les gouttelettes dans la plaque de 12 puits contenant 2 mL de PBS/puits à l’aide d’une spatule ronde-tranchant et rincer trois fois avec du PBS.
17. Monter les gouttes tombent sur lame de microscope comme suit :
    1. Appliquer une couche étroite du milieu de montage rapide-durcissement sur les bords d’une lamelle carrée 22 x 22 mm et laisser sécher pendant environ 1 minute. Effectuez cette étape pour chaque goutte individuellement, afin d’éviter un durcissement excessif de la milieu de montage.
       Remarque : Exécutez cette étape sous hotte comme le support de montage rapide-durcissement est dangereux pour la santé.
    2. Rincez la goutte par immersion dans un puits d’une plaque de 12 puits contenant 2 mL d’eau désionisée et transférer sur une lame de microscope, à l’aide d’une spatule ronde-tranchant. Enlevez l’eau excédentaire à l’aide d’un petit morceau de papier absorbant.
    3. Ajouter 15 μL de milieu non durcissante antifade montage sur la goutte.
       NOTE : Sinon, si Hoechst tache nucléaire n’a pas été utilisé, montage milieu contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) peut être utilisé.
    4. Doucement, placez le couvercle en verre, avec le milieu de montage rapide-durcissement face à la lame microscopique, au cours de la goutte et laisser s’installer.
       NOTE : Le milieu de durcissement rapide va coller à la lame microscopique et garder la goutte en place.
18. Répétez l’étape 6.17 pour toutes les gouttelettes. Monter deux gouttes sur chaque lame de microscope.
19. Laissez les lames sécher à l’air à ta pendant environ 2 h et conserver à 4 ° C durant la nuit. S’assurer que les diapositives sont positionnés horizontalement et abri de la lumière.
20. Image le natif taché ou point final FT ex vivo de cultures à l’aide d’un microscope confocal ou un microscope à épifluorescence verticale équipé d’une fonction de sectionnement optique et 20 x ou 40 x, objectif. Fonction de tuile permet de capturer une plus grande surface du tissu à la fois.

Résultats

Meilleure compréhension des propriétés tissu fibrovasculaire PDR et expression de la protéine a compté principalement sur les échantillons vitreux et mince histologique FT sections^3,15,16,17. Pour développer une méthode d’enquête approfondie sur l’organisation du tissu 3D et multicellulaires processus physiopathologiques de RDP, nous partîmes pour ...

Discussion

Compte tenu de l’importance du microenvironnement tissu pertinentes pour cellule fonctionnelle fiable et résultats de mécaniques moléculaires, il est impératif de trouver des modèles expérimentaux appropriés qui fournissent cet environnement tissulaire. Le modèle ci-après décrit ex vivo PDR culture pour les FTs fibrine incorporé permet l’investigation des mécanismes de la physiopathologie de la RDP dans le contexte autochtone, complex et multicellulaire des échantillons cliniques PDR.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Microforceps	Medicon	07.60.03	Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile	Swann-Morton	0513	Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)	Greiner Bio-One	391-3210	Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well	Greiner Bio-One	392-0049	Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL	Greiner Bio-One	391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL	Greiner Bio-One	525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF	Millipore	SLGV033RS	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL	Braun	4606108V	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Fisher	FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well	Nunc	142475	Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Used for mounting
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Calbiochem	341578
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9394-500ML	Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	Used for preparing the blocking solution
Human Serum	Sigma-Aldrich	H4522	Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml	Biowest	L0011-100
Endothelial cell media MV Kit	Promocell	C-22120	Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	T9549-500UN	Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder	Sigma	A3428	Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	Used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope	Zeiss		For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope	Olympus		For FT dissection
LSM 780 confocal microscope	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT