Evaluación de la Reserva de Flujo Coronario Después de la Reperfusión de Isquemia Miocárdica en Ratas

Resumen

La reserva de flujo coronario (CFR), se define como la relación entre el flujo sanguíneo coronario máximo y el flujo sanguíneo coronario en reposo. Presentamos un protocolo para evaluar la CFR en ratas a través de ultrasonido, que ofrece la oportunidad de predecir factores de riesgo cardiovascular en ausencia de enfermedad coronaria obstructiva.

Resumen

La enfermedad de las arterias coronarias es la principal causa de muerte en todo el mundo. Después de un infarto agudo de miocardio, la intervención temprana y exitosa del miocardio a través de la recanalización de la arteria coronaria es la estrategia más eficaz para reducir el tamaño del miocardio isquémico. La microvasculatura coronaria no se puede visualizar e imágenina invivo, pero hay varias técnicas invasivas y no invasivas que se pueden utilizar para evaluar parámetros que dependen directamente de la función microvascular coronaria. La función endotelial después de la reperfusión de isquemia se puede evaluar también a nivel de la circulación coronaria a través de la reserva de flujo coronario (CFR). En este estudio, la velocidad máxima de las arterias coronarias descendentes anteriores izquierdas (LAD) se midió en ratas in vivo a través de la Ecocardiografía Doppler Transtorácica durante el descanso y el desafío de estrés (inducido por Dobutamine). Un corazón normal puede aumentar su flujo sanguíneo coronario hasta cuatro veces por encima de los valores de reposo durante la inducción del estrés. Después de la reperfusión de isquemia, encontramos un CFR significativamente disminuido, que se puede utilizar como un marcador de disfunción microvascular coronaria. CFR ha abierto una ventana sobre la importancia de la disfunción microvascular y se ha demostrado para predecir el riesgo cardiovascular independientemente de si la enfermedad obstructiva grave está presente.

Introducción

La reperfusión de isquemia miocárdica (IR) es una afección en la que el suministro de sangre está restringido al corazón, seguido de la restauración de la perfusión y la reoxigenación simultánea¹. La oclusión de las arterias coronarias puede ser causada por una ruptura de la placa de émbolo o colesterol, lo que resulta en un desequilibrio grave de la oferta y la demanda metabólica, causando hipoxia tisular. La terapia de reperfusión ha observado la recuperación del miocardio en peligro, mejorar la función ventricular izquierda y mejorar la supervivencia en pacientes con infarto agudo de miocardio. Sin embargo, después de la recanalización de la arteria coronaria, las anomalías funcionales de los vasos coronarios pequeños pueden ocurrir^2,3,4,5. Una proporción significativa de pacientes, tal vez hasta un 40%, no recuperan la perfusión microvascular y miocárdica a pesar de la restauración del flujo coronario. La visualización y evaluación de la microvasculatura coronaria puede ser difícil in vivo, pero hay una serie de técnicas invasivas y no invasivas que se pueden utilizar para evaluar parámetros directamente dependiendo de la función microvascular coronaria^{6 ,7}. Además, la función endotelial se puede evaluar a nivel de la circulación coronaria a través del CFR⁵.

La ecocardiografía doppler transtorácica es una herramienta no invasiva que nospermite estudiar la velocidad del flujo de las arterias coronarias y CFR 5. CFR representa la relación entre el flujo sanguíneo coronario máximo y el flujo sanguíneo coronario en reposo⁸. Durante el desafío de estrés, un corazón normal aumenta el flujo sanguíneo coronario hasta cuatro veces por encima del valor de reposo. El riesgo cardiovascular aumenta cuando se reduce el CFR⁹. Ishihara et al mostraron que el CFR estaba gravemente deteriorado inmediatamente después de la angioplastia coronaria⁵. En ausencia de estenosis de la arteria coronaria, el CFR disminuye durante la disfunción microvascular coronaria y está presente en aproximadamente la mitad de los pacientes con enfermedad arterial coronaria estable^10.

El objetivo general de este método es la visualización no invasiva de la función de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) en ratas a través de ecocardiografía, que puede utilizarse para calcular la CFR. Esto ofrece una importante herramienta de evaluación para diagnosticar la disfunción microvascular y evaluar posibles tratamientos terapéuticos.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Louisville (protocolo 18223 aprobado por la IACUC) y la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio¹¹.

1. Animales

1. Utilice 344 ratas Fisher 344 de 4 meses de edad (BW-150-180 g) para el estudio.

2. Imágenes por ultrasonido antes de la cirugía iral

1. Anestetizar la rata con isoflurano - cámara de inducción al 5% con 1.5–2.0 L/min O₂ flujo seguido de 1.5–2.0% con 1.5–2.0 L/min O₂ flujo. Esta anestesia se mantiene durante todo el experimento, durante las etapas de reposo y estrés.
2. Coloque al animal en posición supina y ate el tórax. Mantenga la temperatura corporal a 37-38 oC utilizando la plataforma de calentamiento incorporada. Supervise la frecuencia cardíaca utilizando el software.
   NOTA: La anestesia adecuada es crucial para mantener la frecuencia cardíaca a tasas fisiológicas normales (entre 295-350 latidos/min).
3. Aplique pomada de ventosa oftálmica para prevenir la sequedad de los ojos antes de la toma de imágenes.
4. Realice ecocardiografía utilizando sonda lineal de 13 a 24 MHz (por ejemplo, MS250) (Figura1A).
5. Coloque el animal en la posición supina en la plataforma calentada. Asegúrese de que la anestesia se controla a través del cono nasal. A continuación, coloque la sonda para obtener la vista parasternal de eje corto (PSAX) utilizando el sistema ferroviario (Figura1B).
6. Mover la sonda en la dirección rostral desde el PSAX, localizar la arteria pulmonar (Figura 1B).
7. Mueva la sonda ligeramente en la dirección caudal de la arteria pulmonar para ver el LAD y almacenar la imagen.
   NOTA: El LAD es difícil de encontrar sin Color Doppler, por lo que las imágenes en modo B del LAD no siempre son posibles.
8. Cuando las diferencias individuales dificultan la localización de la arteria coronaria LAD, siga la técnica que se menciona a continuación:
   1. Mueva la sonda lateral a la arteria pulmonar.
   2. Angulo la plataforma para que el animal esté inclinado, invertido o ligeramente hacia el lado derecho para que el ventrículo izquierdo sea más fácilmente visible con la sonda.
9. Una vez capturada o almacenada en el cine de la imagen en modo B, haga clic en color Doppler en la pantalla táctil (figura1C). Visualizar la arteria coronaria (flecha blanca indica LAD) en el eje corto (Figura1C). El color rojo, como se ve en tiempo real, es indicativo de la dirección del flujo (es decir, el flujo sanguíneo es hacia la sonda).
10. Después de visualizar el LAD en un modo de color-Doppler, cambie el modo al modo de onda de pulso (PW). Busque la presencia de una línea indicadora amarilla en la arteria coronaria (Figura2A).
11. Coloque la línea PW amarilla en el centro de la arteria coronaria. Asegúrese de que el ángulo es paralelo a la dirección del flujo.
    NOTA: La velocidad del flujo depende en gran medida del ángulo de la línea PW, así que asegúrese de que coincida con el ángulo de la sonda en pantalla con el ángulo del LAD. Utilice la pantalla táctil para ajustar el ángulo; El ángulo del PW debe ser inferior a 60o.
12. Utilice cine store para capturar la velocidad del flujo coronario LAD en reposo en el pico de diastole como formas de onda (Figura2B).
13. Después de obtener la velocidad de flujo LAD en reposo, mida la velocidad máxima de flujo de LAD durante la tensión para calcular el CFR. Para medir la velocidad máxima de flujo durante la tensión, infundir Dobutamina a una dosis de 20 g/kg/min a través de la vena de cola⁸ (Figura2C).
    NOTA: La perfusión de dobutamina no debe ser superior a 8 min. Utilice una bomba de perfusión y ajuste el diámetro de la bomba de perfusión a 14,43 para la jeringa BD de 10 ml.
    1. Utilice el conjunto de mariposas de infusión 25-G para la cannulación de la vena de cola. Para colocar la aguja de perfusión, coloque una pequeña tira de gasa alrededor de la base de la cola de la rata, luego agarre con hemostats y gire el torniquete para aplicar presión y hacer que la vena se agrande.
    2. Coloque la aguja mientras está conectada directamente a la jeringa de Dobutamine.
       NOTA: Tenga especial cuidado de no introducir accidentalmente el medicamento al extraer sangre para asegurar la colocación adecuada de la aguja en la vena de la cola. Además, asegúrese de evitar introducir una burbuja de aire en la vena, ya que una embolia puede ser fatal para el animal.
    3. Una vez colocada la aguja, estabilice la con un pegamento y un trozo de cinta quirúrgica, asegurando la línea de perfusión a la cola.
    4. Retire los hemostats y el torniquete para recuperar el flujo.
    5. Coloque la jeringa de dobutamina en la bomba de perfusión y configórla para inyectar 20 g/kg/min.
    6. Durante la perfusión de dobutamina, controle cuidadosamente el pico de LAD y la frecuencia cardíaca. Grabar periódicamente los picos LAD PW en el modo Doppler, especialmente cuando aumenta en respuesta a Dobutamine.
       NOTA: El desafío de estrés inducido por Dobutamine hace que el corazón trabaje más duro; esto a menudo resulta en el movimiento del corazón y el LAD. Esté preparado para mover el animal, la sonda, o ambos con el fin de mantener el LAD a la vista.
    7. Después de que los picos de LAD y la frecuencia cardíaca se hayan estancado durante el desafío, detenga la infusión de dobutamina, retire el conjunto de infusión de vena de cola y retire al animal de la plataforma. Permita que el animal se recupere en su jaula de origen.
14. Seleccione la herramienta Peak Vel para obtener las velocidades diastólicas máximas de las imágenes que se muestran en las figuras 2B y C.
15. Calcule el índice CFR como la relación entre la velocidad de flujo diastólica máxima de tensión LAD (Dobutamina) y la velocidad de flujo diastólica máxima de LAD en reposo (Figura2A).

3. Lesión por reperfusión de isquemia

1. Rata de anestesia con isoflurano - cámara de inducción al 5% con 1,5–2,0 L/min O₂ de flujo seguido de 1,5–2,0% con 1,5–2,0 L/min O₂ de flujo.
2. Confirme la profundidad de la anestesia por la falta del reflejo de retirada del pedal. Use pomada de ventosa oftálmica en los ojos para evitar la sequedad. Mantener la temperatura corporal adecuada de 37-38 oC utilizando una almohadilla de calentamiento o un controlador de temperatura animal.
3. Administrar Meloxicam prequirúrgico, 5 mg/kg por vía intramuscular, 15 minutos antes de la cirugía, seguido de 2 ml de bolo subcutáneo de 0,9% de salina para prevenir la deshidratación durante la cirugía. Se utilizaron guantes e instrumentos estériles, y se emplearon técnicas asépticas. Usando la fuente de luz de fibra óptica, intubate la rata usando el catéter IV del calibre 18 y conéctese al respirador.
4. Ligate LAD usando 8-0 sutura monofilamento a través de una abertura de 15 mm en el espacio intercostal 5. Ate un nudo liso y dejar durante 30 min. Confirmar visualmente la isquemia en todas las ratas a través de la decoloración de la superficie del corazón¹². Liberar la ligadura después de 30 min y verificar la reperfusión por el enrojecimiento de la zona previamente decolorada del músculo del corazón durante 1-2 min¹².
5. Cierre la caja torácica con sutura absorbible 4-0 con un patrón de sutura interrumpido, luego cierre la piel usando la sutura de seda no absorbible 5-0 con patrón de sutura continua.
6. Retire el animal de la anestesia. Permita que el animal se recupere en la jaula de casa. 5mg/kg Meloxicam se inyectó intramuscular cada 24 horas antes de eutanasiar al animal (72 horas después de la cirugía).

4. Imágenes por ultrasonido después de la cirugía iral

1. 72 h después de la cirugía irrrobo, mida el flujo coronario y el CFR de nuevo. Compare las mediciones con las mediciones anteriores a IR. Repita los pasos 2.1 a 2.15 como se describió anteriormente.

Resultados

Para este estudio, utilizamos 12 hembras Fisher 344 ratas. Realizamos una prueba de esfuerzo con dobutamina y medimos la velocidad de la arteria coronaria LAD antes y 72 horas después de la cirugía de infrarrojos. Antes de la cirugía de irrradios, la velocidad de la arteria coronaria ladánírica en reposo se midió como 423 x 59 mm/s, lo que se incrementó después de la perfusión de dobutamina (1005 a 77 mm/s) (Figura3A). Después de 72 h de reperfusió...

Discusión

Los principales hallazgos del presente estudio son que IR aumenta la velocidad de la arteria coronaria LAD en reposo y afecta a la CFR, incluso en ausencia de cualquier estenosis angiográfica residual.

Comprender la fisiología coronaria es una parte esencial de la toma de decisiones clínicas para que los cardiólogos traten la enfermedad de las arterias coronarias. CFR es uno de los parámetros funcionales importantes en lacomprensión de la fisiopatología de la mic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	BD Syringe	302995
250S 13–24 MHz linear probe	FUJIFILM VisualSonics Inc
Dobutamine hydrochloride	Sigma	D0676-10mg
Isoflurane	RRC	27376
Legato 100 Syringe pump	KD Scientific	788100
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics Inc
Winged infusion set, 27G x 1/2",	Medline.com	TMOSV27ELZ