Modelo de colgajo Osteomiocucutáneo de extremidades posteriores modificados en la rata para investigación de compuestos alotransplante de compuesto translacional vascularizado

Resumen

El aloinjerto compuesto vascularizado ofrece beneficios que alteran la vida a los receptores de trasplante, pero las causas biológicas del rechazo del injerto y la vascutropatía permanecen poco comprendidas. El modelo quirúrgico de roedores presentado aquí ofrece un modelo reproducible, clínicamente relevante de trasplante, permitiendo a los investigadores evaluar eventos de rechazo y posibles estrategias terapéuticas para prevenir su ocurrencia.

Resumen

El alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) es un campo relativamente nuevo en la cirugía reconstructiva. Los logros clínicos en el VCA humano incluyen trasplantes de mano y cara y, más recientemente, la pared abdominal, el útero y los trasplantes urogenitales. Los resultados funcionales han superado las expectativas iniciales, y la mayoría de los receptores disfrutan de una mejor calidad de vida. Sin embargo, a medida que la experiencia clínica se acumula, se debe abordar el rechazo crónico y las complicaciones de la inmunosupresión. En muchos casos en los que los injertos han fracasado, la patología causativa ha sido vascutropatía isquémica. Los mecanismos biológicos del rechazo agudo y crónico asociado con el VCA, especialmente la vascutropatía isquémica, son áreas importantes de investigación. Sin embargo, debido al número muy reducido de pacientes con VCA, la evaluación de los mecanismos propuestos se aborda mejor en un modelo experimental. Varios grupos han utilizado modelos animales para abordar algunas de las preguntas relevantes sin resolver en el rechazo del VCA y la vascutropatía. Varios diseños de modelos que implican una variedad de especies se describen en la literatura. Aquí presentamos un modelo reproducible de aleteo osteomiocucutáneo de extremidades posteriores VCA en la rata que puede ser utilizado para la investigación de VCA translacional. Este modelo permite la evaluación serial del injerto, incluyendo biopsias y diferentes modalidades de imagen, manteniendo un bajo nivel de morbilidad.

Introducción

La cirugía reconstructiva para la pérdida de tejido catastrófico por amputación, lesiones por explosión, neoplasias malignas y defectos congénitos están limitadas por la disponibilidad de tejido del paciente y la morbilidad adicional causada en el sitio donante. En algunos casos, como las víctimas de quemaduras o los amputados cuadriláteros, el tejido viable para la reconstrucción no está disponible en el paciente. En 1964, el primer trasplante de mano moderno se realizó en Ecuador. Si bien esto fue un éxito técnico, la inmunosupresión disponible en el momento era insuficiente para prevenir el rechazo, y el injerto se perdió en menos de 3 semanas¹. En 1998 y 1999, los trasplantes de primera mano en la era moderna de inmunosupresión se realizaron en Lyon, Francia² y Louisville, Kentucky, usa³. Por primera vez, los cirujanos reconstructivos podrían reemplazar como con like. El trasplante facial se realizó por primera vez en 2005⁴, y ahora se están realizando rutinariamente varios otros injertos de VCA, como la pared abdominal⁵, el útero y los trasplantes urogenitales⁶.

A diferencia del trasplante de órganos sólidos, la mayoría de las técnicas de VCA implican la presencia de la piel de donante altamente antigénico. La experiencia clínica ha determinado que el rechazo agudo de la piel es relativamente fácil de controlar, pero puede contribuir al rechazo crónico de los tejidos y vasos subyacentes, que no responden bien al tratamiento⁷. La disfunción vascular asociada a una respuesta aloinmune es un obstáculo más ominoso para el campo del VCA⁷. Las macrovaslopatías conducen a déficits de perfusión, retraso de la curación y condiciones proinflamatorias. En los receptores de trasplante de mano⁷se producen tanto vascutropatía agresiva de recipiente grande confluido como hiperplasia íntima focal. Además, las microvascupatías probablemente contribuyen a las complicaciones del VCA también y pueden incluso conducir a eventos de rechazo. Si bien tanto los factores inmunes como los no inmunes probablemente desempeñan un papel en la vascutropatía de los receptores de trasplante de manos, no se conocen los mecanismos específicos que promueven la disfunción del recipiente distal en el VCA, particularmente en el contexto de rechazo crónico de bajo grado. Estas preguntas sin respuesta requieren el desarrollo de un modelo de VCA animal que permitirá la evaluación serial del injerto durante el curso clínico de rechazo/mantenimiento de VCA y vascutropatía. Este modelo ofrecerá información sobre el rechazo y la vascutropatía frente a la inmunosupresión, el desafío infeccioso y/u otras lesiones traumáticas postoperatorias^8,9.

Aquí se presenta un modelo de colgajo osteomiocucutáneo VCA heterotópica de rata alogénico. Basado en modelos de VCA previamente publicados, este procedimiento es técnicamente fácil de realizar, reproducible en un gran número, y exhibe una mínima morbilidad y molestias al animal receptor. Este modelo fue diseñado para permitir evaluaciones clínicas e histopatológicas de la aceptación del VCA frente al rechazo, y proporciona una oportunidad para evaluar los mecanismos inmunes y no inmunes subyacentes involucrados en el rechazo.

Protocolo

Todas las cirugías de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Louisville (Protocolo aprobado por la IACUC 18198) y la guía de institutos nacionales de salud (NIH) para el cuidado y uso de Animales de laboratorio¹⁰. Macho de cuatro meses de edad, Brown-Norway (RT1. Aⁿ) y varón de 4 meses de edad Lewis (RT1. A^l) las ratas se utilizaron como donante VCA y receptores, respectivamente.

1. cosecha de aloinjertos de donantes

1. Sedate al animal donante usando isoflurano vaporizado aplicado a través de una cámara.
2. Afeita el área donante del injerto (extremidad posterior), así como las áreas de la ingle y el abdomen. Después de eso, tratar con crema depilatoria con el fin de reducir la cantidad de pelusa dejados por los Clippers.
3. Anestesiar profundamente a los animales donantes que utilicen ketamina intraperitoneal (IP) (60 mg/kg)/xilazina (15 mg/kg)/acepromazina (2 mg/kg). Administrar una dosis inicial de 0,2 mL/100 g de peso corporal y dosis adicionales de 0,2 mL cada h. Para mayor comodidad, es opcional realizar este paso antes del paso 2.
4. Vigile continuamente a los animales mientras está bajo anestesia para la respiración, la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia, usando la prueba de reflejo de abstinencia del dedo del pie.
5. Administrar 30 U de solución de heparina subcutáneamente (SC) en el área de exfoliante antes de la cirugía para prevenir la coagulación.
6. Use una máscara, una cubierta para la cabeza, una bata de aislamiento desechable y guantes desechables.
7. Coloque el animal del donante supino en una almohadilla térmica. Producir un campo quirúrgico estéril preparando, fregando y drapeando el área quirúrgica incluyendo los aspectos ventrales y dorsales de la pierna. Don guantes estériles.
8. Haga una incisión en la piel de 3 cm en la concavidad de la ingle usando la cuchilla del bisturí #15 y refleje la almohadilla de grasa inguinal lateralmente usando tijeras de iris.
9. Exponga los vasos femorales comunes y coloque un gancho de alambre con una banda elástica para retraer los músculos abdominales.
10. Utilizando un microscopio de disección (40x), diseccionar el pedículo proximalmente de la aparición de los vasos femorales comunes bajo el ligamento inguinal y distalmente a la confluencia de los vasos popliteales en el injerto.
11. El uso de microclips y de las pinzas bipolares de joyeros, ligar y divide las grandes ramas arteriales y venosas, como los vasos femoral circunflecos laterales, los vasos epigástricas caudales superficiales, la arteria saphenosa y los vasos femoral caudales proximales, para movilizar los principales vasos femorales. Cauterizar cualquier rama pequeña usando fórceps bipolares finos.
12. Haz una incisión en la piel desde el centro de la piel anterior cortada a lo largo del lado ventral de la extremidad posterior, hasta la zona del tobillo, usando tijeras de iris.
13. Cortar el músculo gracilis, así como los otros músculos aductores por debajo de ella, de una manera vertical para exponer y ligar los vasos de genicular proximal medial, vasos pequeños de ramificación profunda, y el nervio ciático.
    Nota: En este punto, en una mesa quirúrgica separada, el otro cirujano debe intubar y anestesiar (2,5% – 3% isoflurano) el animal receptor; Esto permite a los cirujanos preparar el sitio quirúrgico del receptor a tiempo para la colocación del injerto y minimizar el tiempo isquémico del injerto.
14. En el animal donante, hacer incisiones circunferenciales de la piel en el nivel de la rodilla y el tobillo. Desarticular la rodilla y el tobillo, eliminar el músculo y el tejido extraños, y hacer una incisión vertical de la piel en el lado dorsal de la extremidad posterior para liberar el injerto. En este punto, el injerto (compuesto de peroné y tibia, cubierto con músculos relacionados y la piel de la isla nutrida por sus perforadores) está conectado sólo por el pedicelo.
15. Colocar las pinzas pequeñas tan proximalmente como sea posible en la arteria femoral y la vena, y cortar el pedicelo tan proximalmente como sea posible, cerca del ligamento inguinal.
16. Para vaciar el injerto de sangre, inyectar una solución salina heparinizada (30 U/mL) en la arteria femoral con una cánula contundente de 27 G.
    Nota: La dilatación de la arteria antes de la descarga de heparina permite un fácil acceso para la inserción de la cánula. Durante el enjuague, supervise de cerca el flujo de salida de la vena femoral. Una vez que el fluido transparente sale de la vena femoral, detenga el vaciado.
17. Envolver el injerto aislado en una gasa tibia empapada en solución salina y transportarla inmediatamente a la mesa del animal receptor. En este momento, el sitio quirúrgico receptor ya debe estar preparado para la anastomosis vascular.
18. Después de la cosecha del injerto, inmediatamente eutanasia la rata donante a través de neumotórax.

2. cirugía de trasplante de receptor

1. Después de la inducción de sedación utilizando isoflurano vaporizado aplicado a través de una cámara, anestesiar profundamente el animal receptor a través de un tubo endotraqueal controlado por el respirador y 2.5% – 3% isoflurano.
   Nota: En esta etapa, la rata donante todavía está anestesiada.
2. Monitoree continuamente la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria, la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia del animal receptor, utilizando la prueba de reflejo de retirada del dedo pulgar.
3. Con el fin de prevenir la deshidratación y la hipoglucemia, inyectar 2 mL de la solución de Ringer lactato y 2,5% de dextrosa por vía subcutánea al principio y otros 2 mL al final de la cirugía.
4. Afeite la zona de la ingle y luego tratar con crema depilatoria con el fin de reducir la cantidad de pelusa dejada por los Clippers.
5. Use una máscara, una cubierta para la cabeza, una bata de aislamiento desechable y guantes estériles.
6. Coloque el animal supino en una almohadilla térmica. Aplicar ungüento oftálmico para prevenir las abrasiones corneales durante la anestesia. Producir un campo quirúrgico estéril preparando, fregando y drapeando el área quirúrgica.
7. Haga una incisión en la piel de 3 cm en la concavidad de la ingle usando la cuchilla del bisturí #15 y refleje la almohadilla de grasa inguinal lateralmente usando tijeras de iris.
8. Exponga los vasos femorales comunes y coloque un gancho de alambre con una banda elástica para retraer los músculos abdominales.
9. Ligate y divide las ramas de Murphy.
10. Utilizando 10-0 suturas interrumpidas de nylon, los recipientes anastomose donantes a los recipientes receptores a través de la técnica venosa de extremo a lado y la técnica de extremo a extremo arterial. Libere gradualmente las abrazaderas de la arteria y luego de la vena. Monitoree los sitios anastomóticos para el sangrado y agregue suturas adicionales si es necesario.
11. Evaluar visualmente la anastomosis vascular con el fin de garantizar una reperfusión efectiva del injerto.
12. Inserte el injerto en el bolsillo inguinal y orientarlo al revés, con la articulación del tobillo superior y la articulación de la rodilla inferior.
13. Usando suturas, asegure el injerto a los músculos adyacentes. Cerrar la piel a través de la piel de colchón horizontal interrumpida absorable 4-0 suturas.
14. Retira el animal receptor de la anestesia y destella el respirador. Coloque el animal en una almohadilla térmica para soporte térmico.
    Nota: El tiempo de operación total es entre 3 a 4 h, dependiendo de la experiencia del cirujano y el conocimiento con el procedimiento quirúrgico.
15. Administrar meloxicam (1 mg/kg) por vía subcutánea para la supresión del dolor y vigilar hasta que el animal esté completamente recuperado y móvil.

3. receptor VCA monitoreo

1. Casa las ratas de los receptores individualmente y monitorearlas diariamente para detectar signos clínicos de dolor, deshidratación, pérdida de peso y disminución de la actividad, además de la insuficiencia quirúrgica (para las primeras 48 – 72 h) o el rechazo. Administrar meloxicam por vía subcutánea (1 mg/kg) diariamente durante los primeros 3 días para la supresión del dolor.
2. Basado en el punto final de la investigación, elegir un fármaco inmunosupresor que se administrará.

4. histología

1. Bajo la anestesia isoflurana inhalada (2.5% – 3%), obtener la piel serial y las biopsias musculares subyacentes del injerto del donante en los puntos de tiempo deseados. La piel debe ser lavada y cubierta antes de la obtención de una biopsia, y un campo estéril y la técnica debe realizarse.
2. Cierre la herida con una o dos puntadas, utilizando suturas absorbables de 4-0. Devuelva el animal a su jaula y deje que se recupere de la anestesia.
3. Fije los tejidos biopsiados en tubos separados en un 10% de formalina.
4. En el punto de tiempo de la terminal y bajo la anestesia isoflurana inhalada (2.5% – 3%), tome una biopsia de piel más grande que abarque la frontera donante/receptor. Localice cuidadosamente el par de correa de la embarcación en el sitio de Anastomoses; el sitio adecuado será aparente debido a las suturas. Tome las muestras de recipiente deseadas de la arteria y/o vena. Fije todas las muestras por separado en un 10% de formalina. Después de la recolección de muestras de tejido, y mientras que el animal todavía está bajo anestesia isoflurano, inmediatamente eutanasia el animal a través de neumotórax.
5. Usando un procesador de tejidos (u otra técnica de incrustación preferida), la parafina-incrustar cada biopsia en su propio bloque. Para muestras de piel, orientar el tejido de manera que todas las capas epidérmicas y dérmicas se pueden ver en una sola rebanada. Para muestras de recipientes, orientar los recipientes de manera que se puedan obtener secciones transversales.
6. Con un microtomo, corte secciones de 6 μm de espesor y aplíquelo a las diapositivas para la tinción de hematoxilina y eosina (H & E).
7. Mancha para H & E utilizando un protocolo estándar.
8. Obtenga imágenes representativas de todas las muestras de tejido deseadas utilizando técnicas de microscopía de campo claro.

Resultados

El modelo de colgajo osteomiocucutáneo de extremidad posterior de rata VCA permite la supervivencia a largo plazo de aloinjertos bajo inmunosupresión. El modelo es fiable, reproducible y fácil de realizar. El colgajo está bien escondido en la zona inguinal y constituye una mínima morbilidad y molestias para el animal. La presentación cutánea es una manifestación clínica de la supervivencia y el rechazo de los aloinjertos (figura 1). El diseño del colgajo permite un monitoreo clíni...

Discusión

En el desarrollo de este modelo de VCA, se consideraron varias cuestiones clave. En primer lugar, era importante incluir el hueso intacto (tibia y peroné), la médula ósea y la piel en el injerto. Mientras que los trasplantes de mano clínicos de donantes adultos no transfieren cantidades significativas de médula hematopoyética activa, los estudios del papel del nicho de la médula ósea se reflejan mejor utilizando un hueso vascularizado intacto en lugar de un hueso largo cortado, lo que resulta en fibrosis de la m?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50