Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Riepilogo

Il test immunohistochimico rapido diretto (DRIT) offre un'Organizzazione Mondiale per la Salute Animale e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OIE/OMS) riconosciuta alternativa al test di anticorpo fluorescente diretto (DFA) per la diagnosi della rabbia. Questo test consente di applicazioni sul campo che possono essere eseguite in circa 1 h su impronte cerebrali utilizzando la microscopia leggera.

Abstract

La sorveglianza di laboratorio è parte integrante degli sforzi di prevenzione, controllo e gestione della rabbia. Mentre il DFA è il gold standard per la diagnosi della rabbia, è necessario convalidare ulteriori tecniche diagnostiche per migliorare la sorveglianza della rabbia, in particolare nei paesi in via di sviluppo. Qui, presentiamo un protocollo standard per il DRIT come alternativa, laboratorio o opzione di test sul campo che utilizza la microscopia leggera rispetto al DFA. Le impronte tattili del tessuto cerebrale raccolto da animali sospetti sono fissate nella formalina tampolata al 10%. Il DRIT utilizza anticorpi monoclonali o policlonali specifici del virus della rabbia (coniugati alla biotina), un enzima perossidasi con streptavidina e un reporter cromogeno (come l'acetil 3-amino-9-ethylcarbazole) per rilevare le inclusioni virali all'interno del tessuto infetto. In circa 1 h, un campione di tessuto cerebrale può essere testato e interpretato dal DRIT. La valutazione di cervelli animali sospetti testati da una varietà di specie in Nord America, Asia, Africa ed Europa hanno illustrato un'elevata sensibilità e specificità da parte della DRIT che si avvicina al 100% con risultati rispetto al DFA. Dal 2005, il programma USDA WS (Department of Agriculture's Wildlife Services) del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti ha condotto sforzi di sorveglianza della rabbia potenziati su larga scala utilizzando il DRIT per testare >94.000 campioni raccolti dalla fauna selvatica in aree strategiche di gestione della rabbia . Il DRIT fornisce uno strumento potente ed economico per la diagnosi della rabbia che può essere utilizzato da laboratori e biologi di campo per migliorare gli attuali programmi di sorveglianza, prevenzione e controllo della rabbia a livello globale.

Introduzione

Mentre il DFA è il test più utilizzato per la diagnosi di routine della rabbia¹, il costo di acquisto e mantenimento di un microscopio fluorescente può essere limitante alle nazioni in via di sviluppo^2,3,4 e per la larghezza, programmi di sorveglianza avanzata sulla rabbia^3,4. Inoltre, il DFA richiede la capacità di refrigerare i campioni durante la fissazione e di incubare campioni al di sopra della temperatura ambiente durante le reazioni anticorpo-antigene, che possono essere un ostacolo significativo nei paesi senza infrastrutture adeguate. A causa in parte delle limitazioni associate ai moderni test DFA, l'impatto globale della rabbia è stato a lungo sottovalutato⁵.

A questo proposito, è necessario convalidare ulteriori tecniche diagnostiche per migliorare la sorveglianza della rabbia a livello globale, in particolare nei paesi in via di sviluppo. Il protocollo DRIT qui presentato offre un laboratorio o un'alternativa di test sul campo al DFA che utilizza la microscopia leggera e non richiede refrigerazione o incubazione di laboratorio durante il test^{6 .} Il DRIT e la DFA sono simili in quanto entrambe le tecniche utilizzano impronte tattili di campioni di cervello raccolti da animali potenzialmente rabbiosi. Tuttavia, il primo passo del DRIT utilizza la formalina come fissativo storico per i campioni, che inattiva il virus della rabbia. Ciò fornisce un sostanziale miglioramento della biosicurezza rispetto all'acetone utilizzato per fissare i campioni nel protocollo DFA³, che è importante non solo in laboratorio, ma forse ancora di più in ambienti di laboratorio basati sul campo o decentralizzati. Ad oggi, il DRIT mostra sensibilità e specificità uguali al DFA^2,7,8,9.

Dal 2005, il programma USDA WS ha condotto sforzi di sorveglianza avanzata della rabbia su larga scala in Nord America utilizzando il DRIT come parte di un programma completo di gestione della rabbia della fauna selvatica¹⁰. La sorveglianza avanzata della rabbia è utilizzata come complemento alla sorveglianza della salute pubblica basata sull'esposizione e ai test principalmente delle specie di meso-carnivori selvatici, compresi i procioni (loorda Procyon), delle puzzole striate (Mephitis mephitis), volpi grigie ( Urocyon cinereoargenteus), volpi rosse (Vulpes vulpes) e coyote (Canis latrans) che non sono state coinvolte in un'esposizione animale umana o domestica. Le carcasse animali utilizzate nei test sono state sottoposte all'USDA WS attraverso sforzi di sorveglianza della rabbia rafforzati e comprendevano specie vettoriali di rabbia che sono: azioni malari o strane; trovato morto, strada ucciso, o un fastidio; e non sono associati a un'esposizione umana o domestica agli animali. Il DRIT fornisce un test diagnostico sulla rabbia che può essere impiegato da biologi di campo addestrati con poca o nessuna esperienza di laboratorio per migliorare la sorveglianza della rabbia e ridurre l'onere finanziario e il carico di lavoro dei laboratori diagnostici di salute pubblica¹⁰. La formazione di base DRIT per i dipendenti del settore USDA WS richiede in genere da 1,5 a 2 giorni, che comprende circa 4 h di istruzioni in aula che coprono i principi fondamentali della biosicurezza, i metodi per la raccolta dei campioni e i processi DRIT, nonché >8 h di tempo di laboratorio per condurre il test. Opportunità di formazione sono state a disposizione di USDA WS e di comservizi attraverso i Centers for Disease Control and Prevention (CDC), LYSSA LLC e The Wistar Institute.

All'interno di aree di gestione strategica, USDA WS ha testato oltre 94.000 campioni di fauna selvatica utilizzando il DRIT e ha rilevato più di 1.850 campioni rabbiosi che probabilmente sarebbero andati inosservati basandosi solo sull'esposizione basata sui test di salute pubblica di animali sospetti. I dati di sorveglianza della rabbia migliorati forniti dai risultati DRIT sono fondamentali per fornire una rappresentazione temporale e spaziale più completa della rabbia sul paesaggio a sostegno dei programmi di vaccinazione orale della rabbia per la fauna selvatica in tutti gli Stati Uniti^{10, 11}. Allo stesso modo, le agenzie provinciali per la fauna selvatica in Canada hanno incorporato la DRIT negli sforzi di sorveglianza della rabbia della fauna selvatica su larga scala in concomito con i loro programmi di salute pubblica con successo⁸. Sia l'USDA WS che i programmi di sorveglianza DRIT canadesi hanno utilizzato laboratori di riferimento nazionali per confermare la rabbia da parte della DFA ed eseguire la tipizzazione delle varianti virali come appropriato⁸. Inoltre, i biologi di campo USDA WS inviano il 10% dei campioni negativi per la conferma del DFA ai laboratori di riferimento e dal 2008 hanno partecipato a test di competenza DRIT bieta forniti dal Wisconsin State Laboratory of Hygiene, come parte del laboratorio standard misure di garanzia della qualità.

L'obiettivo di questo metodo è quello di offrire un approccio alternativo per i test diagnostici sulla rabbia che può essere fatto in laboratori decentralizzati, sul campo o in aree senza accesso di routine alla microscopia elettronica.

Protocollo

Ogni persona che conduce test diagnostici sulla rabbia dovrebbe ricevere una serie standard di vaccinazione anti-pre-esposizione e sottoporsi a una valutazione regolare dell'anticorpo sierologico, con le vaccinazioni di richiamo in base alle esigenze. Gli individui non immunizzati non devono entrare nei laboratori o nelle aree in cui tale lavoro è svolto. Tutte le manipolazioni dei tessuti e dei vetrini devono essere condotte per non aerosolizzare liquidi o produrre particelle trasportate dall'aria. Le cappe da fumi non sono necessarie, ma quando sono fattibili possono fornire una protezione extra da odori, ectoparassiti e frammenti ossei. Le attrezzature protettive personali minime, compresi i guanti e la protezione degli occhi, devono essere indossate in ogni momento durante la raccolta e la prova del campione.

1. Collezione Brainstem

1. Raccogliere i campioni del tronco encefalico immediatamente dopo la raccolta della carcassa o assicurarsi che le carcasse vengano collocate nei congelatori per essere immagazzinate fino a dopo i test. Se le carcasse animali sono congelate, scongelare a temperatura ambiente prima della raccolta del tronco encefalico per facilitare la raccolta. In alcune circostanze, i campioni vengono raccolti direttamente da un animale congelato.
2. Per gli animali che sono appena raccolti o che sono stati sconziati a temperatura ambiente, posizionare la supina animale su una superficie piana con la colonna vertebrale cervicale leggermente ruotata verso l'esaminatore. Palpate per identificare l'articolazione atlanto-occipitale sull'aspetto laterale della colonna vertebrale cervicale.
   1. Per le carcasse ancora completamente congelate, posizionare la supina animale come descritto sopra, se possibile. Utilizzare seghe, coltelli, cesoie ossee o attrezzature simili per separare completamente la testa dal corpo.
      NOT: Tutte le apparecchiature utilizzate che non sono una tantera devono essere pulite accuratamente tra i campioni.
3. Utilizzando una lama bisturi, fare un'incisione a livello dell'articolazione atlanto-occipitale all'aspetto ventrale, tagliando attraverso tutti gli strati del muscolo e dei tessuti molli, tra cui la trachea e l'esofago. Continuare fino a circa l'aspetto anteriore delle vertebre cervicali della colonna vertebrale. Per i tessuti congelati, utilizzare una lama del bisturi per rimuovere eventuali strati rimanenti di muscolo e tessuti molli per esporre il forame magnum.
4. Spostare la testa dell'animale in estensione di gamma finale fino a quando il tronco encefalico è visibile. Utilizzare una lama bisturi per rimuovere tutto il tessuto visibile del tronco encefalico/sistema nervoso centrale (CNS) per il campionamento. Per un campione congelato, utilizzare una lama del bisturi per rimuovere la maggior parte del tronco encefalico congelato / tessuto CNS possibile dall'interno del cranio.
5. Collocare i campioni del tronco encefalico in un contenitore indistruttibile (ad es. latta di unguento metallico, crio-fiala, ecc.) ed etichettare di conseguenza.
6. Assicurarsi che i campioni del tronco encefalico siano testati immediatamente dopo la raccolta tramite il test DRIT, refrigerati (4 gradi centigradi) per un massimo di 24 h prima del test o congelati (-20 gradi centigradi) fino al momento della prova se il test avrà luogo più di 24 h dopo la raccolta del campione.

2. Preparazione dei materiali per il DRIT

1. Impostazione di 10 piatti di colorazione (Figura 1)
   NOT: I piatti di colorazione sono abbastanza profondi da consentire l'immersione completa del vetrino (diametro 96 mm, altezza 72 mm, profondità 42 mm, volume 250 mL). ⁶ È possibile:
   1. Riempire il piatto 1 con il 10% di formalina tampolatata per fosfato. Sostituire la formalina dopo 2 esecuzioni di test o settimanali.
   2. Riempire i piatti 2, 4 e 5 con salina tamponata di fosfato con 1% tween-80 (TPBS). Sostituire con un TPBS aggiornato prima di ogni test.
   3. Riempire il piatto 3 con il 3% di perossido di idrogeno. Sostituire il perossido di idrogeno prima di ogni test.
   4. Riempire i piatti 6, 8, 9 e 10 con acqua distillata o divinizzata. Sostituire l'acqua prima di ogni test.
   5. Riempire il piatto 7 con la formulazione dell'ematossilina Gills #2 diluita in un rapporto 1:1 in acqua distillata⁶. Sostituire l'ematossilina dopo 2 prove o settimanalmente.
      NOT: Secondo il protocollo DRIT originale sviluppato dal CDC¹², un rapporto 1:2 di Gills ematossialina all'acqua può essere utilizzato se la controtendenza è troppo scura.
2. Preparazione della soluzione di stock di amino-ethylcarbazole (AEC)
   1. Utilizzando una pipetta di vetro, mettere 5 mL di N,N-dimetilformamide in un contenitore di vetro.
   2. Aggiungere una compressa da 20 mg di 3-amino-9-ethylcarbazole e agitare fino a completa dissoluzione. Etichettare il barattolo con "AEC stock" e la data in cui è stato fatto il titolo.
      NOT: La soluzione di stock AEC può essere conservata in frigorifero (4 gradi centigradi) e utilizzata per 1-2 mesi.
3. Preparazione della diluizione del lavoro AEC
   1. Aggiungere 7 mL di tampone in acetato a un tubo di centrifuga di 15 mL.
   2. Utilizzando una pipetta di vetro, aggiungere 0,5 mL della soluzione di riserva AEC al tubo di centrifuga.
   3. Aggiungere al tubo 0,075 mL di perossido di idrogeno del 3%.
   4. Filtrare la soluzione con una siringa da 10 mL utilizzando un filtro di siringa da 0,45 m.
      NOT: La diluizione di lavoro AEC deve essere creata appena prima di ogni test DRIT in quanto è stabile solo per 2-3 h.

3. Test di immunoistochimica rapida diretta

1. Etichetta vetrini al microscopio in vetro con un numero unico per ogni campione utilizzando un pennarello permanente resistente agli sbavature, impermeabile.
   1. Utilizzando una lama bisturi, rimuovere il tronco encefalico dal contenitore e posizionare su carta assorbente. Asciugare delicatamente qualsiasi eccesso di liquido, sangue o pelliccia con un secondo tovagliolo di carta per rivelare solo il tessuto del tronco encefalico¹³. Se necessario, sezionare il tessuto del tronco encefalico per rivelare una sezione trasversale.
   2. Toccare delicatamente il vetrino del microscopio alla sezione trasversale del tessuto del tronco encefalico. Toccare la diapositiva sul tronco encefalico in diversi punti senza movimento laterale per consentire il trasferimento di più aree del tronco encefalico alla diapositiva¹³. Assicurarsi che solo 1 o 2 strati di cellule vengono trasferiti dal tessuto cerebrale alla diapositiva con un tocco delicato. Non è necessario alcun agente di montaggio per apporre il tessuto del tronco encefalico ai vetrini. Includere un controllo positivo e negativo in ogni esecuzione DRIT.
2. Lasciare asciugare all'aria i vetrini ad aria per circa 5 min a temperatura ambiente.
3. Immergere le diapositive in una formalina tampobuffer al 10% per 10 min (piatto 1).
4. Togliere i vetrini dalla formalità e risciacquare in una soluzione di TPBS (piatto 2).
5. Immergere i vetrini nel perossido di idrogeno del 3% per 10 min (piatto 3).
6. Togliere i vetrini dal perossido di idrogeno e risciacquare in TPBS fresco (piatto 4). Dopo aver rimosso il perossido di idrogeno in eccesso, posizionare i vetrini in TPBS fresco (piatto 5) e lavorare con una diapositiva alla volta mentre gli altri vetrini rimangono immersi nel TPBS.
7. Prendere le diapositive dal TPBS (piatto 5) uno alla volta, scrollarsi di dosso e macchiare tampone in eccesso, e mettere su un tovagliolo di carta inumidito sul banco di laboratorio, come base di una 'camera di umidità'. Utilizzando una pipetta, cadere abbastanza anticorpo primario virus anti-rabies su ogni diapositiva per coprire il tessuto CNS. Incubare i vetrini per 10 minuti nella camera di umidità (cioè, coprendo i vetrini con piastre e altre lastre semplici mentre sono posati sul tovagliolo di carta inumidito) a temperatura ambiente (Figura 2).
8. Togliere i vetrini dalla camera di umidità, agitare e cancellare il coniugato in eccesso e sciacquare i vetrini in TPBS (riutilizzare lo stesso TPBS nel piatto 5).
9. Lavorando con una diapositiva alla volta, mentre altri rimangono immersi in TPBS - utilizzare una pipetta per far cadere abbastanza complesso streptavidin-peroxidase per coprire il tessuto CNS. Incubare nella camera di umidità per 10 min a temperatura ambiente.
10. Togliere i vetrini dalla camera di umidità, agitare e soffiare il complesso in eccesso e sciacquare i vetrini in TPBS (piatto 5).
11. Lavorando con una diapositiva alla volta, scrollarsi di dosso e macchiare tampone in eccesso, mentre altri rimangono immersi in TPBS - utilizzare una pipetta per cadere abbastanza AEC (preparazione è spiegato sopra e dovrebbe essere fatto immediatamente prima dell'uso) per coprire il tessuto CNS. Incubare nella camera di umidità per 10 min a temperatura ambiente.
12. Sciacquare i vetrini in acqua distillata (piatto 6).
13. Mettere i vetrini nella contromacchia di Gills Hematoxylin (diluito 1:1 con acqua distillata) per 2 min (piatto 7).
14. Immediatamente immergere tutti gli scivoli in acqua distillata (piatto 8). Ripetere due volte con acqua dolce ogni volta (piatti 9 e 10).
15. Lavorando con una diapositiva alla volta, mentre altri rimangono immersi in acqua distillata (piatto 10) - agitare e macchiare l'acqua in eccesso e utilizzare un mezzo di montaggio solubile in acqua per apporre uno slittamento di copertura.
16. Utilizzare un microscopio luminoso con un obiettivo 20x per visualizzare i vetrini e un obiettivo 40x se è necessaria un'ispezione più approfondita.

Risultati

I risultati positivi del DRIT mostrano inclusioni virali intractoplasmiche rosse che possono variare in forma e dimensioni (Figura 3) all'interno del citoplasma dei corpi cellulari bluastri. Le inclusioni appaiono lisce con margini molto luminosi e un'area centrale meno macchiata. L'intensità e la distribuzione dell'antigene vengono registrate quando vengono rilevate inclusioni. L'intensità è graduata da 4 a 1 USD. Il vetrino di controllo positivo dovrebbe avere un'intensa e evidente brillantezza magenta che viene definita un'intensità di 4 dollari. Una leggera perdita di colore può verificarsi soprattutto quando la manipolazione del campione non è stata ottimale (cioè, il tessuto campione si è leggermente decomposto) e questi dovrebbero essere classificati come 3 dollari. Notevolmente macchia opaca è classificato come un da 2 a 1 , non è considerato diagnostico per l'infezione da virus della rabbia ed è etichettato come indeterminato.

Inoltre, la distribuzione dell'antigene è classificata da 4 a 1, con la distribuzione dell'antigene pari a quella dell'antigene che comprende un'abbondanza di inclusioni grandi e piccole che variano per dimensioni e forma, e presenti in ogni campo (o quasi ogni campo) di vista all'interno del tessuto CNS impressione tocco. Il controllo positivo ha in genere una distribuzione dell'antigene di 4 dollari. Una distribuzione dell'antigene di 3 dollari verrebbe assegnata quando ci sono inclusioni in una varietà di dimensioni nella maggior parte ma non in tutti i campi visivi. Se le inclusioni si trovano nel 10%-50% dei campi del microscopio, viene assegnata una distribuzione dell'antigene . Quando le inclusioni si trovano nel <10% dei campi del microscopio, viene assegnata una distribuzione dell'antigene n. 1.

La maggior parte dei tessuti CNS con virus della rabbia presentano inclusioni virali tipiche classificate come 3 o 4 dollari di intensità e distribuzione di antigeni. Se i risultati indicano un'intensità di 2 o 1 usd o una distribuzione dell'antigene di 2 o 1, il campione viene dichiarato "indeterminato" e il test di ripetizione è giustificato. Se lo stesso campione ha un risultato di test indeterminato ripetuto, il campione deve essere inviato a un laboratorio di riferimento per il DFA o test di conferma correlati.

Un campione di prova che utilizza il DRIT è considerato negativo per gli antigeni del virus della rabbia dopo che la diapositiva contenente il tessuto CNS è stata analizzata con un ingrandimento di 200X o superiore e non vengono rilevate inclusioni di virus tipiche (Figura 4). I campioni negativi presentano corpi cellulari bluastri con poca o nessuna colorazione non specifica.

Figura 1: Impostazione di 10 piatti di colorazione con reagenti per il test. I piatti sono etichettati con il nome del reagent nell'ordine necessario per seguire il protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Camera di umidità semplice creata con un asciugamano di carta bagnata e piastre di coltura cellulare.  Una semplice camera di umidità con un tovagliolo di carta bagnato e piastre di coltura cellulare consente l'applicazione sul campo.  Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: diapositive rappresentative di inclusioni virali positive della rabbia con 4 dollari di intensità e distribuzione di antigeni da 4 dollari. (A e B) mostrano inclusioni virali di rabbia positive a un ingrandimento 200x. (C e D) mostrano inclusioni virali di rabbia positive a un ingrandimento 400x. Barre di scala - 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Diapositive rappresentative di campioni negativi senza inclusioni virali di rabbia. (A e B) mostrano campioni negativi per le inclusioni virali della rabbia a un ingrandimento 200x. (C e D) mostrano campioni negativi per le inclusioni virali della rabbia a un ingrandimento di 400x. Barre di scala - 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Fotografie rappresentative delle strutture di test DRIT utilizzate da USDA WS. (A) Impianto di collaudo mobile in un rimorchio chiuso per il trasporto. (B) Veicolo ricreativo ammodernato per i test DRIT. (C) DRIT in collaborazione con il laboratorio universitario. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il DRIT è un metodo flessibile adatto per la sorveglianza sul campo per rilevare la presenza di virus della rabbia che può essere utilizzato in aree di laboratorio decentralizzate. Sebbene sia possibile condurre l'intero test in un ambiente sul campo, ad esempio sul portellone di un camion, è ideale avere un piccolo spazio interno dedicato alla DRIT a causa di problemi chimici, di attrezzature e di stoccaggio delle forniture. Inoltre, è necessario considerare l'adesione a tutte le leggi federali, statali e locali applicabili e alle normative per l'uso e lo smaltimento delle sostanze chimiche. Attualmente, USDA WS dispone di 15 strutture DRIT per testare campioni provenienti da 17 stati. Le strutture DELL'USDA WS DRIT sono istituite in collaborazione con laboratori universitari e statali di sanità pubblica, in locali designati all'interno di strutture più grandi e in rimorchi chiusi che sono stati ammodernati e convertiti per servire come unità di prova mobili nel in caso di risposta di emergenza alle epidemie in cui è fondamentale un test di sorveglianza avanzata della rabbia con tempi di consegna immediati (Figura5).

Mentre il test è riuscito a utilizzare materiale del tronco encefalico di qualità variabile, tessuto fresco del tronco encefalico senza decomposizione del tessuto è ottimale. Quando si verifica la decomposizione, la descazione o la liquefazione, la qualità del campione diminuisce e il test può rilevare una colorazione più non specifica che può confondere i risultati. Questa osservazione è simile tra DFA e DRIT². Il tronco encefalico/CNS deve essere raccolto il prima possibile e poi conservato congelato (-20 gradi centigradi) fino al test.

In genere, la maggior parte delle strutture USDA WS elabora da 12 a 24 diapositive contemporaneamente durante una sessione DRIT, tra cui un controllo positivo e un controllo negativo che sono stati confermati tramite DFA. I controlli positivi e negativi forniscono un punto di riferimento per ogni esecuzione DRIT per garantire che il test abbia avuto esito positivo e per verificare se vengono poste domande interpretative sui vetrini del test. Se un campione non è determinato ad avere un chiaro risultato positivo o negativo, viene etichettato come indeterminato e testato una seconda volta dal DRIT. Se questo esempio non è un chiaro positivo o negativo dopo due test DRIT, viene inviato a un laboratorio di riferimento per DFA o test correlati.

Come con qualsiasi test diagnostico, 'risoluzione dei problemi' è utile con risultati imprevisti. Ad esempio, se una corsa DRIT non ha esito positivo (cioè, il controllo positivo non presenta intensità di colorazione di 3 o 4 dollari e la distribuzione dell'antigene), assicurarsi che tutte le sostanze chimiche e i reagenti non siano scaduti. Abbiamo trovato utilizzando una bottiglia appena aperta di perossido di idrogeno ad un minimo di una volta alla settimana è utile per aiutare a prevenire la colorazione non specifica attraverso l'ossidazione del tessuto cerebrale. Inoltre, si consiglia di sostituire il buffer di acetato almeno una volta all'anno al minimo, indipendentemente dalla data di scadenza etichettata.

Ci sono una serie di vantaggi del DRIT rispetto al DFA, tra cui costi inferiori, capacità di eseguire il test al di fuori di un laboratorio centralizzato, necessità di microscopia solo leggera invece di un microscopio fluorescente, e il processo di formazione relativamente semplice per persone che amministrano e leggono il test^2,3,4. Questi vantaggi, abbinati alla sensibilità e alla specificità del DRIT che sono paragonabili a DFA^2,7,8,9 hanno già dimostrato che il test serve come uno strumento importante in larga scala programmi di sorveglianza della rabbia potenziati^8,10 in Nord America. Inoltre, il DRIT ha il potenziale per consentire una maggiore sorveglianza e più test tempestivi nei paesi in via di sviluppo o in altre aree con risorse limitate, soprattutto dopo le recenti linee guida OIE/OMS come test consigliato.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz	Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)	s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package	Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)	PN110	Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-823-2A	BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent	Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01BLU	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	12-553-465	Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	07-200-300	Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-959-70C	Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	08-772-5	Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-827-122	Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	102092-122	Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SF100-4	Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SH30256LS	Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3%	Multiple Vendors		Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x	Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF8481	Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)	AMD Next (www.amdnext.com)	999112314	Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL	SeraCare (https://www.seracare.com/)	5550-0001	KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P3813	Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies			Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-1	VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-10	VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-5	VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	22-050-201	Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-868	Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	101412-452	Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock	Multiple Vendors		Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-902	Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P1754	Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	89038-272	Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	06-408C	DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm	Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)	2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01WHT	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)