Avaliação da reserva de fluxo coronariano após reperfusão de isquemia miocárdica em ratos

Resumo

A reserva de fluxo coronariano (CFR) é definida como a razão do fluxo sanguíneo coronariano máximo para o fluxo sanguíneo coronariano em repouso. Apresentamos um protocolo de avaliação do CFR em ratos via ultrassonografia, que oferece a oportunidade de prever fatores de risco cardiovasculares na ausência de doença coronariana obstrutiva.

Resumo

A doença arterial coronariana é a principal causa de morte em todo o mundo. Após infarto agudo do miocárdio, a intervenção miocárdica precoce e bem-sucedida via recanalização da artéria coronária é a estratégia mais efetiva para a redução do tamanho do miocárdio isquêmico. A microvasculatura coronária não pode ser visualizada e imaged in vivo, mas existem várias técnicas invasivas e não invasivas que podem ser utilizadas para avaliar parâmetros que dependem diretamente da função microvascular coronariana. A função endotelial após a reperfusão de isquemia pode ser avaliada também ao nível da circulação coronária através da reserva de fluxo coronariano (CFR). Neste estudo, a velocidade de pico das artérias coronárias de descida anterior esquerda (LAD) foi mensurada em ratos in vivo via ecocardiografia transtorácica Doppler durante o desafio de repouso e estresse (induzido pela Dobutamina). Um coração normal pode aumentar o seu fluxo sanguíneo coronariano até quatro vezes acima dos valores de repouso durante a indução do stress. Após a reperfusão da isquemia, nós encontramos um CFR significativamente diminuído, que possa ser usado como um marcador da deficiência orgânica microvascular coronária. O CFR abriu uma janela sobre a importância da disfunção microvascular e demonstrou prever o risco cardiovascular independentemente de a doença obstrutiva grave estar presente.

Introdução

A reperfusão de isquemia miocárdica (IR) é uma condição em que o suprimento sanguíneo é restrito ao coração, seguido da restauração da perfusão e da reavaliação simultânea¹. A oclusão das artérias coronárias pode ser causada por uma ruptura da placa do êmbolo ou do colesterol, que resulte em um desequilíbrio severo da fonte e da demanda metabólicas, causando a hipóxia do tecido. O salvamento do miocárdio comprometido, melhora a função ventricular esquerda, e aumenta a sobrevivência nos pacientes com infarction miocárdico agudo foram observados pela terapia do reperfusão. Entretanto, após a recanalização da artéria coronária, anormalidades funcionais de pequenos vasos coronarianos podem ocorrer^2,3,4,5. Uma proporção significativa de pacientes, talvez até 40%, não recupera a perfusão microvascular e miocárdica, apesar da restauração do fluxo coronariano. A visualização e a avaliação da microvasculatura coronária podem ser difíceis in vivo, mas há um número de técnicas invasoras e não invasoras que podem ser usadas para avaliar diretamente parâmetros dependendo da função microvascular coronária^{6 ,7}. Além disso, a função endotelial pode ser avaliada ao nível da circulação coronária através do CFR⁵.

A Ecocardiografia transtorácica Doppler é uma ferramenta não invasiva que nos permite estudar a velocidade de fluxo da artéria coronária e CFR⁵. O CFR representa a razão do fluxo sanguíneo coronariano máximo para o fluxo sanguíneo coronariano em repouso⁸. Durante o desafio de stress, um coração normal aumenta o fluxo sanguíneo coronariano até quatro vezes acima do valor de repouso. O risco cardiovascular aumenta quando o CFR é diminuído⁹. Ishihara et al mostraram que o CFR foi severamente prejudicado imediatamente após a angioplastia coronariana⁵. Na ausência de estenose da artéria coronária, o CFR diminui durante a disfunção microvascular coronariana e está presente em cerca de metade dos pacientes com doença arterial coronariana estável¹⁰.

O objetivo geral deste método é a visualização não invasiva da função da artéria coronária descendente anterior (LAD) em ratos via ecocardiografia, que pode ser utilizada para o cálculo do QCR. Isto oferece uma ferramenta importante da avaliação para diagnosticar a deficiência orgânica microvascular e avaliar tratamentos terapêuticos potenciais.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Louisville (IACUC-protocolo aprovado 18223) e o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório¹¹.

1. os animais

1. Use 4-month-old fêmeas Fisher 344 ratos (BW ~ 150-180 g) para o estudo.

2. imagem latente do ultra-som antes da cirurgia do IR

1. Anestesie o rato com câmara de indução de isoflurano a 5% com 1,5 – 2,0 L/min O₂ fluxo seguido de 1,5 – 2,0% com 1,5 – 2,0 L/min o₂ Flow. Esta anestesia é mantida durante todo o experimento, durante os estágios de repouso e estresse.
2. Coloque o animal em uma posição supina e raspar o tórax. Mantenha a temperatura do corpo a 37-38 ° c usando a plataforma de aquecimento incorporada. Monitore a frequência cardíaca usando o software.
   Nota: a anestesia adequada é crucial para manter a frequência cardíaca a taxas fisiológicas normais (entre 295-350 batimentos/min).
3. Aplique a pomada do veterinário oftálmica para impedir o secura dos olhos antes da imagem latente.
4. Realize ecocardiografia usando sonda linear de 13 – 24 MHz (por exemplo, MS250) (Figura 1a).
5. Coloque o animal na posição supina na plataforma aquecida. Assegure-se de que a anestesia é controlada através do cone do nariz. Em seguida, posicione a sonda para obter a visão de eixo curto paraesternal (PSAX) usando o sistema ferroviário (Figura 1b).
6. Movendo a sonda na direção rostral do PSAX, localize a artéria pulmonar (Figura 1b).
7. Mova a sonda levemente na direção caudal da artéria pulmonar para ver o LAD e armazene a imagem.
   Nota: o LAD é difícil de encontrar sem Doppler de cor, assim que as imagens do B-modo do LAD não são sempre possíveis.
8. Quando as diferenças individuais dificultam a localização da artéria coronária LAD, siga a técnica mencionada abaixo:
   1. Mova a sonda lateral para a artéria pulmonar.
   2. Ângulo da plataforma de modo que o animal é inclinado, invertido, ou ligeiramente para o lado direito para que o ventrículo esquerdo é mais prontamente visível com a sonda.
9. Uma vez que a imagem no modo B é capturada ou Cine-armazenada, clique no Doppler colorido na tela sensível ao toque (Figura 1C). Visualize a artéria coronária (seta branca indica LAD) no eixo curto (Figura 1C). A cor vermelha, como visto em tempo real, é indicativa da direção do fluxo (ou seja, o fluxo sanguíneo é para a sonda).
10. Depois de Visualizar LAD em um modo Color-Doppler, mude o modo para o modo de onda de pulso (PW). Procure a presença de uma linha indicadora amarela na artéria coronária (Figura 2a).
11. Coloque a linha PW amarela no meio da artéria coronária. Assegure-se de que o ângulo esteja paralelo à direção do fluxo.
    Nota: a velocidade do fluxo é altamente dependente do ângulo da linha PW, por isso não se esqueça de corresponder ao ângulo da sonda na tela com o ângulo do LAD. Use a tela sensível ao toque para ajustar o ângulo; O ângulo PW deve ser inferior a 60 °.
12. Use a loja Cine para captar a velocidade do fluxo coronariano de repouso do Lad na diástole de pico como formas de onda (Figura 2b).
13. Após a obtenção da velocidade de fluxo do LAD do descanso, meça a velocidade máxima do fluxo de LAD durante o esforço para calcular o CFR. Para medir a velocidade máxima de fluxo durante o estresse, inutilizar dobutamina em uma dose de 20 μg/kg/min via veia cauda⁸ (Figura 2C).
    Nota: a perfusão de dobutamina não deve ser superior a 8 min. Use uma bomba de infusão e ajuste o diâmetro da bomba de infusão para 14,43 para a seringa de BD 10 mL.
    1. Use a borboleta da infusão de 25 G ajustada para o cannulation da veia de cauda. Para colocar a agulha de infusão, coloque uma pequena faixa de gaze em torno da base da cauda do rato, em seguida, agarrar com hemostats e torcer o torniquete para aplicar a pressão e fazer com que a veia para ampliar.
    2. Coloque a agulha enquanto estiver directamente ligada à seringa de dobutamina.
       Nota: Tome o cuidado extra para não introduzir acidentalmente a medicina ao elaborar o sangue para assegurar a colocação apropriada da agulha na veia de cauda. Além disso, certifique-se de evitar a introdução de uma bolha de ar na veia, como uma embolia pode ser fatal para o animal.
    3. Uma vez que a agulha é colocada, estabilizá-lo com uma cola e um pedaço de fita cirúrgica, fixando a linha de infusão para a cauda.
    4. Remova os hemostats e o torniquete para recuperar o fluxo.
    5. Coloque a seringa de dobutamina na bomba de perfusão e coloque-a para injetar 20 μg/kg/min.
    6. Durante a infusão de dobutamina, monitore cuidadosamente o pico do LAD e a frequência cardíaca. Registre periodicamente os picos de LAD PW no modo Doppler, especialmente quando ele aumenta em resposta à dobutamina.
       Nota: o desafio de stress induzido pela Dobutamina provoca o coração a trabalhar mais; isso muitas vezes resulta no movimento do coração e do LAD. Esteja preparado para mover o animal, a sonda, ou ambos, a fim de manter o LAD em vista.
    7. Depois que os picos de LAD e a freqüência cardíaca plateaued durante o desafio, param a infusão do dobutamine, removem o jogo da infusão da veia de cauda e removem o animal da plataforma. Permita que o animal recupere em sua gaiola Home.
14. Selecione a ferramenta Peak vel para obter as velocidades diastólicas máximas das imagens mostradas na Figura 2b e C.
15. Calcule o índice de CFR como a razão da velocidade de fluxo diastólico de pico de estresse do LAD (dobutamina) para a velocidade de fluxo diastólico de pico do LAD em repouso (Figura 2a).

3. lesão de reperfusão de isquemia

1. Anestesiado rato com câmara de indução isoflurano a 5% com 1,5 – 2,0 L/min O₂ fluxo seguido de 1,5 – 2,0% com 1,5 – 2,0 L/min o₂ Flow.
2. Confirme a profundidade da anestesia pela falta do reflexo de retirada do pedal. Use pomada veterinária oftalfólica sobre os olhos para evitar a secura. Mantenha a temperatura corporal adequada de 37-38 ° c usando uma almofada de aquecimento ou um controlador de temperatura animal.
3. Administrar o Meloxicam pré-cirúrgico, 5 mg/kg por via intramuscular, 15 min antes da cirurgia, seguido de 2 mL de bolus subcutâneo de 0,9% de soro fisiológico para prevenir a desidratação durante a cirurgia. Foram utilizadas luvas e instrumentos estéreis e empregadas técnicas assépticas. Usando a fonte luminosa da fibra óptica, o rato do entubar usando o cateter do calibre 18 IV e conecta ao ventilador.
4. Ligate LAD usando 8-0 sutura do monofilamento com a abertura de 15 milímetros no 5^th espaço intercostal. Amarre um nó liso e deixe por 30 min. Confirme visualmente a isquemia em todos os ratos através da descoloração da superfície do coração¹². Libere a ligadura após 30 min e verifique a reperfusão pelo avermelhamento da área previamente descolorida do músculo cardíaco por 1-2 min¹².
5. Feche a caixa torácica usando 4-0 sutura absorvível com um padrão de sutura interrompida, em seguida, feche a pele usando 5-0 sutura de seda não absorvível com padrão de sutura contínua.
6. Retire o animal da anestesia. Permita que o animal recupere na gaiola Home. 5mg/kg o Meloxicam foi injetado por via intramuscular a cada 24 horas antes da eutanização do animal (72horas após a cirurgia).

4. imagem latente do ultra-som após a cirurgia do IR

1. 72 h após a cirurgia de IR, medir o fluxo coronariano e CFR novamente. Compare as medições antes das medições do IR. Repita as etapas 2,1 a 2,15 conforme descrito acima.

Resultados

Para este estudo, foram utilizados 12 ratos fêmeas Fisher 344. Nós executamos um teste de esforço com dobutamine e medimos a velocidade da artéria coronária de LAD antes e 72 horas após a cirurgia do IR. Antes da cirurgia do IR, a velocidade de repouso da artéria coronária de LAD foi medida como 423 ± 59 milímetros/s, que foi aumentada após a infusão do dobutamine (1005 ± 77mm/s) (Figura 3a). Após 72 h de reperfusão de isquemia, a velocidade da...

Discussão

Os principais achados do presente estudo são que o IR aumenta a velocidade da artéria coronária em repouso e prejudica a CFR, mesmo na ausência de qualquer estenose angiográfica residual.

Compreender a fisiologia coronária é uma parte essencial da tomada de decisão clínica para que os cardiologistas tratem a doença arterial coronariana. O CFR é um dos importantes parâmetros funcionais na compreensão da fisiopatologia da microcirculação coronariana⁷

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	BD Syringe	302995
250S 13–24 MHz linear probe	FUJIFILM VisualSonics Inc
Dobutamine hydrochloride	Sigma	D0676-10mg
Isoflurane	RRC	27376
Legato 100 Syringe pump	KD Scientific	788100
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics Inc
Winged infusion set, 27G x 1/2",	Medline.com	TMOSV27ELZ