Включения процедуры живуч биопсии печени в мышах оценить резолюции неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)

Резюме

В клинических условиях биопсия печени используется для оценки стадии неалкогольный стеатогепатит (стеатоз, воспаление, гепатоцит полеты на воздушных шарах и фиброз). Здесь мы иллюстрируем живуч биопсии печени на мышах, которые могут быть использованы для гистологического анализа для оценки терапевтических агентов в духе более согласованы с клинических испытаний.

Аннотация

Клинические испытания, оценивающие терапии для лечения неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) включать базовые и конце биопсии печени исследования и оценки улучшений в болезни конечных точек, часто отражает как процент от каждого лечения руку, что улучшение, ухудшилось или остались неизменными. Традиционные доклинические исследования грызунов для предполагаемого Нэш терапии часто ограничены, не зная уровень печени болезнь/Нэш настоящее в начале терапевтического вмешательства, а не случайной группы лечения на легко измеримые конечные точки, такие как вес тела, метаболический статус или аналогичный. Здесь мы описываем методом биопсии печени диета индуцированной Нэш мыши модели, для оценки исходных условий печени заболевания с целью исключить мышей, которые не демонстрируют фиброз и равномерно распределить животных с аналогичными фиброзом между группами лечения. Эти уровни можно сравнить с терминала, после вмешательства уровнями для большей степени понимания в естественных условиях фармакологических эффектов и таким образом более точно отражать клинические пробной разработки стратегий. Мышь должным образом под наркозом и подготовлен для хирургии с использованием стерильных условий. Маленький разрез в верхней части живота и боковых левой доле печени подвергается. Клин печени удалены хирургическим путем, и аналогичного размера кусок рассасывающиеся желатина положить в его место, чтобы остановить любое кровотечение. Мыши хирургически зашивается и stapled закрыт и будет восстановить вернуться к нормальной в течение 1 дня. Весь процесс занимает 5-10 мин на мышь. Здесь мы примером полезности этой процедуры, используя биопсии предварительное исследование для оценки воздействия liraglutide глюкагон как пептида-1 (GLP-1) рецептора агонистом Нэш конечных мышей.

Введение

Безалкогольное стеатогепатит (НАСГ) является прогрессирующим заболеванием печени и более тяжелой формой безалкогольного наварного заболевания печени (NAFLD), которая становится все более распространенным, из-за своей ассоциации с ожирением и сахарным диабетом типа 2. Существует нет утвержденной терапии для NAFLD/Нэш, или утвержденных биомаркеров легко оценить прогрессирования заболевания. Нэш диагностируется гистологически путем оценки воспаления, избыток липидов в печени (стеатоз), гепатоцит полеты на воздушных шарах и фиброз-^1,-^2,-^3,-⁴. В клинических испытаниях эти конечные точки оцениваются до исследования в печени выборки, собранные через биопсии, а от второй биопсии печени после определенного периода лечения. Таким образом, эффективность агента тестирования оценивается через изменения в патологии печени по предметам с ранее выявленных/количественно (то есть, биопсия доказано) Нэш, рандомизированных для лечения групп. Эти же гистологические конечные точки часто используются в грызунов модели оценки потенциальных Нэш терапии в доклинических исследованиях, но только в терминале ткани от Усыпленных мышей и, таким образом, без понимания степени эффективности в базовых и неспособность для управления для различия в базовых болезненное состояние между группами лечения.

Хотя 25% взрослых с NAFLD предположительно иметь Нэш, основанный на повышенных сыворотке (АЛТ), не существует альтернативных окончательного методов для подтверждения Нэш помимо гистологические доказательства⁴. Неинвазивные методы, такие как радиологических условий (ультразвук, компьютерная томография и магнитно-резонансная томография) были разработаны для обнаружения печеночная стеатоз, но эти методы не могут диагностировать Нэш или определения стадии фиброза. Переходных эластография предлагает многообещающие неинвазивные модальности для измерения печени жесткость. Было показано, чтобы быть точным в дифференциации стадии фиброза. Однако точность уменьшается с высокий индекс массы тела (ИМТ) и жировой ткани. ⁵ это проблематично из-за большинство Нэш пациентов, страдающих ожирением. Помимо клинической значимости этих подходов ни один из этих методов используются в доклинических исследованиях.

Чтобы преодолеть это, исследовательская группа д-р Джонатан рота первыми для реализации процедуры биопсии печени в Amylin Нэш (AMLN) модели мыши Нэш^6,,78. Они описали прогностическую валидность биопсии с степенью заболевания Нэш и корреляции с метаболические болезни. Здесь мы подробно описать процедуру биопсии печени в AMLN модели Нэш и его полезность в терапевтического, специально для того, чтобы оценить эффективность liraglutide.

протокол

Все в естественных условиях эксперименты были проведены в соответствии с политикой институционального ухода животных и использование Комитет (IACUC) визуальной, ООО и по согласованию с руководством для ухода и использования лабораторных животных, 8-е издание (2011). Мужской C57BL6J мышей были помещены на высокой жирностью, высокофруктозный, высокий холестерин диета AMLN. Биопсии печени были выполнены после 26 недель на диете, за 3 недели до начала фармакологического вмешательства.

1. получить и подготовить хирургических материалов

1. Автоклав стерильные инструменты (маленькие ножницы указал Совет, тупой совет щипцы, ватные тампоны, марлевые квадраты, 7 мм скобы/раны клипов и степлер).
2. Получить, шовный материал стерильный для закрытия брюшной стенки (5-0 с покрытием рассасывающиеся шовные с PC-1 иглой подходит), рассасывающиеся желатин сжатых Губка (которые будут использоваться для целей гемостаза), стерильные шторы и перчатки, скраб на основе йода и 70% этанол палочки/салфетки , бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг доза в мыши, по крайней мере 3 доз в мыши) и хирургические глаз мазь/смазки.
3. Подготовьте испаритель для анестезии, заполнив с изофлюрановая.
4. Включите шарик стерилизатор для стерилизации быстрый инструмент между животными.
5. Включите потепления поверхности или грелку, который будет использоваться для восстановления животных.
6. Дон соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) (то есть, маска, платье, волосы капота, перчатки).

2. дооперационного препараты

1. Поместите курсор мыши в индукции камеру с потоком изофлюрановая 2-3% для эффекта.
2. Наблюдать за мыши до тех пор, пока отсутствие реакции на мыс щепотка подтверждает, что глубина анестезии подходит.
3. Используйте глазную мазь для предотвращения сухости роговицы, связанные с анестезией.
4. Администрировать бупренорфин подкожно (0,05-0,1 мг/кг).
5. Бритье хирургической сайта немедленно хвостового мечевидный процесса, используя животных Клипперс.
6. Переместите мышь на поверхность с подогревом (37 ° C) после бритья хирургической сайта. Поместите курсор мыши таким образом, чтобы спинной поверхности вниз, и подвергается живота. Вставьте нос мыши в носовой конус анестезии для облегчения доставки изофлюрановая при скорости потока 2-3%.
7. Очистите хирургической сайта с чередуя тампоны Бетадин и 70% этанола (3 раза).
8. Открытие и настройка стерильные хирургические инструменты.
9. Снимите перчатки и замените стерильные хирургические перчатки.

3. хирургическая процедура

1. Сделайте продольный разрез с ножницами (1-2 см), немедленно хвостового мечевидного отростка и слегка к левой стороне мыши, на коже живота.
2. Блант рассечения кожи от брюшной стенки с помощью щипцов и ножницы.
3. Разоблачить брюшной стенки и визуализации печени под.
4. Использование стерильным скальпель лезвие надрезают (1-2 см) в брюшной стенке для визуализации слева боковых лепестков (LLL) печени.
   Примечание: Соответствовать всей учебы. Другие общие долей интереса являются право медиальный доли (RML) и доли слева медиальный (любовь моей жизни).
5. Воплощать левой боковых лепестков через разрез.
6. Вариант 1: Слегка массаж живота с большим и указательным пальцем подвергать часть LLL.
7. Вариант 2: Место стерильным ватным тампоном под LLL аккуратно вытащить часть подвергаются.
8. Лечь на место стерильного физиологического раствора пропитанной кусок Марли под LLL разрешить стерильных и увлажненной поверхности для печени.
9. Отрежьте кусок клиновидные печени от LLL, сделав два разреза с стерильными ножницами.
   Примечание: Размер удаляемого печени составляет приблизительно 30-50 мг (< 5% печени в мышах).
10. Вырежьте кусок губки желатин аналогичного размера кусок клина печени. Вставьте Губка в вырезать часть печени, используя пинцет.
11. Держите губки на месте с щипцами и поддерживать контакты с печенью, до тех пор, пока он прилегает к поверхности печени и гемостаз достигается.
12. Место биопсии печени кусок в соответствующую трубку (то есть замороженная, фиксатор, и т.д.).
13. Осторожно поместите печени обратно в брюшной полости, заботясь, чтобы не нарушить Губка.
14. Шовные брюшной стенки с 5-0 с покрытием рассасывающиеся шовные начиная и заканчивая полной квадратный узел.
15. Закройте кожи с 7 мм раны (или металлическими скрепками).
16. Осмотрите рану клипы для обеспечения полного закрытия разреза.
17. Удаление мыши из носовой конус и место в чистой клетке на поверхность с подогревом.
18. Механизмы в стерилизатор шарик между мышей для 10-20 s. Убедитесь, что все органические материалы должны быть удалены из инструментов, с помощью стерильного физиологического раствора до размещения в стеклянный шарик стерилизатор.

4. послеоперационный уход

1. Монитор мыши до тех пор, пока он приходит в сознание и может само право.
2. Запись послеоперационного наблюдения и проверьте мышей ежедневно для зияние.
3. Администрировать вторая и третья доза бупренорфина (0,05-0,1 мг/кг) подкожно 6-8 ч после операции и снова 24 ч после операции.
4. Удалите клипы рану в 7-10 дней после операции.

Результаты

Для этого исследования, мышей были рандомизированы в лечении группы (n = 12/группа) на основе предварительного исследования биопсия фиброз класс и веса тела. Мышей были ведении транспортное средство (PBS) или liraglutide (5 нмоль/кг) на 42 дня (автомобиль или составные управляемых 10 мл/кг доза объем, подкожно, один раз в день). На день 42 мышей были умерщвлены (через CO₂ ингаляции) в состоянии не постился и печени подакцизным и обрабатываются для гистологии.

Биопсия и терминал печени, которую штук были зафиксированы на ночь в формалина 10%, затем парафин, встраиваемых и обработанные гематоксилином и эозином и Сириус красный, окрашивание через стандартные протоколы⁹. Разделах ткани были оценены в ослепленный моды патологоанатом согласно^1,системы скоринга деятельности Нэш (NAS)². NAS отражает степень заболевания стеатоз, лобулярного воспаления и гепатоцитов, полеты на воздушных шарах (каждый параметр счетом 0-3) как описано⁹.

Включение в дизайн это исследование позволило Оценка фиброза (предварительно биопсия) базовый биопсии печени. В общей сложности 118 мышей были биопсию после 26 недель Нэш диеты и фиброз печени и стеатоз забили для каждого биопсии (рис. 1). Эти 118 мышей, 49 мышей были исключены на основании низкого фиброз высокий фиброз (оценка 0), (балл 4, который exhibited аномальные патологии) и потеря веса ненормальное или заживления ран. Эти критерии исключения допускается для 69 мышей осталось назначить в исследовании группы и искать улучшения в фенотипе Нэш после лечения (рис. 1).

Мышей относились с транспортного средства или liraglutide агонист GLP-1R (5 нмоль/кг) в течение 6 недель. В группе транспортное средство лечение 1 мышь выставлены ухудшилось фиброз и 4 мышей показало ухудшение NAS Оценка (Рисунок 2A-B). Лечение liraglutide был связан с общее улучшение фиброз (рис. 2 c), 17% улучшения лечения группы и 83%, осталось неизменным. Аналогично, liraglutide лечение улучшилось общее NAS Оценка (Рисунок 2D), с 66% группы улучшивших показатель NAS и 33% остались неизменными.

Кроме того лечение liraglutide улучшена воспаление, с 75% в группе Нижняя оценка воспаления и 25% оставался неизменным (рис. 3B). Транспортное средство лечения ухудшилось воспаления, с 17% группы, имеющие более высокий балл воспаления и 83% осталась неизменной (рис. 3A). Стеатоз скоринга остается неизменным от базовой линии до конца исследования в обеих лечение транспортное средство и liraglutide групп (рис. 3а, B). Предварительно vs. после биопсии сравнения для отдельных мышей на воспаление и полеты на воздушном шаре параметры также отображаются (рис. 3 c-F).

Рисунок 1: предварительный отбор биопсии печени фиброз и NAS Оценка . (A) представление всех 118 мышей, которые были экранированы для фиброза, через биопсии печени. (B и C) показывают базовые фиброз и оценка NAS, соответственно, после того, как право мышей были отсортированы в исследовательские группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: фиброз и NAS оценка, предварительно биопсии и после вмешательства. Анализ процент ответчика для автомобиля (A, C) или liraglutide лечение (B, D) мышах, измеряемая от биопсии печени базовой линии до конца исследование печени образца для стадии фиброза (A, B) и NAS (C, D). Для каждой группы переход от предварительного исследования после исследования биопсия обозначается линией. Точки на каждом этапе забил немного сдвинуты разрешить визуального разделения животных, это только для визуализации целей и не отражает каких-либо разница в счете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: стеатоз, воспаление и полеты на воздушном шаре, перед биопсией и после вмешательства. Анализ процент ответчика для автомобиля (A, C, E) или liraglutide лечение (B, D, F) мышах, измеряемая от биопсии печени базовой линии до конца исследование печени образца для стеатоз баллу (A, B), воспаление (C, D) и полеты на воздушном шаре (E, F). Для каждой группы переход от предварительного исследования после исследования биопсия обозначается линией. Точки на каждом этапе забил немного сдвинуты разрешить визуального разделения животных, это только для визуализации целей и не отражает каких-либо разница в счете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы подробно процедура биопсии печени мыши впервые описал Клаппер et al.¹⁰и иллюстрируют его полезности в модели мыши Нэш, похож на предыдущие доклады^6,9. Процедура биопсии печени является ценным инструментом для оценки Нэш фенотип до и после лечения, в аналогии с выполняемой в клинических исследованиях терапевтических. Биопсия позволяет для прямого сравнения для каждого предмета, т.е. что же мышей может использоваться для обеих точек времени. Мы также продемонстрировать свое поступательное потенциал. В клинических испытаниях биопсия доказанные Нэш предметам liraglutide вызвал 39% респондентов (пациентов с улучшением) в NAS, тогда как в нашем исследовании мы наблюдали 66% ставка ответчика для улучшения NAS. Кроме того 26% пациентов имели Оценка улучшения фиброз с 9%, ухудшение, по сравнению с 14% и 36% в плацебо, соответственно¹¹. В нашем исследовании мы наблюдали 17% повышение ставки с liraglutide лечения. Эти сопоставления выделите власть биопсии печени базовых и подтвердить потенциальных трансляционная понимание, по крайней мере для этого класса терапевтических.

Это важно собрать достаточно большой кусок ткани печени во время процедуры биопсии правильно анализировать Гистологические особенности, но и не слишком большой кусок печени к компромиссу функцию печени. Мы наблюдали нулевой смертности с этой операции, и животные появились полностью восстановленные в течение 1 дня с возобновлением нормальной еде поведения. Таким образом время между биопсии и начало вмешательства исследование не ограничивается животных восстановления, но вероятно, время для обработки образца, анализа и последующих рандомизации.

Использование процедуры биопсии печени как метод подтверждения фиброза, прежде чем вмешательство помогло снизить изменчивость в нашем исследовании, что позволило нам исключить мышей, которые не полностью разработать определенную степень печени фиброз результате вызывая AMLN Нэш-диета. Кроме того он расширил нашу способность лучше понять влияние возможных Нэш оздоровительных мероприятий, а не только с терминала печени выборки и оценка Нэш. До тех пор, пока новые неинвазивные методы дополнительно изучить и широко принята, биопсии печени является единственным доказано способом определения Нэш.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Henry Schein	29405
5-0 suture	Ethicon	J834G
7 mm Wound Clips	Reflex	203-1000
Absorbable gelatin sponge (GelFoam)	Pfizer	09-0353-01	Compressed, Any Size
Alcohol Prep Pad	VWR	75856-902
Animal Clippers	Oster	78005010002	Size 40 Blade
Artificial Tears	Henry Schein	048272	Tube
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	NDC 12496-0757-5
Iodine Prep Pads	Nice Pak Products	C12400
Sterile Drapes	Stoelting	50981
Surgical Gloves	Medline	54720