Valutazione della riserva del flusso coronario dopo la miaocardia Ischemia Reperfusione nei ratti

Riepilogo

La riserva di flusso coronarica (CFR) è definita come il rapporto tra il flusso massimo del sangue coronario e il flusso sanguigno coronarica a riposo. Vi presentiamo un protocollo per la valutazione del CFR nei ratti tramite ultrasuoni, che offre l'opportunità di prevedere i fattori di rischio cardiovascolare in assenza di malattia coronarica ostruttiva.

Abstract

La malattia coronarica è la principale causa di morte in tutto il mondo. Dopo un acuto infarto miocardico, l'intervento miocardico precoce e di successo attraverso la ricanalizzazione dell'arteria coronaria è la strategia più efficace per ridurre le dimensioni del miocardio ischemico. La microvascolatura coronarica non può essere visualizzata e immaginata invivo, ma ci sono diverse tecniche invasive e non invasive che possono essere utilizzate per valutare parametri che dipendono direttamente dalla funzione microvascolare coronarica. La funzione endoteliale dopo la riperfusione di ischemia può essere valutata anche a livello della circolazione coronarica attraverso la riserva coronarica (CFR). In questo studio, la velocità di picco delle arterie coronarie di discesa anteriore sinistra (LAD) è stata misurata in ratti in vivo tramite ecocardio tratoracica Doppler durante la pausa e la sfida di stress (indotta dalla dobutamina). Un cuore normale può aumentare il suo flusso di sangue coronavo fino a quattro volte sopra i valori di riposo durante l'induzione dello stress. A seguito della reperfusione di ischemia, abbiamo trovato un CFR significativamente diminuito, che può essere utilizzato come marcatore di disfunzione microvascolare coronarica. Il CFR ha aperto una finestra sull'importanza della disfunzione microvascolare ed è stato indicato per prevedere il rischio cardiovascolare indipendentemente dalla presenza della grave malattia ostruttiva.

Introduzione

La riperfusione di ischemia miocardiale (IR) è una condizione in cui l'afflusso di sangue è limitato al cuore seguito dal ripristino della perfusione e dalla riossigenazione simultanea¹. L'occlusione delle arterie coronarie può essere causata da una rottura della placca di colesterolo o di embolo, che si traduce in un grave squilibrio dell'offerta metabolica e della domanda, causando ipossia tissutale. La terapia di reperinsertazione è stata osservata dalla terapia di reperfusione con miocardio acuto, migliorare la funzione ventricolare del maniricolo e migliorare la sopravvivenza nei pazienti con infarto miocardico acuto. Tuttavia, dopo la ricanalizzazione dell'arteria coronaria, le anomalie funzionali di piccoli vasi coronarici possono verificarsi^2,3,4^,5. Una percentuale significativa di pazienti, forse addirittura il 40%, non riacquista perfusioni microvascolari e miocardiali nonostante il ripristino del flusso coronaricale. La visualizzazione e la valutazione della microvascolatura coronarica possono essere difficili in vivo, ma ci sono una serie di tecniche invasive e non invasive che possono essere utilizzate per valutare i parametri direttamente a seconda della funzione microvascolare coronarica^{6 ,7}. Inoltre, la funzione endoteliale può essere valutata a livello della circolazione coronarica tramite il CFR⁵.

L'ecocardiografia transtoracica di Doppler è uno strumento non invasivo che ci permette di studiare la velocità del flusso dell'arteria coronaria e Il CFR⁵. Il CFR rappresenta il rapporto tra il flusso massimo di sangue coronavo e il flusso sanguigno coronario a riposo⁸. Durante la sfida di stress, un cuore normale aumenta il flusso di sangue coronavo fino a quattro volte al di sopra del valore di riposo. Il rischio cardiovascolare aumenta quando il CFR è diminuito^{di 9}. Ishihara et al ha dimostrato che il CFR è stato gravemente alterato subito dopo l'angioplastica coronarica⁵. In assenza di stenosi coronarica, CFR diminuisce durante la disfunzione microvascolare coronarica ed è presente in circa la metà dei pazienti con malattia coronarica stabile¹⁰.

L'obiettivo generale di questo metodo è la visualizzazione non invasiva della funzione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti tramite ecocardiografia, che può essere utilizzata per calcolare la CFR. Questo offre un importante strumento di valutazione per diagnosticare la disfunzione microvascolare e valutare potenziali trattamenti terapeutici.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con i protocolli approvati dall'University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo approvato da IACUC 18223) e dalla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio¹¹.

1. Animali

1. Per lo studio, utilizzare i ratti Fisher 344 di 4 mesi (BW-150-180 g).

2. Ultrasound Imaging prima dell'intervento iR

1. Anestesizzare il ratto con isoflurane - camera di induzione al 5% con 1,5–2,0 L/min O₂ flusso seguito da 1.5–2.0% con 1.5–2.0 L/min O₂ flusso. Questa anestesia viene mantenuta per tutta la durata dell'esperimento, durante le fasi di riposo e stress.
2. Posizionare l'animale in posizione supina e radersi il torace. Mantenere la temperatura corporea a 37-38 gradi centigradi utilizzando la piattaforma di riscaldamento integrata. Monitorare la frequenza cardiaca utilizzando il software.
   NOTA: L'anestesia corretta è fondamentale per mantenere la frequenza cardiaca a tassi fisiologici normali (tra 295-350 battiti/min).
3. Applicare unguento vet oftalmico per evitare la secchezza degli occhi prima dell'imaging.
4. Eseguire l'ecocardiografia utilizzando una sonda lineare da 13 a 24 MHz (ad esempio MS250) (Figura 1A).
5. Posizionare l'animale in posizione supina sulla piattaforma riscaldata. Assicurarsi che l'anestesia sia controllata tramite il cono naso. Posizionare quindi la sonda per ottenere la vista parasternale dell'asse corto (PSAX) utilizzando il sistema ferroviario (Figura 1B).
6. Spostando la sonda nella direzione rostrale dal PSAX, individuare l'arteria polmonare (Figura 1B).
7. Spostare leggermente la sonda nella direzione caudale dall'arteria polmonare per visualizzare il LAD e memorizzare l'immagine.
   NOTA: Il LAD è difficile da trovare senza Color Doppler, quindi le immagini In modalità B del LAD non sono sempre possibili.
8. Quando le differenze individuali rendono difficile individuare l'arteria coronaria LAD, seguire la tecnica menzionata di seguito:
   1. Spostare la sonda lateralmente all'arteria polmonare.
   2. Angolare la piattaforma in modo che l'animale sia inclinato, invertito o leggermente verso il lato destro in modo che il ventricolo sinistro sia più facilmente visibile con la sonda.
9. Una volta acquisita o memorizzata l'immagine in modalità B, fare clic su Doppler colore sul touchscreen (Figura 1C). Visualizzare l'arteria coronaria (la freccia bianca indica LAD) nell'asse corto (Figura 1C). Il colore rosso, come si vede in tempo reale, è indicativo della direzione del flusso (cioè, il flusso sanguigno è verso la sonda).
10. Dopo aver visualizzato LAD in modalità Doppler a colori, cambiate la modalità in modalità onda a impulsi (PW). Cercare la presenza di una linea di indicatore giallo sull'arteria coronaria (Figura 2A).
11. Posizionare la linea PW gialla al centro dell'arteria coronaria. Assicurarsi che l'angolo sia parallelo alla direzione del flusso.
    NOTA: la velocità del flusso dipende fortemente dall'angolo della linea PW, quindi assicurati di abbinare l'angolo della sonda sullo schermo con l'angolo del LAD. Utilizzare il touch screen per regolare l'angolo; L'angolo di PW deve essere inferiore a 60 gradi.
12. Utilizzare cine store per catturare la velocità del flusso coronario LAD a riposo al picco diastole come forme d'onda (Figura 2B).
13. Dopo aver ottenuto la velocità di flusso LAD a riposo, misurare la velocità massima di flusso di LAD durante la sollecitazione per calcolare il CFR. Per misurare la velocità massima di flusso durante lo stress, infondere la Dobutamina a una dose di 20 g/kg/min attraverso la vena della coda⁸ (Figura 2C).
    NOTA: L'infusione di dobutamina non deve essere superiore a 8 min. Utilizzare una pompa di infusione e impostare il diametro della pompa di infusione a 14,43 per la siringa BD 10 mL.
    1. Utilizzare 25-G set farfalla infusione per la canonale vena coda. Per posizionare l'ago di infusione, posizionare una piccola striscia di garza intorno alla base della coda del topo, quindi afferrare con gli emostati e ruotare il laccio emostatico per applicare la pressione e causare l'ingrandimento della vena.
    2. Posizionare l'ago mentre è collegato direttamente alla siringa di Dobutamine.
       NOTA: Fare molta attenzione a non introdurre accidentalmente il farmaco durante l'elaborazione del sangue per garantire il corretto posizionamento dell'ago nella vena posteriore. Inoltre, assicurati di evitare di introdurre una bolla d'aria nella vena, poiché un'embolia può essere fatale per l'animale.
    3. Una volta posizionato l'ago, stabilizzarlo con una colla e un pezzo di nastro chirurgico, fissando la linea di infusione alla coda.
    4. Rimuovere gli emostati e il laccio emostatico per recuperare il flusso.
    5. Mettere la siringa di dobutamina nella pompa di infusione e impostarla per iniettare 20 g/kg/min.
    6. Durante l'infusione di Dobutamina, monitorare attentamente il picco di LAD e la frequenza cardiaca. Registrare periodicamente picchi di LAD PW in modalità Doppler, soprattutto ogni volta che aumenta in risposta alla Dobutamina.
       NOTA: La sfida di stress indotta dalla dobutamina fa sì che il cuore lavori di più; questo spesso si traduce nel movimento del cuore e il LAD. Preparati a spostare l'animale, la sonda o entrambi per mantenere il LAD in vista.
    7. Dopo che i picchi di LAD e la frequenza cardiaca si sono stabilizzati durante la sfida, fermare l'infusione di Dobutamina, rimuovere il set di infusione della vena della coda e rimuovere l'animale dalla piattaforma. Lasciare che l'animale si riprenda nella sua gabbia di casa.
14. Selezionare lo strumento Picco Vel per ottenere le velocità di diastolicidi di picco dalle immagini mostrate in Figura 2B e C.
15. Calcolare l'indice CFR come rapporto tra la sollecitazione LAD (Dobutamine) e la velocità del flusso diastolico di picco a riposo rispetto alla velocità del flusso diastolico di picco LAD (Figura 2A).

3. Lesione di riperfusione di Ischemia

1. Anestesizzare il ratto con isoflurane - camera di induzione al 5% con 1,5–2,0 L/min O₂ flusso seguito da 1.5–2.0% con 1.5–2.0 L/min O₂ flusso.
2. Confermare la profondità dell'anestesia dalla mancanza del riflesso di ritiro del pedale. Utilizzare unguento vet oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea corretta di 37-38 gradi centigradi utilizzando una piastra di riscaldamento o un controllore della temperatura animale.
3. Somministrare meloxicam pre-chirurgica, 5 mg/kg per via intramuscolare, 15 min prima dell'intervento, seguito da 2 mL bolus sottocutaneo dello 0,9% salina per prevenire la disidratazione durante l'intervento chirurgico. Sono stati utilizzati guanti e strumenti sterili e sono state impiegate tecniche asettiche. Utilizzando la sorgente luminosa in fibra ottica, intubare ratto utilizzando catetere IV 18-gauge e collegare al ventilatore.
4. Ligate LAD con 8-0 sutura monofilamento attraverso 15 mm di apertura al 5^esimo spazio intercostale. Legare un nodo semplice e lasciare per 30 min. Confermare visivamente l'ischemia in tutti i ratti tramite scolorimento della superficie del cuore¹². Rilasciare la legatura dopo 30 min e verificare la reperfusione con l'arrossamento dell'area precedentemente scolorita del muscolo cardiaco per 1-2 min¹².
5. Chiudere la gabbia toracica utilizzando una sutura assorbibile 4-0 con un motivo di sutura interrotto, quindi chiudere la pelle utilizzando una sutura di seta non assorbibile 5-0 con motivo di sutura continua.
6. Rimuovere l'animale dall'anestesia. Lasciare che l'animale si riprenda nella gabbia di casa. 5mg/kg Meloxicam è stato iniettato intramuscolare ogni 24 ore prima di eutanasia l'animale (72 ore dopo l'intervento chirurgico).

4. Imaging ad ultrasuoni dopo l'intervento a ir-IR

1. 72 h dopo l'intervento iR, misurare il flusso coronarico e CFR di nuovo. Confrontare le misure prima delle misurazioni IR. Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.15 come descritto in precedenza.

Risultati

Per questo studio, abbiamo usato 12 ratti Fisher 344 donne. Abbiamo eseguito un test di stress con La Dobutamina e misurato la velocità dell'arteria coronaria LAD prima e 72 ore dopo l'intervento a iR. Prima dell'intervento a IR, la velocità dell'arteria coronaria LAD a riposo era misurata come 423 x 59 mm/s, che è stata aumentata dopo l'infusione di Dobutamina (1005 77 mm/s) (Figura 3A). Dopo 72 h di reperfusione di ischemia, la velocità dell'arteria cor...

Discussione

I principali risultati del presente studio sono che IR aumenta la velocità dell'arteria coronaria LAD a riposo e compromette il CFR, anche in assenza di stenosi angiografica residua.

Comprendere la fisiologia coronarica è una parte essenziale del processo decisionale clinico per i cardiologi per il trattamento della malattia coronarica. Il CFR è uno dei parametri funzionali più importanti nella comprensione della fisiopatologia della microcircolazione coronarica⁷

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	BD Syringe	302995
250S 13–24 MHz linear probe	FUJIFILM VisualSonics Inc
Dobutamine hydrochloride	Sigma	D0676-10mg
Isoflurane	RRC	27376
Legato 100 Syringe pump	KD Scientific	788100
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics Inc
Winged infusion set, 27G x 1/2",	Medline.com	TMOSV27ELZ