-Alkolsüz Steatohepatitis (NASH) çözünürlük değerlendirmek farelerde hayatta kalınabilir karaciğer biyopsisi yordam eklenmesi

Özet

Klinik ayarları'nda, karaciğer biyopsisi alkolsüz steatohepatitis (yağlanma, inflamasyon, balon Hepatosit ve fibrozis) aşamaları değerlendirmek için kullanılır. Burada, biz hayatta kalınabilir karaciğer biyopsisi histolojik analizler için klinik ile uyumlu bir şekilde daha fazla terapötik ajanlar değerlendirilmesi etkinleştirmek için kullanılabilecek farelerde göstermektedir.

Özet

Klinik tedaviler alkolsüz steatohepatitis (NASH) tedavisi için değerlendirilmesi temel ve çalışma karaciğer biyopsi ve hastalık bitiş noktaları, sık sık geliştirilmiş her tedavi kol bir yüzdesi olarak yansıyan düzelme değerlendirilmesi dahil, kötüleşti veya değişmeden kaldı. Geleneksel preklinik kemirgen çalışmaları için sözde NASH tedaviler genellikle karaciğer hastalığı/NASH mevcut tedavi grupları üzerinde kolayca ölçülebilir bitiş noktaları gibi rastgele yerine terapötik müdahale başında düzeyini bilmeden tarafından sınırlıdır vücut ağırlığı, metabolik durum veya benzer. Burada, bir diyet kaynaklı NASH fare modeli, temel karaciğer hastalığı fibrozis sergi değil fare dışlamak için ve hayvan tedavi grupları arasında benzer fibrozis ile eşit olarak dağıtmak için değerlendirilmesi için karaciğer biyopsisi teknikte tarif. Bu düzeyleri sonra terminal, sonrası müdahale düzeyleri içinde vivo farmakolojik etkileri daha doğru bir anlayış için karşılaştırılabilir ve böylece daha doğru bir şekilde yansıtmak klinik deneme tasarım stratejileri. Fare düzgün anestezi ve steril koşullar kullanarak ameliyat için hazır. Üst karın küçük bir kesi yapılır ve karaciğer sol yan lob maruz kalmaktadır. Bir kama karaciğer ameliyatla ve absorbe jelatin benzer büyüklükte bir parçası herhangi bir kanama durdurmak için onun yerine konur. Fare ameliyatla sütüre ve zımbalanmış kapalı ve normale döndü 1 gün içinde iyileşir. Tüm süreç fare başına 5-10 dakika sürer. Burada belgili tanımlık yarar, bu yordamın glukagon benzeri peptid-1 (GLP-1) reseptör agonist liraglutide NASH bitiş noktaları fareler üzerinde etkisini değerlendirmek için ön çalışma biyopsi yararlanarak örnekler.

Giriş

Alkolsüz steatohepatitis (NASH) Progresif bir karaciğer hastalığı ve obezite ve tip 2 Diyabet ile dernek nedeniyle giderek yaygın hale geliyor bu alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), daha ağır bir tür olduğunu. NAFLD/NASH ya da onaylı biyolojik kolayca hastalık ilerleme değerlendirmek için onaylanmış hiçbir tedaviler vardır. NASH tanısı histolojik olarak inflamasyon değerlendirme tarafından karaciğer lipid (yağlanma), balon Hepatosit ve fibrozis^1,2,3,4fazla. Klinik çalışmalarda, bu bitiş noktası biyopsi ile ve ikinci karaciğer biyopsisi belirli bir tedavi süre sonra toplanan bir karaciğer örnek çalışmada önce değerlendirilir. Böylece, test aracısı etkinliğini karaciğer patolojisi olan bireylerde değişiklik ile daha önce tespit/sayısal değerlendirilir (yani, biyopsi kanıtlanmış) tedavi gruplarına randomize NASH. Bu aynı histolojik bitiş noktaları genellikle potansiyel NASH therapeutics preklinik çalışmaları, ancak yalnızca terminal doku euthanized fareler ve böylece temel ve bir yetersizlik etkinlik derecesini bir anlayış olmadan değerlendirirken kemirgen modellerinde kullanılır temel hastalık durumu tedavi grupları arasındaki farkları için kontrol etmek için.

Yetişkin NAFLD ile % 25'i NASH için yükseltilmiş serum aminotransferaz düzeyleri temel alınarak tahmin ediliyor olsa da, NASH histolojik kanıt⁴dışında onaylamak için alternatif yok kesin yöntem vardır. Radyolojik yöntemleri (ultrason, bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme) gibi noninvaziv yöntemler hepatik yağlanma algılamak için geliştirilmiştir, ancak bu yöntemleri NASH tanılayamaz veya fibrozis sahne belirlemek. Geçici elastography karaciğer Sertlik ölçme için umut verici bir non-invaziv modality sunmaktadır. Fibrozis aşamaları ayırt doğru olarak gösterilmiştir. Ancak, daha yüksek vücut kitle indeksi (VKİ) ve yağ dokusu ile doğruluğu azalır. ⁵ bu obez olarak NASH hastaların çoğu nedeniyle problemlidir. Bu yaklaşımlar klinik önemi, Bu modalities hiçbiri preklinik çalışmalarda kullanılmaktadır.

Bu sorunu gidermek için Dr Jonathan Roth araştırma grubu bir karaciğer biyopsisi yordam NASH^6,7,8Amylin NASH (AMLN) fare modeli uygulamak için ilk idi. Onlar akıllı metabolik hastalık ile korelasyon NASH hastalığının derecesi ile biyopsi geçerliliği nitelendirdi. Karaciğer biyopsisi yordam NASH, AMLN modeli ve yararını tedavi edici bir ortamda, özellikle liraglutide etkinliğini değerlendirmek için burada biz ayrıntılı olarak tarif.

Protokol

Bütün içinde vivo deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) MedImmune, LLC ve kılavuz ile anlaşma politikalarına uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının, 8 edition (2011) için yapılmıştır. Erkek C57BL6J fareler yüksek yağlı, yüksek fruktoz, yüksek kolesterol AMLN diyet yerleştirildi. 26 hafta diyet, farmakolojik müdahalesi başlamadan önce 3 hafta sonra karaciğer biyopsi yapıldı.

1. alın ve cerrahi malzemeleri hazırlamak

1. Otoklav steril aletlerin (küçük sivri uçlu makas, künt ipucu forseps, pamuk temizleme bezi, gazlı bez kareler, 7 zımba/yara mm klipleri ve zımba).
2. Elde etmek, karın duvarı (PC-1 iğne ile 5-0 kaplamalı absorbe dikiş uygundur), (Kan durdurucu sargı amaçlar için kullanılmak üzere) sıkıştırılmış absorbe jelatin sünger, steril Örtüler ve eldiven, iyot tabanlı fırçalayın ve % 70 etanol temizleme bezi/mendil kapatmak için steril dikiş , buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg doz başına fare; fare başına en az 3 doz) ve cerrahi göz merhem/yağlama.
3. Buharlaştırıcı isoflurane ile doldurarak anestezi için hazırlayın.
4. Hayvanlar arasında hızlı araç sterilizasyon için bir boncuk Sterilizatör açın.
5. Bir ısınma yüzey veya Isıtma yastığını, hayvan kurtarma için kullanılmak üzere açın.
6. Don uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) (yani, maske, elbise, saç kaporta, eldiven).

2. cerrahi öncesi hazırlıklar

1. 2-%3 isoflurane akışı etkisi ile indüksiyon odasına fareyi getirin.
2. Anestezi derinliği uygun yanıt-e doğru ayak parmağı-çimdik eksikliği doğrular kadar fareyi gözlemlemek.
3. Bir göz merhem kuruluk kornea anestezi ile ilişkili önlemek için kullanın.
4. Buprenorfin subkutan yönetmek (0,05-0,1 mg/kg).
5. Cerrahi sitesi hayvan kesme makineleri kullanarak xiphoid sürecinin hemen Kaudal tıraş.
6. Fareyi ısıtmalı bir yüzey (37 ° C) cerrahi sitesi tıraş sonra. Fare, dorsal yüzeyi aşağı doğru olduğunu ve karın maruz şekilde yerleştirirsiniz. Fare burun isoflurane % 2-3 akış hızında teslimini kolaylaştırmak için anestezi burun konisi yerleştirin.
7. Cerrahi sitesi betadin ve % 70 etanol alternatif temizleme bezi ile (3 kere) temiz.
8. Açık ve kadar steril cerrahi aletler.
9. Eldiven kaldırın ve steril cerrahi eldivenler ile değiştirin.

3. cerrahi müdahale

1. Makas (1-2 cm), hemen Kaudal xiphoid sürecinin ve fare sol tarafında, karın cilt için biraz ile boyuna bir kesi yapmak.
2. Künt karın duvarı forseps ve makas kullanarak uzak cilt incelemek.
3. Karın duvarının açığa ve karaciğer altında görselleştirmek.
4. Steril neşter bıçak yapmak bir kesi (1-2 cm) karaciğer sol-lateral LOB (LLL) görselleştirmek için karın duvarı kullanarak.
   Not: Çalışma tutarlı olması. Diğer ortak loblar ilgi sağ medial LOB (RML) ve sol medial LOB (hayatımı seviyorum) vardır.
5. Belgili tanımlık kesme yoluyla sol yan lob yansıtmak.
6. Seçenek 1: Başparmak ve işaret parmağı LLL bir kısmını ortaya çıkarmak için karın hafifçe masaj.
7. Seçenek 2: yer altında bir bölümü yavaşça çekmeye LLL steril pamuklu çubukla maruz.
8. Steril ve sulu bir yüzey üzerinde yalan karaciğer için izin vermek için LLL altına gazlı bez bir steril serum fizyolojik bulanmış parça yerleştirin.
9. Kama şeklinde bir parça karaciğer LLL steril makasla iki kesim yaparak kes.
   Not: 30-50 mg kaldırılmakta olan karaciğer yaklaşık boyutudur (< %5 farelerde karaciğer).
10. Jelatin sünger bir parça benzer boyutunda karaciğer kama parçası kesti. Sünger forseps kullanarak karaciğer kesilmiş bölümünü içine yerleştirin.
11. Forseps ile sünger tutmak ve karaciğer ile temas kadar karaciğer yüzeye yapışır ve hemostaz elde korumak.
12. Yer karaciğer biyopsisi parça uygun tüp içine (yani donmuş, sabitleştirici, vs.).
13. Yavaşça karaciğer sünger bozmamaya dikkat çekici geri karın boşluğuna, yerleştirin.
14. Karın duvarı ile tam bir kare düğüm ile başlayıp 5-0 kaplamalı absorbe Dikiş dikiş.
15. Cilt 7 mm yara klip (veya zımba) ile kapatın.
16. Belgili tanımlık kesme tam bir kapatma emin olmak için yara klipleri bakarak kontrol edin.
17. Fare burun konisi çıkarın ve ısıtmalı bir yüzey üzerinde temiz bir kafes içine yerleştirin.
18. 10-20 s. için yer aygıtlar fareler arasında boncuk ısıtıcı içine tüm organik malzeme cam boncuk Sterilizatör yerleştirerek önce steril serum fizyolojik kullanarak aygıtlar üzerinden kaldırılması gerektiğini emin olun.

4. ameliyat sonrası bakım

1. Kadar bilincinin tekrar yerine geleceğinden ve kendisi sağ fare izleyin.
2. Ameliyat sonrası gözlemleri kaydetmek ve fareler yırtılması için her gün kontrol edin.
3. Buprenorfin ikinci ve üçüncü doz yönetmek (0,05-0,1 mg/kg) subkutan 6-8 h sonrası cerrahi ve tekrar ameliyat sonrası 24 saat.
4. 7-10 gün ameliyat sonrası yara klibe kaldırın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, fareler tedavi gruplarına randomize (n = 12/grup) öncesi çalışma biyopsi fibrozis sınıf ve vücut ağırlığını dayalı. Fareler yönetilen araç (PBS) veya liraglutide (5 nmol/kg) 42 gün (araç ya da bileşik yönetilen 10 mL/birim, subkutan, doz günde bir kez kg) için. 42 günde fareler sigara oruç devlet ve güvenliğe ve histoloji için işlenen karaciğer (CO₂ inhalasyon yolu ile) euthanized.

Biyopsi ve terminal karaciğer adet gecede % 10 formalin içinde tespit edildi sonra alkol katıştırılmış ve Hematoksilen Eozin ve Sirius kırmızı, via standart protokolleri⁹boyama için işlenmiş. Doku bölümleri kör bir biçimde NASH etkinlik puanlama (NAS) sistem^1,2göre bir patolog tarafından değerlendirildi. NAS'ın hastalığı yağlanma, lobular inflamasyon ve (0-3 puan verilen her parametre) balon Hepatosit derecesi yukarıda açıklanan⁹olarak yansıtır.

Bu çalışmanın temel (ön biyopsi) fibrozis skoru izin tasarım içine karaciğer biyopsisi ekleme. Toplam 118 farelerin biyopsi NASH diyet 26 hafta sonra ve karaciğer fibrozis ve yağlanma her biyopsi (şekil 1) skorlanmıştır. 118 bu fareler 49 fareler üzerinde düşük fibrozis dayalı bırakıldı (0 puan), yüksek fibrozis (anormal patoloji sergilenen 4 puan) ve anormal kilo kaybı ya da yara iyileşmesi. Bu dışlama kriterleri 69 fareler için izin çalışma grupları atamanız ve tedavi sonrası (şekil 1) NASH fenotip gelişmeler bakın yaptı.

Fareler için 6 hafta araç veya GLP-1R agonist liraglutide (5 nmol/kg) ile tedavi edildi. Araç tedavi grubunda 1 fare sergilenen kötüleşti fibrozis ve 4 fareler kötüleşti NAS skoru gösterdi (Şekil 2A-B). Liraglutide tedavi, tedavi grubu artırma % 17 ve % 83'ü değişmeden kalan fibrozis (şekil 2C) genel bir iyileşme ile ilişkili idi. Benzer şekilde, genel NAS liraglutide tedavi geliştirilmiş (şekil 2B) skor, NAS'ın puan ve % 33 geliştirilmiş grubun ile %66 değişmemiştir.

Ayrıca, liraglutide tedavi iltihap arttırılmış, grubun % 75'i ile bir alt iltihap puanı ve % 25 olması (şekil 3B) değişmeden kaldı. Araç tedavi iltihabı, yüksek bir iltihap Puan sahip grubun %17 ve % 83 (şekil 3A) değişmemiştir kötüleşti. Yağlanma puanlama sonuna satır taban çizgisinden değişmeden kaldı çalışma gruplarındaki her iki araç ve liraglutide tedavi (şekil 3A, B). Öncesi sonrası biyopsi karşılaştırma vs için bireysel fareler inflamasyon ve Balonculuk parametreleri üzerinde de (şekil 3 c-F) gösterilir.

Şekil 1: karaciğer biyopsisi fibrozis ve NAS'ın Puan ön eleme . (A)gösterimi için karaciğer biyopsisi ile fibrozis gösterildi tüm 118 fareler. Sonra uygun fareler çalışma gruplar halinde sıralanır (B ve C) temel fibrozis ve NAS'ın puan, sırasıyla, gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: fibrozis ve NAS'ın puan, ön biyopsi ve sonrası müdahale. Yüzde Yanıtlayıcı Çözümleme Araç (A, C) veya (B, D) fareler liraglutide tedavi sonuna kadar temel karaciğer biyopsisi üzerinden ölçülen karaciğer çalışma örneği fibrozis sahne (A, B) için ve NAS (C, D). Her grup için sonrası çalışma biyopsisi öncesi çalışma gelen değişim bir çizgiyle gösterilir. Puan puanlama her adımda biraz görsel hayvanlar ayrılması izin vermek için kaymıştır, bu sadece görselleştirme amaçlıdır ve herhangi bir puan farkı yansıtmak zorunda değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: yağlanma, inflamasyon ve balon, ön biyopsi ve sonrası müdahale. Yüzde Yanıtlayıcı Çözümleme Araç (A, C, E) veya (B, D, F) fareler liraglutide tedavi sonuna kadar temel karaciğer biyopsisi üzerinden ölçülen karaciğer çalışma örneği yağlanma için (A, B), Puan edinildi iltihabı (C, D) ve balon (E, F). Her grup için sonrası çalışma biyopsisi öncesi çalışma gelen değişim bir çizgiyle gösterilir. Puan puanlama her adımda biraz görsel hayvanlar ayrılması izin vermek için kaymıştır, bu sadece görselleştirme amaçlıdır ve herhangi bir puan farkı yansıtmak zorunda değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada fare karaciğer biyopsisi yordamı ilk Clapper vd.¹⁰tarafından açıklanan ve yararını NASH, önceki raporlar^6,9' a benzer, bir fare modeli reaksiyonların ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Karaciğer biyopsisi yordamı NASH fenotip öncesi ve tedavi sonrası, tedavi klinik gerçekleştirilen için benzer bir şekilde değerlendirmek için değerli bir araçtır. Biyopsi için doğrudan karşılaştırma için her konu, yani aynı fare-ebilmek var olmak kullanılmış için her iki saat Puan sağlar. Biz de çevirim potansiyelini göstermek. Bizim çalışmada biz için geliştirilmiş NAS % 66 Yanıtlayıcı oranı gözlenen ise biyopsi kanıtlanmış NASH bireylerde bir klinik deneme olarak, NAS, bir % 39 yanıt oranı (hasta iyileşme ile) liraglutide elde edildi. Ayrıca, hastaların % %26 9, % 14 ve % 36 plasebo kolundan karşı sırasıyla¹¹kötüleşen geliştirilmiş fibrozis puanı vardı. Bizim çalışmada, liraglutide tedavi ile % 17 iyileşme oranı görülmektedir. Bu karşılaştırmalar temel karaciğer biyopsisi gücünü vurgulamak ve potansiyel translasyonel anlayış, en az tedavi bu sınıfı için onaylayın.

Karaciğer dokusunun yeterince büyük bir parça düzgün histolojik özellikleri analiz etmek için biyopsi işlemi sırasında hasat için kritik, ama aynı zamanda değil de bir parça Karaciğer karaciğer fonksiyonu uzlaşmaya büyük değil. Biz sıfır mortalite ameliyat gözlenen ve hayvanların normal yeme davranışının yeniden başlatılması ile 1 gün içinde tam olarak kurtarılan çıktı. Böylece, biyopsi ve inisiyasyon müdahale çalışmanın arasında zaman hayvan kurtarma tarafından sınırlı değil ama büyük olasılıkla tarafından örnek işleme, analiz ve sonraki randomizasyon için geçen süre.

Bize tamamen hepatik fibrozis AMLN NASH-inducing diyet bir sonucu olarak bir dereceye geliştirmek değil fare hariç tutmak için izin bizim çalışma, değişkenliği azaltmak müdahale yardımcı önce karaciğer biyopsisi yordamı fibrozis onay yöntemi olarak kullanmak. Ayrıca, sadece bir terminal karaciğer örnek ve NASH puanı olan karşı olası NASH iyileştirilmesi müdahaleler etkisini daha iyi anlamak için bizim yeteneği gelişmiş. Yeni non-invaziv teknikler daha da araştırdı ve yaygın olarak kabul, karaciğer biyopsisi tek NASH belirlemek için kanıtlanmış kadar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Henry Schein	29405
5-0 suture	Ethicon	J834G
7 mm Wound Clips	Reflex	203-1000
Absorbable gelatin sponge (GelFoam)	Pfizer	09-0353-01	Compressed, Any Size
Alcohol Prep Pad	VWR	75856-902
Animal Clippers	Oster	78005010002	Size 40 Blade
Artificial Tears	Henry Schein	048272	Tube
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	NDC 12496-0757-5
Iodine Prep Pads	Nice Pak Products	C12400
Sterile Drapes	Stoelting	50981
Surgical Gloves	Medline	54720