Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

Resumen

La prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) ofrece una alternativa reconocida de la Organización Mundial de Sanidad Animal y la Organización Mundial de la Salud (OIE/OMS) a la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) para el diagnóstico de la rabia. Esta prueba permite aplicaciones basadas en el campo que se pueden realizar en aproximadamente 1 h sobre impresiones cerebrales utilizando microscopía de luz.

Resumen

La vigilancia basada en laboratorios es fundamental para los esfuerzos de prevención, control y gestión de la rabia. Si bien el DFA es el estándar de oro para el diagnóstico de la rabia, es necesario validar técnicas de diagnóstico adicionales para mejorar la vigilancia de la rabia, particularmente en los países en desarrollo. Aquí, presentamos un protocolo estándar para el DRIT como una opción de prueba alternativa, de laboratorio o sobre el terreno que utiliza microscopía de luz en comparación con el DFA. Las impresiones táctiles del tejido cerebral recogido de animales sospechosos se fijan en una formalina tamponada del 10%. El DRIT utiliza anticuerpos monoclonales o policlonales específicos del virus de la rabia (conjugados con biotina), una enzima estreptavidina-peroxidasa y un reportero de cromógeno (como acetil 3-amino-9-etilcarbazol) para detectar inclusiones virales dentro del tejido infectado. En aproximadamente 1 h, una muestra de tejido cerebral puede ser probada e interpretada por el DRIT. La evaluación de cerebros animales sospechosos probados a partir de una variedad de especies en América del Norte, Asia, Africa y Europa han ilustrado una alta sensibilidad y especificidad por el DRIT acercándose al 100% con resultados en comparación con DFA. Desde 2005, el programa de Servicios de Vida Silvestre del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA WS, por sus siglas en inglés) ha llevado a cabo esfuerzos mejorados de vigilancia de la rabia a gran escala utilizando el DRIT para probar >94,000 muestras recogidas de la vida silvestre en áreas estratégicas de manejo de la rabia . El DRIT proporciona una herramienta poderosa y económica para el diagnóstico de la rabia que puede ser utilizada por laboratorios y biólogos de campo para mejorar los programas actuales de vigilancia, prevención y control de la rabia a nivel mundial.

Introducción

Mientras que el DFA es la prueba más utilizada para el diagnóstico rutinario de la rabia¹, el costo de comprar y mantener un microscopio fluorescente puede ser limitante a las naciones en desarrollo^2,3,4 y para amplias, programas mejorados de vigilancia de la rabia a gran escala^3,4. Además, el DFA requiere la capacidad de refrigerar muestras durante la fijación e incubar muestras por encima de la temperatura ambiente durante las reacciones anticuerpos-antígenos, lo que puede ser un obstáculo significativo en países sin infraestructura adecuada. Debido en parte a las limitaciones asociadas con las pruebas modernas de DFA, el impacto global de la rabia ha sido subestimado durante mucho tiempo⁵.

A este respecto, es necesario validar técnicas de diagnóstico adicionales para mejorar la vigilancia de la rabia a nivel mundial, en particular en los países en desarrollo. El protocolo DRIT presentado aquí ofrece una alternativa de pruebas de laboratorio o sobre el terreno al DFA queutiliza microscopía de luz y no requiere refrigeración o incubación de laboratorio durante la prueba 6. El DRIT y el DFA son similares en que ambas técnicas utilizan impresiones táctiles de muestras cerebrales recogidas de animales potencialmente rabiosos. Sin embargo, el primer paso del DRIT utiliza la formalina como un fijador histórico para las muestras, que inactiva el virus de la rabia. Esto proporciona una mejora sustancial de la bioseguridad sobre la acetona utilizada para fijar muestras en el protocolo DFA³, que es importante no sólo en el laboratorio, sino tal vez aún más en entornos de laboratorio basados en campo o descentralizados. Hasta la fecha, el DRIT muestra sensibilidad y especificidad igual es igual a DFA^2,7,8,9.

Desde 2005, el programa WS del USDA ha llevado a cabo esfuerzos mejorados de vigilancia de la rabia a gran escala en América del Norte utilizando el DRIT como parte de un programa integral de manejo de la rabia de vida silvestre^10. La vigilancia mejorada de la rabia se utiliza como complemento de la vigilancia de la salud pública basada en la exposición y pruebas principalmente especies de mesocarnívoes de la fauna silvestre, incluyendo mapaches (Procyon lotor), zorrillos rayados (Mephitis mephitis), zorros grises ( Urocyon cinereoargenteus), zorros rojos (Vulpes vulpes) y coyotes (Canis latrans) que no han participado en una exposición animal humana o doméstica. Los cadáveres de animales utilizados en las pruebas se sometieron al USDA WS mediante mayores esfuerzos de vigilancia de la rabia y comprendía especies vectoriales de rabia que son: malas o extrañas actuaciones; encontrados muertos, muertos en la carretera, o una molestia; y no están asociados con una exposición animal humana o doméstica. El DRIT proporciona una prueba de diagnóstico de la rabia que puede ser empleada por biólogos de campo capacitados con poca o ninguna experiencia de laboratorio para mejorar la vigilancia de la rabia y reducir la carga financiera y la carga de trabajo de los laboratorios de diagnóstico de salud pública¹⁰. La capacitación básica de DRIT para los empleados de campo wS del USDA suele tardar de 1,5 a 2 días, lo que incluye aproximadamente 4 horas de instrucción en el aula que cubren los principios fundamentales de la bioseguridad, los métodos para la recolección de muestras y los procesos DRIT, así como >8 h de tiempo de laboratorio realizando la prueba. Las oportunidades de capacitación han estado disponibles para usdA WS y los cooperadores de programas a través de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), LYSSA LLC y The Wistar Institute.

Dentro de las áreas de gestión estratégica, USDA WS ha probado más de 94,000 muestras de vida silvestre utilizando el DRIT y ha detectado más de 1.850 muestras rabiosas que probablemente habrían pasado desapercibidas basándose únicamente en pruebas de salud pública basadas en la exposición de animales sospechosos. Los datos mejorados de vigilancia de la rabia proporcionados por los resultados del DRIT son fundamentales para proporcionar una representación temporal y espacial más completa de la rabia en el paisaje en apoyo de los programas de vacunación contra la rabia oral para la vida silvestre en todo Estados Unidos^{10, 11}. Del mismo modo, las agencias provinciales de vida silvestre en Canadá han incorporado DRIT en los esfuerzos de vigilancia de la rabia de vida silvestre a gran escala en conjunto con sus programas de salud pública con éxito⁸. Tanto los programas de vigilancia del USDA WS como los del DRIT canadiense han utilizadolaboratorios nacionales de referencia para confirmar la rabia por DFA y para realizar la escritura de variantes virales según corresponda 8. Además, los biólogos de campo del USDA WS envían el 10% de los especímenes negativos para la confirmación de DFA a laboratorios de referencia y desde 2008, han participado en pruebas bianuales de competencia DRIT proporcionadas por el Laboratorio Estatal de Higiene de Wisconsin, como parte de medidas de garantía de la calidad.

El objetivo de este método es ofrecer un enfoque alternativo para las pruebas de diagnóstico de la rabia que se pueden hacer en laboratorios descentralizados, en el campo o en áreas sin acceso rutinario a la microscopía electrónica.

Protocolo

Cada persona que realice pruebas diagnósticas de rabia debe recibir una serie estándar de vacunación contra la rabia previa a la exposición y someterse a una evaluación regular de anticuerpos serológicos, con vacunas de refuerzo según sea necesario. Las personas no inmunizadas no deben entrar en laboratorios o áreas donde se lleve a cabo dicho trabajo. Toda manipulación de tejidos y diapositivas debe llevarse a cabo para no aerosolizar líquidos o producir partículas en el aire. Las campanas de humo no son necesarias, pero cuando es posible pueden proporcionar protección adicional contra olores, ectoparásitos y fragmentos óseos. El equipo de protección personal mínimo, incluidos los guantes y la protección ocular, debe usarse en todo momento durante la recolección y las pruebas de la muestra.

1. Colección de troncos cerebrales

1. Recoger muestras de tronco cerebral inmediatamente después de la recolección de cadáveres o asegurarse de que las canales se colocan en los congeladores para su almacenamiento hasta su posterior ensayo. Si se congelan las canales de los animales, descongele a temperatura ambiente antes de la recolección del tronco encefálico para facilitar la recolección. En algunas circunstancias, las muestras se recogen directamente de un animal congelado.
2. Para los animales recién recogidos o descondesunidos a temperatura ambiente, coloque el animal supino sobre una superficie plana con la columna cervical ligeramente girada hacia el examinador. Palpate para identificar la articulación atlanto-occipital en el aspecto lateral de la columna cervical.
   1. Para las canales que todavía están completamente congeladas, coloque el animal supino como se describió anteriormente, si es práctico. Utilice sierras, cuchillos, cizallas óseas o equipos similares para separar completamente la cabeza del cuerpo.
      NOTA: Todos los equipos utilizados que no sean de un solo uso deben limpiarse a fondo entre las muestras.
3. Usando una cuchilla de bisturí, haga una incisión a nivel de la articulación atlanto-occipital en el aspecto ventral, cortando a través de todas las capas de músculo y tejido blando, incluyendo la tráquea y el esófago. Continúe hasta aproximar el aspecto anterior de las vértebras de la columna cervical. Para el tejido congelado, utilice una cuchilla de bisturí para eliminar las capas restantes de músculo y tejido blando para exponer el foramen magnum.
4. Mueva la cabeza del animal a una extensión de rango final hasta que el tronco encefálico sea visible. Utilice una cuchilla de bisturí para eliminar todo el tejido visible del tronco encefálico/sistema nervioso central (SNC) para el muestreo. Para una muestra congelada, usa una cuchilla de bisturí para extraer la mayor cantidad posible de tejido del tronco encefálico/SNC congelado del interior del cráneo.
5. Coloque las muestras del tronco encefálico en un recipiente irrompible (es decir, latment metálico, criovial, etc.) y etiquete en consecuencia.
6. Asegúrese de que las muestras del tronco encefálico se prueban inmediatamente después de la recolección a través de la prueba DRIT, refrigeradas (4 oC) durante un máximo de 24 horas antes de la prueba, o congeladas (-20 oC) hasta el momento de la prueba si las pruebas se llevarán a cabo más de 24 horas después de la recolección de la muestra.

2. Preparación de materiales para DRIT

1. Configuración de 10 platos de tinción de diapositivas (Figura 1)
   NOTA: Los platos de tinción son lo suficientemente profundos como para permitir una inmersión completa de la corredera (diámetro 96 mm, altura 72 mm, profundidad 42 mm, volumen 250 mL). ⁶
   1. Llene el plato 1 con una formalina tamponada al 10% de fosfato. Reemplace formalina después de 2 pruebas o semanalmente.
   2. Llene los platos 2, 4 y 5 con solución salina tamponada de fosfato con 1% de entreten-80 (TPBS). Reemplace con TPBS nuevo antes de cada prueba.
   3. Llene el plato 3 con 3% de peróxido de hidrógeno. Reemplace el peróxido de hidrógeno antes de cada prueba.
   4. Llene los platos 6, 8, 9 y 10 con agua destilada o desionizada. Reemplace el agua antes de cada prueba.
   5. Llene el plato 7 con la formulación de hematoxilina Gills #2 diluye en una proporción de 1:1 en agua destilada⁶. Reemplace la hematoxilina después de 2 pruebas o semanalmente.
      NOTA: De acuerdo con el protocolo DRIT original desarrollado por el CDC¹², se puede utilizar una proporción de 1:2 de hematoxilina Gills al agua si el contramanchado es demasiado oscuro.
2. Preparación de la solución en stock de amino-etilcarbazol (AEC)
   1. Con una pipeta de vidrio, coloque 5 ml de N,N-dimetilformamida en un recipiente de vidrio.
   2. Añadir un comprimido de 20 mg de 3-amino-9-etilcarbazol y agitar hasta que se disuelva por completo. Etiquete el frasco con "AEC stock" y la fecha en que se hizo el stock.
      NOTA: La solución de material AEC puede almacenarse bajo refrigeración (4 oC) y utilizarse durante 1-2 meses.
3. Preparación de la dilución de trabajo de AEC
   1. Añadir 7 ml de tampón de acetato a un tubo centrífugo de 15 ml.
   2. Con una pipeta de vidrio, añada 0,5 ml de la solución de material AEC al tubo centrífugo.
   3. Añadir 0,075 ml de 3% de peróxido de hidrógeno al tubo.
   4. Filtrar la solución con una jeringa de 10 ml utilizando un filtro de jeringa de 0,45 m.
      NOTA: La dilución de trabajo AEC debe crearse justo antes de cada prueba DRIT, ya que sólo es estable durante 2-3 h.

3. Prueba rápida directa de inmunohistoquímica

1. Etiquete los portaobjetos de microscopio de vidrio con un número único para cada espécimen utilizando un marcador de tinta permanente, impermeable y a prueba de manchas.
   1. Con una cuchilla de bisturí, retire el tronco encefálico del recipiente y colóquelo sobre una toalla de papel. Borre suavemente cualquier exceso de líquido, sangre o piel con una segunda toalla de papel para revelar sólo el tejido del tronco cerebral¹³. Si es necesario, seccione el tejido del tronco encefálico para revelar una sección transversal.
   2. Toque muy suavemente la diapositiva del microscopio hasta la sección transversal del tejido del tronco encefálico. Toque la diapositiva hasta el tronco encefálico en varios puntos sin movimiento lateral para permitir que varias áreas del tronco encefálico se transfieran a la diapositiva^13. Asegúrese de que solo 1 o 2 capas de células se transfieren del tejido cerebral a la diapositiva con un toque suave. No se necesita ningún agente de montaje para fijar el tejido del tronco encefálico en las diapositivas. Incluya un control positivo y negativo en cada ejecución de DRIT.
2. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Sumerja los portaobjetos en una formalina tamponada del 10% durante 10 min (plato 1).
4. Retire los portaobjetos de la formalina y enjuague en una solución de TPBS (plato 2).
5. Sumergir los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min (plato 3).
6. Retire los portaobjetos del peróxido de hidrógeno y enjuague en TPBS fresco (plato 4). Después de eliminar el exceso de peróxido de hidrógeno, coloque los portaobjetos en TPBS fresco (plato 5) y trabaje con una diapositiva a la vez mientras las otras diapositivas permanecen inmersas en TPBS.
7. Tome los portaobjetos de TPBS (plato 5) uno a la vez, sacuda y destruya el exceso de tampón, y colóquelos sobre una toalla de papel humedecida en el banco de laboratorio, como base de una "cámara de humedad". Con una pipeta, suelte suficiente anticuerpo primario contra el virus antirrábico en cada diapositiva para cubrir el tejido del SNC. Incubar los portaobjetos durante 10 minutos en la cámara de humedad (es decir, cubrir los portaobjetos con placas de pozo u otra cubierta simple mientras se colocan sobre la toalla de papel humedecida) a temperatura ambiente (Figura2).
8. Retire los portaobjetos de la cámara de humedad, agite y elimine el exceso de conjugados y enjuague los portaobjetos en TPBS (reutilice el mismo TPBS en el plato 5).
9. Trabajando con una diapositiva a la vez, mientras que otros permanecen inmersos en TPBS — usa una pipeta para dejar caer suficiente complejo de esptavidina-peroxidasa para cubrir el tejido del SNC. Incubar en la cámara de humedad durante 10 min a temperatura ambiente.
10. Retire los portaobjetos de la cámara de humedad, agite y elimine el exceso de complejo, y enjuague los portaobjetos en TPBS (plato 5).
11. Trabajar con una diapositiva a la vez, sacudir y borrar el exceso de tampón, mientras que otros permanecen inmersos en TPBS - utilizar una pipeta para dejar caer suficiente AEC (la preparación se explica anteriormente y debe hacerse inmediatamente antes de su uso) para cubrir el tejido del SNC. Incubar en la cámara de humedad durante 10 min a temperatura ambiente.
12. Enjuague los portaobjetos en agua destilada (plato 6).
13. Coloque los toboganes en contramancha de Gills Hematoxylin (diluido 1:1 con agua destilada) durante 2 min (plato 7).
14. Enjuague inmediatamente todos los portaobjetos en agua destilada (plato 8). Repita dos veces con agua dulce cada vez (platos 9 y 10).
15. Trabajando con un tobogán a la vez, mientras que otros permanecen sumergidos en agua destilada (plato 10) — agitar y borrar el exceso de agua y utilizar un medio de montaje soluble en agua para fijar un resbalón de la cubierta.
16. Utilice un microscopio de luz con un objetivo de 20x para ver las diapositivas y un objetivo 40x si se necesita una inspección más detallada.

Resultados

Los resultados positivos del DRIT muestran inclusiones virales intracitoplasmáticas rojas que pueden variar en forma y tamaño (Figura 3) dentro del citoplasma de los cuerpos celulares azulados. Las inclusiones parecen lisas con márgenes muy brillantes y un área central menos intensamente manchada. La intensidad y la distribución de antígenos se registran cuando se detectan inclusiones. La intensidad se clasifica de +4 a +1. La corredera de control positivo debe tener un brillo magenta intenso y brillante que se conoce como una intensidad de +4. Una ligera pérdida de color puede ocurrir especialmente cuando el manejo de la muestra no ha sido óptimo (es decir, el tejido de la muestra se ha descompuesto ligeramente) y estos deben calificarse como +3. La mancha notablemente opaca se clasifica como de +2 a +1, no se considera diagnóstico para la infección por el virus de la rabia y se etiqueta como indeterminada.

Además, la distribución de antígenos se clasifica de +4 a +1 con +4 que representa la distribución de antígenos compuesta por una abundancia de inclusiones grandes y pequeñas que varían en tamaño y forma, y está presente en todos los campos (o casi todos los campos) de visión dentro del tejido del SNC impresión táctil. El control positivo normalmente tiene una distribución de antígeno +4. Se asignaría una distribución de antígenos de +3 cuando haya inclusiones en una variedad de tamaños en la mayoría de los campos de visión, pero no en todos. Si las inclusiones se encuentran en 10%-50% de los campos del microscopio, se asigna una distribución de +2 antígenos. Cuando se encuentran inclusiones en <10% de los campos del microscopio, se asigna una distribución de +1 antígeno.

La mayoría del tejido del SNC con el virus de la rabia presente presenta inclusiones virales típicas calificadas como de +3 o +4 de intensidad y distribución de antígenos. Si los resultados indican una intensidad +2 o +1 o una distribución de antígeno +2 o +1, la muestra se declara como "indeterminada" y se justifica nifor. Si la misma muestra tiene un resultado de prueba indeterminado repetido, la muestra debe enviarse a un laboratorio de referencia para pruebas DFA o confirmatorias relacionadas.

Una muestra de prueba que utiliza el DRIT se considera negativa para los antígenos del virus de la rabia después de que la diapositiva que contiene el tejido del SNC se haya analizado con un aumento de 200X o superior y no se detecten inclusiones de virus típicas (Figura4). Las muestras negativas presentan cuerpos celulares azulados con poca o ninguna tinción inespecífica.

Figura 1: Configuración de 10 platos de tinción de diapositivas con reactivos para pruebas. Los platos están etiquetados con el nombre del reactivo en el orden necesario para seguir el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cámara de humedad simple creada con una toalla de papel húmedo y placas de cultivo celular.  Una cámara de humedad simple con una toalla de papel húmedo y placas de cultivo celular permite la aplicación en campo.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diapositivas representativas de inclusiones virales positivas de la rabia con +4 intensidad y +4 distribución de antígenos. (A y B)muestran inclusiones virales de rabia positivas con aumento de 200x. (C y D) muestran inclusiones virales de rabia positivas con aumento de 400x. Barras de escala de 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diapositivas representativas de muestras negativas sin inclusiones viralesde rabia. (A y B) muestran muestras negativas para inclusiones virales de rabia con aumento de 200x. (C y D) muestran muestras negativas para inclusiones virales de rabia con aumento de 400x. Barras de escala de 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Fotografías representativas de las instalaciones de pruebas DRIT utilizadas por el USDA WS. (A) Instalación de pruebas móviles en un remolque cerrado para el transporte. (B) Vehículo recreativo adaptado para pruebas DRIT. (C) instalación de pruebas DRIT en conjunto con laboratorio universitario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El DRIT es un método flexible adecuado para la vigilancia sobre el terreno para detectar la presencia de virus de la rabia que se puede utilizar en áreas de laboratorio descentralizadas. Si bien es posible llevar a cabo toda la prueba en un entorno basado en el campo, como en el portón trasero de un camión, es ideal tener un pequeño espacio interior dedicado a DRIT debido a problemas de almacenamiento de productos químicos, equipos y suministros. Además, se debe considerar la adhesión a todas las leyes federales, estatales y locales aplicables, y las regulaciones para el uso y eliminación de productos químicos. Actualmente, USDA WS tiene 15 instalaciones DRIT para probar muestras de 17 estados. Las instalaciones del USDA WS DRIT se establecen en conjunto con los laboratorios de salud pública de la universidad y el estado, en salas designadas dentro de instalaciones más grandes y en remolques cerrados que han sido modernizados y convertidos para servir como unidades móviles de pruebas en el respuesta a brotes de emergencia en el que la mejora de las pruebas de vigilancia de la rabia con tiempo de respuesta inmediato es fundamental (Figura5).

Mientras que la prueba ha tenido éxito utilizando material de tronco encefálico de calidad variable, tejido de tronco encefálico fresco sin descomposición del tejido es óptimo. A medida que se produce descomposición, desecación o licuefacción, la calidad de la muestra disminuye y la prueba puede detectar una tinción más inespecífica que puede confundir los resultados. Esta observación es similar entreDFA y DRIT 2. El tronco encefálico/SNC debe recogerse lo antes posible y luego almacenarse congelado (-20 oC) hasta el ensayo.

Típicamente, la mayoría de las instalaciones de USDA WS procesan de 12 a 24 diapositivas a la vez durante una sesión DRIT, incluyendo un control positivo y un control negativo que se han confirmado a través de DFA. Los controles positivos y negativos proporcionan un punto de referencia para cada ejecución de DRIT para garantizar que la prueba se realizó correctamente y para confirmar si surgen preguntas interpretativas en las diapositivas de prueba. Si no se determina que una muestra tiene un resultado positivo o negativo claro, drIT la etiqueta como indeterminada y la prueba por segunda vez. Si esta muestra no es un claro positivo o negativo después de dos pruebas DRIT, se envía a un laboratorio de referencia para pruebas RELACIONADAs o DFA.

Al igual que con cualquier prueba de diagnóstico, "disparo problemático" es útil con hallazgos inesperados. Por ejemplo, si una ejecución DE DRIT no tiene éxito (es decir, el control positivo no presenta una intensidad de tinción y distribución de antígenos +3 o +4), asegúrese de que todos los productos químicos y reactivos no hayan expirado. Hemos encontrado el uso de una botella recién abierta de peróxido de hidrógeno en un mínimo de una vez por semana es útil para ayudar a prevenir la tinción no específica a través de la oxidación del tejido cerebral. Además, se recomienda reemplazar el búfer de acetato al menos una vez al año como mínimo, independientemente de la fecha de caducidad etiquetada.

Hay una serie de ventajas del DRIT sobre DFA, incluyendo menores costos, capacidad para realizar la prueba fuera de un laboratorio centralizado, necesidad de sólo microscopía de luz en lugar de un microscopio fluorescente, y el proceso de entrenamiento relativamente sencillo para personas que administran y leen la prueba^2,3,4. Estas ventajas, junto con la sensibilidad y especificidad delDRIT que son comparables a DFA 2,^7,8^{, 9}ya han demostrado que la prueba sirve como una herramienta importante a gran escala programas mejorados de vigilancia de la rabia^8,10 en América del Norte. Además, el DRIT tiene el potencial de permitir una mayor vigilancia y pruebas más rápidas en los países en desarrollo u otras áreas con recursos limitados, especialmente después de la reciente orientación de la OIE/OMS como prueba recomendada.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz	Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)	s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package	Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)	PN110	Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-823-2A	BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent	Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01BLU	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	12-553-465	Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	07-200-300	Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-959-70C	Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	08-772-5	Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-827-122	Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	102092-122	Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SF100-4	Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SH30256LS	Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3%	Multiple Vendors		Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20X and 40X	Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF8481	Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)	AMD Next (www.amdnext.com)	999112314	Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL	SeraCare (https://www.seracare.com/)	5550-0001	KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P3813	Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies			Store at 4 degrees C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-1	VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-10	VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-5	VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	22-050-201	Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-868	Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2oz	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	101412-452	Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock	Multiple Vendors		Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-902	Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P1754	Also available in 25mL, 1L and 1G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	89038-272	Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20L)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	06-408C	DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm	Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)	2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01WHT	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)