Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)

Resumen

En ajustes clínicos, una biopsia del hígado se utiliza para evaluar estadios de esteatohepatitis no alcohólica (esteatosis, inflamación, hepatocitos en globo y fibrosis). Aquí ilustramos una biopsia del hígado survivable en ratones que se puede utilizar para análisis histológicos para permitir la evaluación de los agentes terapéuticos de forma más alineada con los ensayos clínicos.

Resumen

Ensayos clínicos que evalúan los tratamientos para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) implican una línea de base y final de la biopsia del hígado del estudio y evaluación de la mejora en las terminales de la enfermedad, reflejadas a menudo como un porcentaje de cada brazo de tratamiento que mejoraron, empeoró o permaneció sin cambios. Tradicionales estudios preclínicos de roedores para las supuestas terapias de NASH a menudo están limitados por no saber el nivel de hígado enfermedad/NASH presente en el inicio de la intervención terapéutica, en lugar de asignaron al azar grupos de tratamiento en los extremos fácilmente medibles como peso corporal, estado metabólico o similar. Aquí, describimos una técnica de biopsia del hígado en una inducida por la dieta NASH modelo con ratones, para la evaluación de la enfermedad hepática de base para excluir a los ratones que no presentan fibrosis y distribuir igualmente animales con fibrosis similar entre grupos de tratamiento. Estos niveles luego se pueden comparar con los niveles terminal, después de la intervención para una comprensión más verdadera de efectos farmacológicos in vivo y así más reflejan estrategias de diseño de los ensayos clínicos. El ratón es correctamente anestesiado y preparado para la cirugía con las condiciones de esterilidad. Se hace una pequeña incisión en el abdomen superior y se expone el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Quirúrgico se extrae una cuña del hígado, y una pieza de tamaño similar de gelatina absorbible es poner en su sitio para detener cualquier sangrado. El ratón es quirúrgico suturado y engrapado cerrado y se recuperará a la normalidad dentro de 1 día. Todo el proceso tarda 5-10 min por ratón. Aquí ejemplifican la utilidad de este procedimiento mediante el aprovechamiento de la biopsia pre-estudio para evaluar el impacto de la liraglutida glucagon-como peptide-1 (GLP-1) receptor agonista en extremos de NASH en ratones.

Introducción

Esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado y una forma más grave de la hepatopatía grasa (EHGNA), que se está convirtiendo en cada vez más frecuente debido a su asociación con obesidad y diabetes tipo 2. No hay terapias aprobadas para la EHGNA/NASH o biomarcadores aprobados fácilmente evaluar la progresión de la enfermedad. NASH se diagnostica histológicamente mediante la evaluación de la inflamación, el exceso de lípidos hepática (esteatosis), hepatocitos en globo y fibrosis^1,2,3,4. En los ensayos clínicos, estos extremos son evaluados antes del estudio en una muestra de hígado recogido mediante biopsia y de una segunda biopsia del hígado después de un periodo de tratamiento. Así, se evalúa la efectividad del agente de prueba mediante el cambio en la patología del hígado en sujetos con previamente identificar/cuantificar (es decir, biopsia-probado) NASH que se asignaron al azar a grupos de tratamiento. Estos mismos extremos histologic se utilizan en modelos de roedores evaluar potencial terapéutica de NASH en estudios preclínicos, pero sólo en el tejido terminal de sacrificaron ratones y, por tanto, sin una comprensión del grado de eficacia en la línea de base y la incapacidad de para controlar diferencias en el estado de la enfermedad de base entre los grupos de tratamiento.

Aunque el 25% de adultos con HGNA se presume que NASH basado en niveles de la aminotransferasa sérica elevada, no existen métodos definitivos alternativos para confirmar a NASH que no sean evidencia histológica⁴. Se han desarrollado métodos no invasivos, tales como las modalidades radiológicas (ecografía, tomografía computada y resonancia magnética) para detectar esteatosis hepática, pero estos métodos no pueden diagnosticar a NASH o determinar la etapa de fibrosis. Elastografía transitoria ofrece una modalidad no invasiva prometedora para medir la rigidez hepática. Se ha demostrado ser preciso en distinguir etapas de fibrosis. Sin embargo, la precisión disminuye con mayor índice de masa corporal (IMC) y tejido adiposo. ⁵ esto es problemático debido a la mayoría de los pacientes de NASH siendo obesos. Más allá de la relevancia clínica de estos enfoques, ninguna de estas modalidades se utilizan en estudios preclínicos.

Para superar esto, el grupo de investigación del Dr. Jonathan Roth fueron los primeros en poner en práctica un procedimiento de biopsia del hígado en el modelo de ratón de Amylin NASH (AMLN) de NASH^6,7,8. Describe la validez predictiva de la biopsia con grado de la enfermedad de NASH y correlación con enfermedad metabólica. Aquí describimos en detalle el procedimiento de biopsia del hígado en el modelo AMLN de NASH y su utilidad en un entorno terapéutico, específicamente para evaluar la eficacia de liraglutida.

Protocolo

Todos los experimentos in vivo se realizaron conforme a las políticas de cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) de MedImmune, LLC de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8va edición (2011). Ratones machos C57BL6J se colocaron en la dieta alta en grasas, alta fructosa, colesterol AMLN. Se realizaron biopsias del hígado después de 26 semanas en dieta, 3 semanas antes del inicio de la intervención farmacológica.

1. obtener y preparar materiales quirúrgicos

1. Instrumentos estériles del autoclave (pequeñas puntas punta Tijeras, pinzas de punta Roma, torundas de algodón, cuadrados de gasa, clips 7 mm grapas de la herida y grapadora).
2. Obtener, estériles para suturas para el cierre de pared abdominal (revestido Sutura absorbible 5-0 con una aguja de PC-1 es conveniente), esponja de gelatina absorbible comprimido (para ser utilizados con fines hemostáticos), cortinas estériles y guantes, scrub base de yodo y 70% etanol hisopos/toallitas , buprenorfina (0.05-0.1 mg/kg dosis por ratón, por lo menos 3 dosis al ratón) y ungüento del ojo quirúrgico/lubricación.
3. Preparar relleno con isoflurano vaporizador para la anestesia.
4. Gire en un esterilizador de bolas, para la esterilización rápida del instrumento entre los animales.
5. Girar sobre una superficie de calentamiento o almohada, que se utilizará para la recuperación de animales.
6. Don equipo de protección personal (EPP) (es decir, máscara, vestido, gorro de pelo, guantes).

2. pre-quirúrgicos preparados

1. Coloque el ratón en la cámara de inducción con 2-3% flujo de isoflurano al efecto.
2. Observar el ratón hasta que la falta de respuesta al dedo del pie-pinch confirma que la profundidad de la anestesia es apropiada.
3. Usar ungüento para evitar la sequedad de la córnea asociado con la anestesia.
4. Administrar la buprenorfina por vía subcutánea (0.05-0.1 mg/kg).
5. Afeitar el sitio quirúrgico inmediatamente caudal del proceso xifoides, utilizando podadoras animales.
6. Mueva el ratón a una superficie caliente (37 ° C) después de afeitar el sitio quirúrgico. Coloque el ratón de tal manera que la superficie dorsal es hacia abajo, y el abdomen está expuesto. Introduzca la nariz del ratón en el cono de nariz de anestesia para facilitar entrega de isoflurano en un caudal de 2-3%.
7. Limpiar el sitio quirúrgico con hisopos alternadas de betadine y etanol al 70% (3 veces).
8. Abierto y crear instrumentos quirúrgicos estériles.
9. Quitar guantes y reemplazar con guantes quirúrgicos estériles.

3. quirúrgico

1. Haga una incisión longitudinal con tijeras (1-2 cm), inmediatamente caudales del proceso xifoides y ligeramente al lado izquierdo del ratón, en la piel abdominal.
2. Blunt disecar la piel de la pared abdominal utilizando pinzas y tijeras.
3. Exponer la pared abdominal y visualizar hígado debajo.
4. Usando una marca de la hoja de bisturí estéril una incisión (1-2 cm) en la pared abdominal para visualizar el lóbulo lateral izquierdo (LLL) del hígado.
   Nota: Ser consistente durante todo el estudio. Otros lóbulos común de interés son el lóbulo medial derecho (RML) y lóbulo medial izquierdo (LML).
5. Extraer el lóbulo lateral izquierdo a través de la incisión.
6. Opción 1: Masaje suavemente el abdomen con los dedos pulgar e índice para exponer una porción de la LLL.
7. Opción 2: Colocar un hisopo de algodón estéril por debajo del LLL que tire una porción hacia fuera a exponerse.
8. Coloque un pedazo de remojados en solución salina estéril de Gasa por debajo de la LLL para permitir una superficie estéril e hidratada para el hígado mentir sobre.
9. Cortar una pieza en forma de cuña del hígado del LLL haciendo dos cortes con una tijera estéril.
   Nota: Del tamaño del hígado se eliminan es 30-50 mg (< 5% del hígado en ratones).
10. Cortar un trozo de esponja de gelatina similar en tamaño a la pieza de cuña del hígado. Introducir la esponja en la porción del corte del hígado usando fórceps.
11. Mantener la esponja con pinzas y mantener contacto con el hígado hasta que se adhiere a la superficie del hígado y se logra la hemostasia.
12. Lugar la pieza de biopsia del hígado en el tubo apropiado (es decir, congelados, fijador, etcetera.).
13. Suavemente Coloque el hígado en la cavidad abdominal, teniendo cuidado de no perturbar la esponja.
14. Sutura de la pared abdominal con cubierta Sutura absorbible 5-0 inicial y final con un nudo cuadrado completo.
15. Cierre la piel con pinzas de herida de 7 mm (o grapas).
16. Inspeccione los ganchos de la herida para asegurarse de que hay un cierre completo de la incisión.
17. Quitar el mouse del cono de la nariz y colocar en una jaula limpia en una superficie caliente.
18. Instrumentos de lugar en esterilizador de bolas entre ratones de 10-20 s. Asegúrese de que todo el material orgánico debe eliminarse de los instrumentos usando solución salina estéril antes de colocar en el esterilizador de bolas de cristal.

4. postoperatorio cuidado

1. Controlar el ratón hasta que recupera la conciencia y puede la derecha sí mismo.
2. Grabar observaciones postoperatorias y compruebe los ratones diariamente para la dehiscencia.
3. Administrar una segunda y tercera dosis de buprenorfina (0.05-0.1 mg/kg) por vía subcutánea 6-8 h después de la cirugía y otra vez después de la cirugía 24 h.
4. Eliminar clips de la herida en el post-operatorio de 7 a 10 días.

Resultados

Para este estudio, ratones fueron asignados al azar a los grupos de tratamiento (n = 12/grupo) basado en el estudio previa biopsia fibrosis grado y peso corporal. Administraron a ratones vehículo (PBS) o liraglutida (5 nmol/kg) durante 42 días (vehículo o compuestos administrados 10 mL/kg volumen, la dosis por vía subcutánea, una vez al día). Día 42, ratones fueron sacrificados (a través de inhalación de CO₂ ) en el estado de no ayuno y el hígado suprimida y procesado para histología.

Hígado biopsia y terminal piezas fueron fijadas durante la noche en formalina al 10%, parafina luego integrados y procesados por hematoxilina y eosina y tinción mediante protocolos estándar⁹Sirius roja. Las secciones de tejido se evaluaron de manera cegada por un patólogo según el sistema de puntuación de actividad de NASH (NAS)^1,2. La NAS refleja el grado de la enfermedad de esteatosis, inflamación lobular y hepatocitos en globo (cada parámetro dado una puntuación de 0-3) como se describió anteriormente⁹.

Incorporación de una biopsia del hígado en el diseño de este estudio permitida una puntuación de fibrosis (previa biopsia) línea de base. Un total de 118 ratones fueron hechas una biopsia después de 26 semanas de dieta de NASH y la esteatosis y la fibrosis hepática se anotaron para cada biopsia (figura 1). De estos 118 ratones, 49 ratones fueron excluidos basado en baja fibrosis fibrosis alta (grado 0), (grado 4, que exhiben patología anormal) y pérdida de peso anormal o la cicatrización de heridas. Estos criterios de exclusión para 69 ratones a la izquierda para asignar en grupos de estudio y buscar mejoras en el fenotipo de NASH después del tratamiento (figura 1).

Ratones fueron tratados con el vehículo o el agonista GLP-1R la liraglutida (5 nmol/kg) durante 6 semanas. En el grupo tratado con vehículo, 1 ratón expuesta fibrosis empeoró y 4 ratones mostraron peor puntuación NAS (Figura 2A-B). Tratamiento liraglutida se asoció con una mejora general de la fibrosis (figura 2), con 17% de la mejora del grupo de tratamiento y el 83% restante sin cambiar. Asimismo, liraglutida tratamiento mejoró el NAS total score (Figura 2D), con el 66% del grupo de haber mejorado puntuación NAS y 33% permanecía sin cambios.

Además, el tratamiento liraglutida mejoró la inflamación, con el 75% del grupo de tener una baja puntuación de inflamación y 25% permaneció sin cambios (Figura 3B). Tratamiento del vehículo empeora la inflamación, con 17% del grupo con una puntuación mayor de inflamación y 83% permanecido sin cambios (Figura 3A). Esteatosis puntuación permaneció invariable desde el inicio al final del estudio en ambos el vehículo-liraglutida tratados y grupos (Figura 3A, B). Pre vs post biopsia comparaciones para ratones individuales sobre la inflamación y los parámetros de vuelo en globo también se muestran (figura 3-F).

Figura 1: pre-screening biopsia hepática fibrosis y puntuación NAS . (A) representación de todos los 118 ratones que se revisaron para la fibrosis, a través de la biopsia del hígado. (B y C) muestran la fibrosis basal y la puntuación de la NAS, respectivamente, después de que los ratones fueron ordenadas en grupos de estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: puntuación de Fibrosis y NAS, biopsia previa y posterior a la intervención. Análisis de respondedor por ciento para el vehículo (A, C) o ratones (B, D) tratados con liraglutida, medida de biopsia hepática basal a fin de hígado muestra para la etapa de fibrosis (A, B) y NAS (C, D). Para cada grupo, el cambio desde el estudio previo al estudio de la biopsia se indica por una línea. Los puntos en cada paso de la puntuación se desplaza ligeramente para permitir la separación visual de los animales, esto es sólo para propósitos de visualización y no reflejar cualquier diferencia en la puntuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: esteatosis, inflamación y en globo, biopsia previa y posterior a la intervención. Análisis de respondedor por ciento para el vehículo (A, C, E) o ratones (B, D, F) tratados con liraglutida, medida de biopsia hepática basal a fin de muestra del estudio hígado por esteatosis puntuación (A, B), inflamación (C, D) y globos (E, F). Para cada grupo, el cambio desde el estudio previo al estudio de la biopsia se indica por una línea. Los puntos en cada paso de la puntuación se desplaza ligeramente para permitir la separación visual de los animales, esto es sólo para propósitos de visualización y no reflejar cualquier diferencia en la puntuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí describimos en detalle el procedimiento de biopsia del hígado del ratón primero descrito por badajo et al¹⁰y son un ejemplo de su utilidad en un modelo murino de NASH, similar a los anteriores informes^6,9. El procedimiento de biopsia del hígado es una valiosa herramienta para evaluar el fenotipo de NASH antes y después del tratamiento, de manera similar a la realizada en los ensayos clínicos terapéuticos. La biopsia permite la comparación directa de cada materia, es decir, que los ratones mismo pueden ser utilizados para ambos puntos del tiempo. También nos demuestran su potencial traslacional. En un ensayo clínico en sujetos de NASH biopsia-probada, liraglutida produce una tasa de respuesta del 39% (pacientes con mejoría) en NAS, mientras que en nuestro estudio se observó una tasa de respuesta del 66% para NAS mejoradas. Por otra parte, 26% de los pacientes tenía fibrosis mayor puntuación con 9% empeoramiento, frente al 14% y 36% en el brazo de placebo, respectivamente¹¹. En nuestro estudio, se observó una tasa de 17% de mejoría con tratamiento liraglutida. Estas comparaciones destacan el poder de la biopsia hepática de base y confirman comprensión traslacional potenciales, al menos para esta clase de terapéutica.

Es fundamental para cosechar un pedazo bastante grande de tejido del hígado durante el procedimiento de biopsia para analizar adecuadamente las características histológicas, pero también no demasiado grande de un pedazo de hígado para comprometer la función del hígado. Se observó una tasa de mortalidad de cero con esta cirugía, y los animales aparecieron completamente recuperados dentro de 1 día con la reanudación de la conducta alimentaria normal. Así, el tiempo entre la biopsia y la iniciación del estudio intervención es limitado no por la recuperación de animales pero probablemente por el tiempo de procesamiento de las muestras, análisis y posterior asignación al azar.

Utilizando el procedimiento de biopsia del hígado como método de confirmación de la fibrosis antes de intervención ayudó a reducir la variabilidad en nuestro estudio, lo que nos permite excluir los ratones que no se desarrolló completamente cierto grado de fibrosis hepática como consecuencia de la dieta de inducción AMLN NASH. Además, mejora nuestra capacidad de entender mejor el impacto de posibles intervenciones de mejora de NASH, en comparación con sólo tener una muestra hepática terminal y puntuación de NASH. Hasta que nuevas técnicas no invasivas son exploradas y aceptadas ampliamente, la biopsia del hígado es la única probada para determinar a NASH.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Henry Schein	29405
5-0 suture	Ethicon	J834G
7 mm Wound Clips	Reflex	203-1000
Absorbable gelatin sponge (GelFoam)	Pfizer	09-0353-01	Compressed, Any Size
Alcohol Prep Pad	VWR	75856-902
Animal Clippers	Oster	78005010002	Size 40 Blade
Artificial Tears	Henry Schein	048272	Tube
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	NDC 12496-0757-5
Iodine Prep Pads	Nice Pak Products	C12400
Sterile Drapes	Stoelting	50981
Surgical Gloves	Medline	54720