מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

Summary

מבחן אימונוהיסטוכימיה מהירה ישירה (DRIT) מציע ארגון עולמי לבריאות בעלי חיים וארגון הבריאות העולמי (OIE/מי) המזוהה נגד נוגדן פלורסנט ישירה (DFA) מבחן לאבחון כלבת. בדיקה זו מאפשרת יישומים מבוססי שדה שניתן לבצע בתוך כ 1 שעות על רשמים במוח באמצעות מיקרוסקופ אור.

Abstract

מעקב מבוסס מעבדה הוא אינטגרלי עבור מניעת כלבת, שליטה וניהול מאמצים. בעוד DFA הוא תקן זהב לאבחון כלבת, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת, במיוחד במדינות מתפתחות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי עבור ה-DRIT כאפשרות בדיקה חלופית, מעבדה או מבוססת שדה המשתמשת במיקרוסקופ אור לעומת DFA. טביעות מגע של רקמת המוח שנאספו מבעלי חיים חשודים קבועים ב 10% פורמאלין מאגור. The DRIT משתמש וירוס כלבת-שבטיים ספציפי או נוגדנים שבטיים (מצופנים ל biotin), אנזים streptavidin-peroxidase, וכתבת כרומוגן (כגון מרחריל 3-אמינו -9-ethylcarle) כדי לזהות הכללות ויראליות בתוך הרקמה הנגועה. בתוך 1 h, דגימת רקמות המוח ניתן לבחון ולהתפרש על ידי DRIT. הערכה של מוחות בעלי חיים חשוד נבדק מתוך מגוון רחב של מינים בצפון אמריקה, אסיה, אפריקה, ואירופה מומחשים רגישות גבוהה וספציפיות על ידי DRIT מתקרב 100% עם תוצאות לעומת DFA. מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות של מחלקת שירותי בעלי חיים בארה ב ביצעה בקנה מידה גדול של מאמצים משופרים לכלבת באמצעות ה-DRIT כדי לבחון > דגימות שנאספו מחיות בר בתחומי ניהול אסטרטגי של כלבת . ה-DRIT מספק כלי רב עוצמה וחסכוני לאבחון כלבת, שניתן להשתמש בו על ידי מעבדות וביולוגים שדות כדי לשפר את הפיקוח, תוכניות המניעה והבקרה הנוכחיות של הכלבת.

Introduction

בעוד dfa הוא המבחן הנפוץ ביותר עבור אבחון כלבת שגרתית¹, העלות של רכישת ושמירה על מיקרוסקופ פלורסנט יכול להיות מגביל למדינות מתפתחות^2,3,4 ועבור רחבה, תוכניות מעקב משופרות בקנה מידה גדול של כלבת^3,4. בנוסף, DFA דורש את היכולת להכניס דגימות למקרר במהלך קיבעון לבין הדגימות דגירה מעל טמפרטורת הסביבה במהלך התגובות נוגדנים-אנטיגן, אשר יכול להיות משוכה משמעותית במדינות ללא תשתית מתאימה. בהתאם למגבלות הקשורות לבדיקות DFA מודרניות, ההשפעה הגלובלית של כלבת כבר מזמן לא העריכו את⁵.

בהקשר זה, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת ברחבי העולם, בעיקר במדינות מתפתחות. פרוטוקול DRIT המוצג כאן מציע חלופה בדיקה מעבדה או מבוססת על שדה DFA המשתמשת מיקרוסקופ אור אינו דורש קירור או מעבדה דגירה במהלך המבחן⁶. ה-DRIT ו-DFA דומים בכך ששתי הטכניקות משתמשות בטביעות מגע של דגימות מוח שנאספו מחיות שעשויות להיות בעלי כלבת-נגוע. עם זאת, השלב הראשון של ה-DRIT משתמש בפורמאלין כקיבעון היסטורי לדגימות, המבטלת את נגיף הכלבת. זה מספק שיפור ביולוגי משמעותי על האצטון המשמש כדי לתקן דגימות בפרוטוקול DFA³, אשר חשוב לא רק במעבדה, אבל אולי אפילו יותר בסביבות מעבדה מבוססי שדה או מבוזר. עד היום, drit מראה רגישות וספציפיות שווה dfa^2,7,8,9.

מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות האמריקאית ביצעה מאמצים משופרים בתחום הכלבת בצפון אמריקה תוך שימוש ב-DRIT כחלק מתוכנית הניהול המקיפה של כלבת החיות¹⁰. מעקב משופר כלבת משמש כהשלמה לחשיפה מבוססת על בריאות הציבור מעקב ובדיקות בעיקר חיות מיני-טורף מינים, כולל דביבונים (לוטור לובל), בואשים פסים (מפיטיס מפיטיס), שועלים אפורים ( שועלים אדומים (וולפסי), וזאביערבות (כלב לאטטרנס) שלא היו מעורבים בחשיפה אנושית או בעלת חיים במשפחה. גוויות בעלי חיים המשמשות בבדיקות הוגשו לשירות משרד החקלאות באמצעות מאמצי מעקב משופרים וכללה מינים וקטוריים של כלבת שאינם: משחק מסוכן או מוזר; נמצא מת, נהרג כביש או מטרד; ואינם משויכים לחשיפה לבעלי חיים אנושיים או ביתיים. DRIT מספק מבחן אבחון כלבת שיכול להיות מועסק על ידי ביולוגים שדה מאומנים עם ניסיון קטן או לא מעבדה כדי לשפר את הפיקוח על הכלבת ולהפחית את הנטל הפיננסי ואת עומס העבודה של מעבדות אבחון בריאות הציבור¹⁰. הכשרה DRIT בסיסית עבור עובדי התחום של משרד החקלאות בדרך כלל לוקח 1.5 כדי 2 ימים, אשר כולל כ 4 h של הוראת כיתה כיסוי עקרונות בסיסיים של biosafety טיחות, שיטות איסוף לדוגמה ואת תהליכי DRIT, כמו גם > 8 h של זמן המעבדה מתנהל במבחן. הזדמנויות הכשרה היו זמינים משרד החקלאות ומפעילי התוכנית דרך המרכזים לבקרת מחלות ומניעה (CDC), LYSSA LLC, ואת המכון Wistar.

בתחומי הניהול האסטרטגי, משרד החקלאות הבין בודק למעלה מ-94,000 דגימות חיות הבר באמצעות DRIT וזיהה יותר מ-1,850 דגימות נגוע בכלבת, כי היה סביר להניח שאינם מזוהים להסתמך רק על חשיפה מבוססת בריאות הציבור של חיות חשוד. מעקב משופר של מידע כלבת שסופקו על-ידי תוצאות DRIT הם קריטיים לספק הזמן מלאה יותר וייצוג מרחבי של כלבת על הנוף לתמיכה של תוכניות חיסון אוראלי לכלבת עבור חיות בר ברחבי ארה ב^10, . בסדר, ¹¹ באופן דומה, סוכנויות חיות הבר מחוזי בקנדה שילבו DRIT לתוך קנה מידה גדול כלבת חיות מעקב מאמצי בשילוב עם תוכניות בריאות הציבור שלהם עם הצלחה⁸. הן משרד החקלאות ותוכניות המעקב הקנדי DRIT השתמשו במעבדות התייחסות לאומיות כדי לאשר כלבת על ידי DFA ולבצע משתנה ויראלי הקלדה כראוי⁸. יתר על כן, ביולוגים משרד החקלאות לשלוח 10% של דגימות שליליות עבור אישור DFA להפנות מעבדות ומאז 2008, השתתפו בדיקות מיומנות DRIT השנתי שסופקו על ידי המעבדה הממלכתית של ויסקונסין היגיינה, כחלק סטנדרטי אמצעי הבטחת איכות.

מטרת שיטה זו היא להציע גישה חלופית לבדיקות אבחון כלבת שניתן לבצע במעבדות מבוזרות, בתחום, או באזורים ללא גישה שגרתית למיקרוסקופיה אלקטרונית.

Protocol

כל אדם המבצע בדיקות אבחון כלבת צריך לקבל סדרת חיסון טרום חשיפה לכלבת כלבת ולעבור הערכת נוגדנים שוטפת לאבחון, עם החיסון המאיץ לפי הצורך. אנשים שאינם מחיסונים לא צריכים להיכנס למעבדות או אזורים שבהם עבודה כזאת מתנהלת. כל מניפולציה של רקמות ושקופיות צריך להתבצע כדי לא ניקה נוזלים או לייצר חלקיקים מוטס. בגדי מנדפים אינם נדרשים, אך בזמן האפשרי הם יכולים לספק הגנה נוספת מפני ריחות, ectop, ושברי עצמות. מינימום ציוד מגן אישי, כולל כפפות והגנה על העין, יש לענוד בכל עת במהלך איסוף ובדיקות לדוגמה.

1. איסוף גזע המוח

1. לאסוף דגימות המוח או מיד על אוסף גווייה או לוודא כי הגוויות ממוקמות מקפיאים לאחסון עד בדיקות מאוחרות יותר. אם הגוויות של בעלי חיים קפואות, הפשרת בטמפרטורת הסביבה לפני איסוף המוח בשביל להקל על האיסוף. בנסיבות מסוימות, הדגימות נאספים ישירות מחיה קפואה.
2. עבור בעלי חיים שנאספו טרי או שהיו מופשרים לטמפרטורת הסביבה, מיקום החיה פרקדן על משטח שטוח עם עמוד השדרה הצווארי מעט מסובב לכיוון הבוחן. על ההיבט הצדדי. של עמוד השדרה הצווארי
   1. לגוויות שעדיין קפואות לחלוטין, הציבו את מיקום החיה כמתואר לעיל, אם מעשי. השתמש מסורים, סכינים, מזמרה עצם או ציוד דומה כדי להפריד לחלוטין את הראש מהגוף.
      הערה: כל הציוד שבשימוש אינו צריך להתנקות ביסודיות בין דגימות.
3. באמצעות להב אזמל, לעשות חתך ברמה של מפרק atlanto-העורף על ההיבט הגחוני, חיתוך דרך כל השכבות של השריר ורקמות רכות, כולל קנה הנשימה ואת הוושט. המשך עד שהוא מקורב להיבט הקדמי של חוליות עמוד השדרה הצווארי. עבור רקמה קפואה, השתמש להב אזמל כדי להסיר את כל השכבות הנותרות של רקמת השריר והרקמה הרכה כדי לחשוף את מגנום foramen.
4. הזיזו את ראשו של בעל החיים לשלוחה של טווח הסיום עד שגבעול המוח יהיה גלוי. השתמש להב אזמל כדי להסיר את כל המוח נראה לעין/מערכת העצבים המרכזית (CN) רקמות לדיגום. לדוגמה קפואה, השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את החלק הגדול מרקמת המוח הקפואה והפנימית ככל האפשר מתוך הגולגולת.
5. מניחים את דגימות המוח במיכל בלתי שביר (כלומר, משחה מתכת פח, בקבוקון ההקפאה, וכו ') ותווית בהתאם.
6. ודא כי דגימות גזע המוח נבדקים מיד לאחר איסוף באמצעות מבחן DRIT, קירור (4 ° c) עד 24 שעות לפני בדיקה, או קפוא (-20 ° c) עד הזמן של בדיקה אם הבדיקה יתקיים יותר מ 24 שעות לאחר איסוף המדגם.

2. הכנת חומרים ל-DRIT

1. הגדרת 10 מנות מכתים שקופיות (איור 1)
   הערה: צביעת מנות עמוקים מספיק כדי לאפשר טבילה מלאה של שקופית (קוטר 96 מ"מ, גובה 72 מ"מ, עומק 42 מ"מ, נפח 250 mL). מיכל בן ⁶
   1. מילוי מנה 1 עם באגירה 10% פוספט. החלף את פורמלין לאחר הפעלת שני מבחנים או שבועי.
   2. מילוי מנות 2, 4, ו 5 עם מלוחים באגירה פוספט עם 1% רצף-80 (TPBS). החלף עם TPBS טרי לפני כל בדיקה.
   3. . מילוי צלחת 3 עם 3% חמצן מימן . תחליף מי חמצן לפני כל בדיקה
   4. ממלאים את הכלים 6, 8, 9, ו -10 עם מים מזוקקים או מוהים. להחליף מים לפני כל בדיקה.
   5. מילוי צלחת 7 עם הניסוח זימים המטאוקסילין2 מדולל ביחס 1:1 במים מזוקקים⁶. החלף את המטאוקסילין לאחר הפעלת 2 בדיקות או שבועי.
      הערה: על פי פרוטוקול DRIT המקורי שפותחה על ידי ה-CDC¹², יחס 1:2 של זימים המטאוקסילין למים ניתן להשתמש אם כתמים הנגד הוא כהה מדי.
2. הכנת פתרון מניות של אמינו-אתילקרזולה (AEC)
   1. באמצעות פיפטה זכוכית, מקום 5 מ ל של N, N-diמתילפימיד במיכל זכוכית.
   2. להוסיף 1 20 mg לוח של 3-אמינו -9-ethylcarבזולה ולנער עד התפרקה לחלוטין. סמן את הצנצנת באמצעות "AEC stock" ואת התאריך שבו ביצע המניה.
      הערה: פתרון מניות AEC ניתן לאחסן תחת קירור (4 ° c) ומשמש 1-2 חודשים.
3. הכנת דילול העבודה של AEC
   1. הוסף 7 מ ל של מאגר אצטט ל 15 מ ל זונדה צנטריפוגה.
   2. באמצעות פיפטה זכוכית, להוסיף 0.5 mL של פתרון מניות AEC לשפופרת צנטריפוגה.
   3. הוסף 0.075 mL של 3% חמצן מימן לצינור.
   4. לסנן את הפתרון עם מזרק 10 מ ל באמצעות פילטר מזרק 0.45 יקרומטר.
      הערה: דילול העבודה AEC יש ליצור רק לפני כל מבחן DRIT כפי שהוא יציב רק עבור 2-3 h.

3. בדיקת אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

1. תווית מיקרוסקופ זכוכית שקופיות עם מספר ייחודי עבור כל דגימה באמצעות הכתם הוכחה, עמיד למים, סמן דיו קבוע.
   1. באמצעות להב אזמל, להסיר את גזע המוח מן המיכל ומניחים על מגבת נייר. בעדינות למחוק את כל עודף של נוזל, דם, או פרווה עם מגבת נייר שנייה כדי לחשוף רק את רקמת גזע המוח¹³. במקרה הצורך, החלק את רקמת המוח כדי לחשוף חתך רוחב.
   2. גע בעדינות מאוד את שקופית המיקרוסקופ לחתך הצלב של רקמת גזע המוח. לגעת בשקופית כדי המוח בנקודות מספר ללא תנועה לרוחב כדי לאפשר אזורים מרובים של גזע המוח להיות מועברים שקופית¹³. ודא שרק 1 או 2 שכבות של תאים מועברים מרקמת המוח לשקופית בנגיעה עדינה. אין צורך בסוכן לצרף את רקמת המוח לשקופיות. כלול הן שליטה חיובית ושלילית בכל הפעלה של DRIT.
2. תנו לשקופיות להתייבש באוויר במשך כ -5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הישאב את השקופיות ב-10% במאגר האגירה עבור 10 דקות (מנה 1).
4. הסר את השקופיות מפורמאלין וטבול-שטוף בתמיסה של TPBS (מנה 2).
5. לטבול את השקופיות 3% חמצן מימן עבור 10 דקות (צלחת 3).
6. הסר את השקופיות מתחמוצת המימן ושטוף מטבל ב TPBS טרי (צלחת 4). לאחר הסרת חמצן עודף מימן, למקם את השקופיות TPBS טרי (צלחת 5) ולעבוד עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד השקופיות האחרות להישאר שקוע ב TPBS.
7. קח את השקופיות מ TPBS (מנה 5) אחד בכל פעם, להתנער ולמחוק מאגר עודף, ולהניח על מגבת נייר לחלח על ספסל במעבדה, כבסיס של "חדר לחות". באמצעות הפיפטה, ירידה מספיק נוגדן וירוס הראשי נגד כלבת על כל שקופית כדי לכסות את רקמת ה-CN. הנחת השקופיות למשך 10 דקות בחדר הלחות (כלומר, כיסוי שקופיות עם לוחות היטב או כיסוי פשוט אחר בזמן שהם מונחים על מגבת נייר הרטובה) בטמפרטורת החדר (איור 2).
8. הסר את השקופיות מחדר הלחות, טלטל ומלא את העודף המשלים, ושטוף את השקופיות ב-TPBS (שימוש חוזר באותו TPBS במנה 5).
9. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד שאחרים נשארים שקועים ב-TPBS-משתמשים בפיפטה כדי להוריד מספיק streptavidin-peroxidase קומפלקס כדי לכסות את רקמת ה-CN. מודקון בחדר הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
10. הסר את השקופיות מחדר הלחות, טלטל ומחק את מורכבות העודפים, ושטוף את השקופיות ב-TPBS (מנה 5).
11. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, לנער ולמחוק מאגר עודף, בעוד אחרים נשארים שקוע TPBS-להשתמש בצנרת כדי להוריד מספיק AEC (הכנה מוסבר לעיל ויש לעשות מיד לפני השימוש) כדי לכסות את רקמת ה-CN. מודקון בחדר הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
12. מטבל-לשטוף את השקופיות במים מזוקקים (צלחת 6).
13. מניחים את השקופיות בכתם נגד של זימים המטאוקסילין (מדולל 1:1 עם מים מזוקקים) עבור 2 דקות (צלחת 7).
14. לשטוף מיד לטבול את כל השקופיות מים מזוקקים (צלחת 8). חזרו פעמיים עם מים מתוקים בכל פעם (מנות 9 ו -10).
15. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד שאחרים נשארים שקועים במים מזוקקים (מנה 10) — מטלטל ומוריד את המים העודפים ומשתמשים במדיום מסיסים במים כדי לצרף שובר כיסוי.
16. השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרה 20x כדי להציג את השקופיות ואת המטרה 40x אם הבדיקה הקרובה נחוצה.

תוצאות

תוצאות חיוביות של DRIT להראות אדום תאיים ויראלי הכללות שיכולות להשתנות בצורה ובגודל (איור 3) בתוך הציטופלסמה של גופים תא כחלחל. ההכללות מופיעות חלקות עם שוליים בהירים מאוד ואזור מרכזי פחות מוכתם באופן אינטנסיבי. העוצמה והתפלגות האנטיגן נרשמים בעת זיהוי הכללות. העוצמה מדורגת מ-+ 4 ל-+ 1. שקופית השליטה החיובית צריכה להיות בעלת ברק מגנטה אינטנסיבי ומבריק, המכונה בעוצמה של +4. אובדן קל של צבע יכול להתרחש במיוחד כאשר טיפול לדוגמה לא היה אופטימלי (כלומר, רקמה לדוגמה יש מפורקת מעט) ואת אלה יש לציון כמו +3. כתם עמום במידה ניכרת מדורגת כמו + 2 כדי + 1, לא נחשב אבחון עבור זיהום וירוס בכלבת והוא מתויג כמו לא מוגדר.

בנוסף, התפלגות אנטיגן מדורגת מ + 4 ל + 1 עם + 4 המייצג התפלגות אנטיגן מורכב שפע של הכללות גדולות וקטנות שונות בגודל וצורה, וההווה בכל שדה (או כמעט כל שדה) של השקפה בתוך רקמת ה-CN . התרשמות ממגע לפקד החיובי יש בדרך כלל התפלגות אנטיגן + 4. התפלגות אנטיגן של +3 תוקצה כאשר יש הכללות במגוון גדלים ברוב התחומים, אך לא בכל תחומי התצוגה. אם נמצאו הכללות ב-10%-50% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן + 2. כאשר נמצאו הכללות ב-< 10% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן +1.

רוב רקמת מערכת החשמל עם נגיף הכלבת נוכח הצגת הכללות ויראליות אופייני מדורגים כמו +3 או +4 התפלגות אנטיגן. אם התוצאות מציינות את האינטנסיביות + 2 או +1 או את התפלגות האנטיגן + 2 או +1, המדגם מוצהר על בדיקת "לא מוגדר" ובדיקה חוזרת מוצדקת. אם לאותה דגימה יש תוצאת בדיקה לא מוגדר, יש לשלוח את המדגם למעבדת ייחוס עבור DFA או בדיקות confirmatory קשורות.

דגימת בדיקה באמצעות DRIT נחשב שלילי עבור אנטיגנים וירוס כלבת לאחר שקופית המכילה את רקמת ה-CN נסרקה בהגדלה של 200X או יותר ואין הכללות וירוסים טיפוסי מזוהים (איור 4). דגימות שליליות מפגינות תאים כחלחלים. עם כתמים קטנים או לא ספציפיים

איור 1: ההתקנה של 10 מנות הצביעת השקופית עם ריאגנטים לבדיקה. המנות מסומנות בשם מגיב בסדר הדרוש כדי לעקוב אחר הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: חדר לחות פשוט שנוצר עם מגבת נייר רטובה ולוחות תרבות תא.  תא לחות פשוט באמצעות מגבת נייר רטובה ולוחות תרבות התא מאפשר יישום מבוסס שדה.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שקופיות הנציג של כלבת הכללות ויראליות חיוביות עם אינטנסיביות 4 ו +4 התפלגות אנטיגן. (A and B) להראות חיובי כלבת ויראלי הכללות ב 200x הגדלה. (C ו -D) להראות חיובי כלבת ויראלי הכללות ב 400 x הגדלה. קנה מידה ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שקופיות מייצגות של דגימות שליליות ללא הכללות ויראליות של כלבת. (A ו- B) מראים דגימות שליליות עבור הכללות ויראליות של כלבת בהגדלה של 200 x. (C ו -D) מראים דגימות שליליות להכללות של כלבת בהגדלה של 400 x. קנה מידה ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות מייצגות של מתקני בדיקות DRIT בשימוש של משרד החקלאות. (א) מתקן בדיקה ניידת בטריילר סגור להובלה. (ב) הרכב בשעות הפנאי הותאם לבדיקת drit. (ג) drit בדיקת מתקן בשיתוף עם מעבדה באוניברסיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

DRIT היא שיטה גמישה המתאימה מבוסס שדה מעקב כדי לזהות את הנוכחות של וירוס כלבת כי ניתן להשתמש באזורי מעבדה מבוזרים. אמנם ניתן לבצע את הבדיקה כולה בהגדרה מבוססת שדה כגון על החלל הפנימי של משאית, זה אידיאלי יש מקום קטן, מקורה מוקדש DRIT בשל כימיקלים, ציוד אחסון בעיות האספקה. בנוסף, הקפדה על כל החוקים הפדרליים, המדינה והמקומיים, והתקנות לשימוש כימי ולסילוק החומרים חייבים להיחשב. כיום, משרד החקלאות האמריקנית מציע 15 מתקני DRIT כדי לבדוק דגימות מ -17 מדינות. מתקני משרד החקלאות הלאומית drit הוקמו בשיתוף עם האוניברסיטה ומעבדות בריאות הציבור המדיני, בחדרים מיועדים בתוך מתקנים גדולים ובטריילרים סגורים כי כבר הפכו והומרו לשמש יחידות בדיקה ניידות ב אירוע של תגובת התפרצות חירום שבה בדיקה משופרת של מעקב אחר כלבת עם זמן הטיפול המיידי הוא קריטי (איור 5).

בעוד הבדיקה הצליחה באמצעות חומר בדיקת גזע של איכות משתנה, רקמת המוח טרי ללא התפרקות רקמות הוא אופטימלי. כמו ריקבון, התייבשות, או ניזול מתרחשת, איכות לדוגמה פוחתת הבדיקה עשויה לגלות מכתים יותר לא ספציפי אשר יכול לבלבל את התוצאות. התבוננות זו דומה בין DFA לבין DRIT². יש לאסוף את המוח במהירות האפשרית ולאחר מכן לאחסנם מוקפאים (-20 ° c) עד לבדיקה.

בדרך כלל, רוב מתקני משרד החקלאות מ 12 עד 24 שקופיות בבת אחת במהלך הפעלת DRIT, כולל אחד שליטה חיובית ושליטה אחת שלילית כי אושרו באמצעות DFA. פקדים חיוביים ושליליים מספקים נקודת התייחסות לכל הפעלה של DRIT כדי לוודא שהבדיקה הצליחה ולאשר אם השאלות המפרטיביות עולות על שקופיות הבדיקה. אם מדגם לא נקבע כתוצאה חיובית ברורה או שלילית, הוא מתויג כקבוע ונבדק פעם שנייה על-ידי DRIT. אם דוגמה זו אינה חיובית ברורה או שלילית לאחר שני בדיקות DRIT, הוא נשלח למעבדת התייחסות DFA או בדיקות קשורות.

כמו בכל מבחן אבחון, ' צרות ירי ' הוא שימושי עם ממצאים בלתי צפויים. לדוגמה, אם הפעלת DRIT אינה מצליחה (כלומר, הפקד החיובי אינו מוצג +3 או + 4 כתמים והפצת אנטיגן), ודאו שכל הכימיקלים והחומרים הכימיים לא פגו. מצאנו באמצעות בקבוק חדש שנפתח של תחמוצת מימן במינימום של פעם בשבוע הוא שימושי כדי לסייע למנוע מכתים לא ספציפיים דרך חמצון של רקמת המוח. בנוסף, אנו ממליצים להחליף מאגר אצטט לפחות פעם אחת בכל שנה לכל הפחות, ללא קשר לתאריך התפוגה של התווית.

ישנם מספר יתרונות של DRIT על DFA כולל עלויות נמוכות יותר, היכולת לבצע את הבדיקה מחוץ למעבדה מרכזית, צורך רק מיקרוסקופ אור במקום מיקרוסקופ פלורסנט, ואת תהליך האימונים פשוט יחסית עבור אנשים מנהל וקורא. את המבחן^2,3,4 יתרונות אלה, ביחד עם רגישות וספציפיות של drit הדומות dfa^2,7,8,9 כבר הוכיחו כי הבדיקה משמש כלי חשוב בקנה מידה רחב תוכניות מעקב משופרות כלבת^8,10 בצפון אמריקה. בנוסף, DRIT יש פוטנציאל לאפשר מעקב מוגבר ובדיקות יותר בקשה במדינות מתפתחות או אזורים אחרים עם משאבים מוגבלים, במיוחד לאחר OIE האחרונות/מי הדרכה כמבחן מומלץ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz	Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)	s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package	Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)	PN110	Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-823-2A	BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent	Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01BLU	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	12-553-465	Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	07-200-300	Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-959-70C	Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	08-772-5	Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-827-122	Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	102092-122	Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SF100-4	Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SH30256LS	Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3%	Multiple Vendors		Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x	Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF8481	Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)	AMD Next (www.amdnext.com)	999112314	Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL	SeraCare (https://www.seracare.com/)	5550-0001	KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P3813	Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies			Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-1	VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-10	VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-5	VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	22-050-201	Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-868	Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	101412-452	Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock	Multiple Vendors		Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-902	Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P1754	Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	89038-272	Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	06-408C	DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm	Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)	2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01WHT	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)