Un Protocolo de Pantalla Mutante de Señalización de Señalización de Fuerza Táctil Y Repetible para el Estudio de la Thigmomorfogénesis de una Planta Modelo Arabidopsis thaliana

Resumen

Una suave máquina de carga de fuerza táctil está construida a partir de cepillos de pelo humanos, brazos robóticos y un controlador. Los cepillos para el cabello son accionados por brazos robóticos instalados en la máquina y se mueven periódicamente para aplicar la fuerza táctil en las plantas. La fuerza de los toques capilares accionados por máquina es comparable a la de los toques aplicados manualmente.

Resumen

Las plantas que responden a las estimulaciones mecánicas intracelulares y extracelulares (o señales de fuerza) y desarrollan cambios morfológicos especiales, un llamado thigmomorfogénesis. En las últimas décadas, se han identificado y reportado varios componentes de señalización por estar involucrados en la mechanotransducción (por ejemplo, proteínas de unión a iones de calcio y enzimas de biosíntesis de ácido jasmónico). Sin embargo, el ritmo relativamente lento de la investigación en el estudio de la señalización de la fuerza o thigmomorfogénesis se atribuye en gran medida a dos razones: el requisito de la inducción táctil humana laboriosa de la thigmomorfogénesis y los errores de fuerza de la fuerza asociados con el tacto manual de las personas. Para mejorar la eficiencia de la carga de fuerza externa en un organismo vegetal, se construyó una máquina de carga automática de fuerza táctil. Estos toques robóticos de cepillodes de pelo impulsados por brazos proporcionan una simulación de fuerza táctil fácilmente repetible y ahorradora de mano de obra, rondas ilimitadas de repetición táctil y fuerza táctil ajustable. Esta máquina de carga de fuerza táctil para el cabello se puede utilizar tanto para el cribado a gran escala de mutantes de señalización de fuerza táctil como para el estudio fenomics de la thigmomorfogénesis vegetal. Además, los materiales táctiles como el cabello humano, se pueden reemplazar con otros materiales naturales como el cabello animal, hilos de seda y fibras de algodón. Los brazos móviles automatizados de la máquina pueden estar equipados con boquillas de aspersión de agua y sopladores de aire para imitar las fuerzas naturales de las gotas de lluvia y el viento, respectivamente. Mediante el uso de esta máquina automática de carga de fuerza táctil para el cabello en combinación con el toque de hisopo de algodón realizado a mano, hemos investigado la respuesta táctil de dos mutantes de señalización de fuerza, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) y plantas MKK2 . Los fenomemos de las plantas de tipo salvaje cargadas por fuerza táctil y dos mutantes fueron evaluados estadísticamente. Han mostrado diferencias significativas en la respuesta táctil.

Introducción

Thigmomorfogénesis vegetal es un término que fue acuñado por Jaffe, MJ en 1973¹. Es un tropismo vegetal pero diferente del conocido fototropismo o gravitropismo causado por losestímulos de la luz solar o la gravedad 2,^3. Describe alteraciones fenotípicas asociadas con estimulaciones mecánicas periódicas, que han sido observadas con frecuencia por los botánicos en tiempos anteriores^4,5. Las gotas de lluvia, el viento, las plantas, los toques animales y humanos, incluso las mordedurasde animales, se consideran diferentes tipos de estímulos mecanonos que activan la señalización de fuerza en las plantas 4,^5. Las características de la thigmomorfogénesis vegetal incluyen el retraso del atornillado, un tallo más corto, un tamaño más pequeño de roseta/hoja en plantas herbáceas, y tallo más grueso en plantas leñosas^6,7,8. Esto es diferente de la respuesta thigmonástica o thigmotrópica que a menudo se encuentra en la planta de Mimosa u otras vides sensibles al mecano, donde estas respuestas táctiles rápidas son más fáciles de observar^1,9,10. La thigmomorfogénesis, por otro lado, es relativamente difícil de observar debido a su lenta respuesta al crecimiento. La thigmomorfogénesis generalmente se observa después de semanas o incluso años de estimulación continua de carga de fuerza. Esta naturaleza única de la respuesta táctil de la planta hace que sea difícil realizar una pantalla genética hacia adelante utilizando la estimulación táctil de la mano humana para aislar a los mutantes resistentes a la señalización de la fuerza táctil de una manera robusta.

Para dilucidar las vías de transducción de la señal de fuerza y los mecanismos moleculares subyacentes a la thigmomorfogénesis^6,11, se han realizado experimentos biológicos moleculares y celulares en los últimos^{6, 12,13,14}. Estos estudios han propuesto que los receptores de señal de fuerza vegetal consisten principalmente en canales iónicos mecanosensibles (MSC) y los complejos MSC atados compuestos por complejos multiméricos de proteínas de expansión de membrana^{11,14 , 15}. El pico transitorio Cytoplasmic Ca²⁺ generado en cuestión de segundos del toque inicial. La estimulación del viento, la lluvia o la gravi-estimulación puede interactuar con los sensores de calcio aguas abajo para transducir las señales de fuerza a eventos nucleares^14,16,17,18. Además de los estudios moleculares y celulares, la pantalla genética delantera con el dedo manual de las plantas ha encontrado que las fitohormonas y los metabolitos secundarios están involucrados en la consiguiente expresión génica inductible del tacto (TCH) después de la carga de fuerza táctil^13,19. Por ejemplo, aos y opr3²⁰ mutantes han sido identificados hasta ahora lejos de los estudios genéticos. Sin embargo, el principal problema asociado con la aplicación de la genética delantera en el estudio de la thigmomorphogenesis sigue siendo el trabajo intensivo necesario para cuantificar el nivel de respuesta táctil y tocar a una gran población de plantas individuales. El problema que consume mucho tiempo también persiste en la pantalla mutante basada en tocar la mano^14,20. Por ejemplo, para completar una ronda de estimulación de la fuerza táctil, una persona necesita tocar 30-60 veces (un toque por segundo) en una planta individual. Con el fin de tener un número suficiente de plantas para el análisis estadístico de fenotipo, 20-50 plantas individuales del mismo genotipo son normalmente necesarias para el proceso de carga de la fuerza táctil. Este régimen de carga de fuerza táctil significa que una persona necesita realizar repetitivamente 600-3,000 toques en un genotipo de elección. Este tipo de toque normalmente necesita repetirse de 3 a 5 rondas al día, lo que equivale a aproximadamente 1.800-15.000 toques de dedo o hisopo de algodón por día por genotipo de plantas. Una persona bien entrenada normalmente se requiere para mantener la fuerza y la fuerza de múltiples toques dentro de un rango deseable a lo largo de muchas rondas de repetición en un día para evitar la gran variación en la fuerza y la fuerza. Como es bien sabido que la thigmomorfogénesis es un proceso saturable y dependiente de la dosis^6,21, fuerza táctil / fuerza se convierte en fundamental para un éxito en la activación de la respuesta táctil de una planta.

Para eliminar la carga de fuerza táctil dependiente de la persona y mantener la aplicación mecánica dentro de un rango de error aceptable^14,por lo tanto, diseñamos una máquina de carga automática de fuerza táctil para reemplazar los toques manipulados a mano. La máquina tiene 4 brazos móviles construidos, cada uno de los cuales está equipado con un cepillo de pelo humano. Esta versión se llama Modelo K1 para especificar su característica de la carga de fuerza táctil del cabello humano. Si se miden 4 genotipos cuantitativamente para su thigmomorfogénesis o respuesta táctil en una sola máquina, se pueden medir 40-48 individuos por genotipo. Cada ronda de repetición táctil (menos de 60 veces de tacto por planta) dura menos de 5 minutos utilizando un brazo robótico ajustable a velocidad móvil. Por lo tanto, las plantas en una máquina táctil Modelo K1 se pueden estimular mecánicamente para múltiples rondas al día, ya sea con una carga de fuerza táctil constante o diferentes niveles de fortalezas como se programó inicialmente.

Arabidopsis thaliana,un organismo vegetal modelo, fue elegido como la especie vegetal objetivo para probar la aplicación de la máquina de carga táctil de pelo totalmente automática. Debido a que hay varios grandes bancos de semillas disponibles para recuperar los diversos germens de mutantes y el tamaño de la floración, Arabidopsis se adapta bien al espacio disponible en el estante de crecimiento montado con la máquina táctil Model K1.

La máquina táctil automática Model K1 consta de tres componentes principales: (1) el bastidor metálico en forma de H compuesto por dos actuadores lineales accionados por correa, (2) brazos metálicos robóticos equipados con cepillos para el cabello y (3) un controlador. Para una máquina táctil Model K1 personalizada, cada módulo de eje X/Y se compone de un carril guía accionado por correa, dos bloques deslizantes (rojo) y un motor paso a paso 57 (preinstalado y desmontable) (Figura1A,B). El actuador horizontal superior permite que el brazo metálico robótico se mueva a la izquierda y a la derecha horizontalmente, el actuador lineal vertical inferior accionado por correa permite que el brazo metálico robótico se mueva hacia arriba y hacia abajo verticalmente (Figura1B, Figura 2A ). Se instalaron cuatro brazos robóticos desmontables en el actuador vertical (Figura1C, Figura 2B). Cuatro cepillos de pelo humano se unieron a cuatro brazos robóticos, respectivamente (Figura1C, Figura 2B). Todas las piezas mecánicas para construir la máquina táctil Modelo K1 en negrita a continuación están marcadas en la Figura 1C (consulte también la Tabla de materiales).

Protocolo

1. Preparación de semillas

NOTA: Las semillas de Arabidopsis de tipo silvestre(Col-0) así como los mutantes de pérdida de función mkk1 y mkk2 utilizados fueron compradas en el Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH).

1. Calcular cuántos individuos de planta de cada genotipo se utilizarán para un análisis estadístico fiable. Preparar un número suficiente de semillas en función de la tasa de germinación de cada línea, por lo general 4-5 veces más de lo que se necesita para un experimento. Asegúrese de que se puede utilizar un número suficiente de plantas de tamaño sano y uniforme para el ensayo de respuesta táctil. Según este protocolo, 300-500 semillas por genotipo se utilizan generalmente para producir 80-90 plantas de tamaño similar.
2. Sumerja las semillas en agua fría y guárdelas en 4 oC (cubiertas con papel de aluminio para mantenerlas en la oscuridad) para la imbibición de semillas. Siembra las semillas 5-7 días después de la imbibición.

2. Crecimiento de la planta

1. Seleccione el suelo adecuado para el crecimiento de la planta (véase la Tabla de Materiales). Evite los grumos grandes y mezcle de forma homogénea.
2. Preparar 24 vasos de plástico: la capacidad de retención es de 207 ml y el diámetro del borde superior es de 7,4 cm. Taladre tres orificios redondos en la parte inferior de una taza para fines de riego.
3. Llene estas tazas de plástico con el suelo mezclado. Deje que el suelo se acumule hasta 1-2 cm más alto que el borde de la copa y aplanar suavemente la superficie del suelo apilado.
4. Transfiera 24 tazas en una bandeja de plástico (21 pulgadas x 10,8 pulgadas x 2,5 pulgadas) y coloque la bandeja en condiciones de luz constante (ver más abajo).
5. Añadir 2,5 L de agua en cada bandeja dos horas antes de la siembra de semillas. Deje que el suelo absorba el agua de los agujeros situados en el fondo de las tazas y espere a que la superficie del suelo caiga al nivel del borde de la copa.
6. Siembra 3-4 semillas en un solo lugar, y 4 puntos distribuidos uniformemente dentro de una taza.
7. Coloque una cubierta de plástico transparente sobre cada bandeja y deje que las semillas germinen durante una semana. A continuación, retire la cubierta y deje que las plántulas crezcan durante otra semana.
8. Retire las plantas adicionales adelgazando y mantenga 4 individuos de plantas de tamaño similar en cada taza 9-10 días después de la siembra de semillas.
9. Irrigar las plantas con 1,5 L de agua cada dos días después de que las semillas germinan.

3. Condición de crecimiento

1. Ajustar la temperatura de la cámara de crecimiento a 23,5 oC y humedad entre el 35 y el 45 %.
2. Ajuste la intensidad de la luz entre 180 y 240 ém^-2s^-1 (medido por el radiómetro de investigación IL 1700, Luz Internacional)¹⁴. La radiación activa fotosintética es de 90 a 120 e-m^-2s^-1.
3. Ajuste la condición de luz a constante de 24 h.

4. La construcción de la máquina de carga de fuerza táctil

NOTA: Esta máquina robótica de carga de fuerza táctil para el cabello (Modelo K1) está diseñada para servir a los propósitos tanto de la detección mutante de señalización de fuerza táctil como de la generación de thigmomorfogénesis vegetal (Figura1, Figura 2).

1. Módulos de preinstalación (desmontables, Figura 1C)
   1. Instale dos bloques de deslizamiento (I) y un motor paso a paso 57 (II) en el módulo de guía-carril del eje X/Y (III/V).
   2. Instale dos bloques deslizantes (I) en la viga auxiliar del eje X/Y (IV/VI).
2. Instalación de otras piezas mecánicas (Figura 1C)
   1. Fije el módulo de guía-carril del eje X (III) y la viga auxiliar del eje X (IV) juntas mediante el montaje de dos placas de unión (VII) en cada extremo de la guía-carril.
   2. Fije el módulo de guía-carril del eje Y (V) en el dorsal de dos bloques de deslizamiento (eje X) en una posición de cruce mediante el montaje de dos placas de unión (VIII) en el medio.
   3. Fije la viga auxiliar del eje Y (VI) en la dorsal de los otros dos bloques de deslizamiento (eje X) en una posición de cruce mediante el montaje de dos placas de unión (VIII) en el medio.
   4. Montar el soporte de brazos robóticos (IX) en la parte delantera de dos bloques deslizantes (eje Y) en una posición de cruce con una placa de unión (Figura2A).
   5. Montar 4 cepillos para el cabello (X) en brazos robóticos (IX) con abrazaderas (Figura2B).

5. Ajuste de la máquina de carga Touch-Force

NOTA: Todos los parámetros de control para configurar la máquina táctil Modelo K1 en negrita a continuación se muestran en el panel de control (Figura2F).

1. Instale cepillos táctiles para el cabello en los brazos robóticos. Utilice una regla de acero de 330 mm de largo como soporte para fijar una capa de pelo humano (3.600-4.600 pelos/cepillo) uniformemente. La longitud del cabello es de 126 mm (Figura1C).
2. Fije esas reglas de acero en los brazos robóticos con dos abrazaderas metálicas.
3. Establezca primero la altura de los brazos de la máquina a lo largo de la dimensión vertical (eje Y). Pulse Jog F+ para subir y Jog R- para bajar los brazos y cepillos robóticos. Deje que la punta de los cepillos para el cabello 0,5 cm sea más baja que el borde de la taza. Pulse el ajuste CERO. Pre-ejecutar la máquina 1-2 ciclos para asegurarse de que todos los individuos de la planta están siendo tocados. Ajusta y calibra los cepillos y las puntas del cabello a la misma altura todos los días durante todo el período de contacto.
4. Utilice una báscula electrónica para medir la fuerza táctil (carga vertical) y mantener el nivel de fuerza táctil a 1-2 mN¹⁴.
5. Establezca manualmente la posición inicial de los brazos de la máquina a lo largo de la cota horizontal (eje X). Permita que los cepillos de pelo cuelguen en el borde de cada bandeja y asegúrese de que no se toque ninguna planta antes de que comience el experimento conmovedor. Pulse Jog F+/Jog R- para mover el brazo de la máquina horizontalmente poco a poco para establecer la posición inicial.
6. Establezca la distancia de desplazamiento del cepillo de cabello en la dimensión horizontal (eje X) en 365 mm pulsando el botón Viaje. Pulse Inc. F+/Inc. R- para mover los brazos de la máquina para obtener una distancia de viaje completa y asegurarse de que todas las plantas tratadas están siendo tocadas durante todo el experimento de tocar.
7. Ajuste la velocidad de movimiento a lo largo del eje X de los brazos de la máquina a 5.000 mm/min pulsando el botón Velocidad automática. Mantenga la misma velocidad de movimiento durante todo el experimento de contacto.
8. Ajuste el tiempo de contacto en 20 pruebas pulsando el botón Ciclo menor. Mantenga el mismo número de toques por ronda durante todo el experimento conmovedor.
   NOTA: Un ciclo menor es igual a dos distancias de viaje, lo que significa que los brazos de la máquina se moverán de la posición inicial a la posición final y luego de vuelta a la posición inicial. Un ciclo menor genera dos toques. Los cepillos para el cabello tocan las plantas 40 veces dentro de 20 ensayos (2 toques x 20 ensayos a 40 toques). El 40-touch se define como una ronda de carga de fuerza táctil.
9. Establezca el intervalo de repetición de la touch-round a 480 min por día pulsando el botón Período mayor. Mantenga la misma frecuencia de rondas táctiles durante todo un experimento conmovedor.
   NOTA: Esto permite que los cepillos de pelo toquen las plantas durante 3 rondas al día, y el tiempo de intervalo entre cada ronda es de 480 min (8 h). El número azul mostrado representa el tiempo de intervalo de cada ronda táctil. La máquina iniciará una nueva ronda de toque automáticamente cuando la cuenta regresiva por debajo (número rojo) se convierta a 0000.
10. Ajuste el Ciclo Mayor en 12 ensayos, lo que significa que la máquina tocará las plantas durante 12 rondas en un período de 4 días automáticamente. Este ajuste de 12 ensayos se utiliza para evitar errores humanos al saltarse un día de contacto.
11. Pulse el botón de inicio para iniciar el programa predefinido. La máquina táctil Model K1 realizará automáticamente la carga de fuerza táctil de acuerdo con la configuración.

6. Recopilación y análisis de datos fisiológicos

1. Días para atornillar: Registre el día de atornillado de cada planta individualmente dentro de un experimento conmovedor. El atornillado es un símbolo de que una planta cambia su etapa de crecimiento de la fase vegetativa a la fase reproductiva. En Arabidopsis, el día de atornillado se define como el número de días utilizados por una planta para que su primer tallo de inflorescencia alcance 1 cm de longitud.
   NOTA: Bajo la condición de crecimiento descrita anteriormente, el atornillado de plantas de tipo silvestre normalmente se inicia de 19 a 23 días después de la siembra de semillas y termina a los 28-32 días.
2. Radio de roseta: Mida la distancia desde el centro de la roseta hasta la punta de la hoja más larga.
   1. Tome fotos de toda la bandeja desde la parte superior. Tome fotos del grupo de control y del grupo tratado táctil por separado.
   2. Descargue el software adecuado. Utilice el software descargado gratis ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) por ejemplo.
   3. Abra un archivo de foto, utilice la función de zoom para ampliar la foto a un tamaño adecuado.
   4. Elija la herramienta Recta para dibujar una línea recta entre el centro de la roseta y la punta de una hoja más larga para medir el radio de la roseta.
   5. Seleccione una planta y pulse el botón izquierdo para dibujar una línea recta desde el centro de la roseta hasta la punta de hoja más larga.
   6. Elija la función Analizar-Medida o pulse Ctrl + M para analizar la distancia de línea.
   7. Seleccione una taza y repita los dos pasos anteriores para analizar el diámetro de cada taza de plástico al mismo tiempo. Utilice estos datos para realizar el cálculo para eliminar el sesgo resultante de la toma de fotos.
      NOTA: La ecuación es:
      Ra /D_a á_{R m}/D_m
      (R_a, el radio Rosette real de una planta; Da , el diámetro real de la copa de plástico; R_m, el radio Rosette medido de la misma planta determinado por un software; D_m, el diámetro medido de la copa de plástico que se utiliza para el cultivo de la misma planta)
3. Zona de roseta: Mida el área horizontal de la superficie de 2 dimensiones de las hojas de roseta.
   1. Retire la inflorescencia sin afectar el resto de órganos de roseta.
   2. Tome fotos de la parte superior de cada planta junto con una regla de escala colocada cerca.
   3. Utilice un plugin gratuito de ImageJ, Rosette Tracker y siga el protocolo publicado anteriormente²².

Resultados

La máquina de carga automática de fuerza táctil para el cabello
Para la observación de cambios morfológicos en las plantas, tanto las condiciones de crecimiento reproducibles como los métodos de tratamiento son clave para obtener resultados repetibles. Este cribado mutante de señalización de fuerza táctil automática y de alto rendimiento es logrado por la máquina de carga de fuerza táctil para el cabello de nueva construcción, Modelo K1 (Figura1,

Discusión

La thigmomorfogénesis es una respuesta compleja de crecimiento de la planta hacia perturbaciones mecánicas, que implica una red de señalización celular y acción de las fitohormonas. Es una consecuencia de la evolución adaptativa de las plantas para sobrevivir en las condiciones ambientales indeseables^25,26. El tacto mecánico, especialmente el toque de los dedos humanos y el toque de hisopo de algodón de mano, han sido seleccionados para estudiar estos cam...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 hair brushes		customized
4 robot arms with one holder		customized	1000 mm length holder and 560 mm length robot arm
57 stepper motor		57HS22-A
All purpose potting soil	Plantmate, Hong Kong
Arabidopsis plant seeds	Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH		For arabidopsis seed purchase
BIO-MIX potting substratum	Jiffy Products International BV, the Netherlands	1000682050	Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and  BIO-MIX is 1:2
IL 1700 research radiometer	International Light, Newburyport, MA		The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/download.html		Free downloaded software
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited	Shenzhen, China		For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase
Junction plate of the slide block			To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks
Junction plate of the X axis module		customized	To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder
Slide block
WDT4045 X axis guide-rail module		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
WDT4045 Y axis guide-rail module		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
X axis auxiliary girder		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks
Y axis auxiliary girder		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks