Модифицированная Гетекопическая задняя Остеомйокутанеаус модель лоскут в крыса для поступательного васкуляризированных композитных аллотрансплантации исследований

Резюме

Васкуляризированных композитных аллотрансплантатов предлагает изменяющие жизнь выгоды для трансплантации реципиентов, но биологические причины отторжения трансплантата и васкулопатии остаются плохо понятыми. Хирургическая модель грызунов, представленная здесь, предлагает воспроизводимость, клинически релевантные модели трансплантации, позволяя исследователям оценить отклонения событий и потенциальные терапевтические стратегии, чтобы предотвратить их возникновение.

Аннотация

Васкуляризированной композитной аллотрансплантации (VCA) является относительно новой области в реконструктивной хирургии. Клинические достижения в области человеческого VCA включают трансплантацию руки и лица и, в последнее время, брюшную стенку, матку и урогенитальную трансплантацию. Функциональные результаты превзошли первоначальные ожидания, и большинство получателей пользуются улучшенным качеством жизни. Однако по мере накопления клинического опыта необходимо решать проблему хронического отторжения и осложнений, связанных с иммуноподавлением. Во многих случаях, когда графтов не удалось, причинные патологии была ишемическая васкулопатия. Биологические механизмы острого и хронического отторжения, связанного с ВЦА, особенно ишемическая васкулопатия, являются важными областями исследований. Однако, из-за очень небольшого количества пациентов VCA, оценка предлагаемых механизмов лучше решается в экспериментальной модели. Несколько групп использовали животных моделей для решения некоторых из соответствующих нерешенных вопросов в VCA отказа и васкулопатии. В литературе описано несколько моделей с участием различных видов. Здесь мы представляем воспроизводимые модели VCA гетекотопическая задняя часть остеомйокутанеаус лоскут в крыс, которые могут быть использованы для поступательного исследования VCA. Эта модель позволяет серийной оценке трансплантата, в том числе биопсии и различных методов визуализации, сохраняя при этом низкий уровень заболеваемости.

Введение

Восстановительная хирургия для катастрофических потерь тканей от ампутацией, травм взрыва, злокачественных новообразований и врожденных дефектов ограничена наличием ткани пациента и дополнительной заболеваемости, вызванной на донорских участке. В некоторых случаях, таких как жертвы ожога или четырехстороннее ампутантов, жизнеспособная ткань для реконструкции не доступна пациенту. В 1964 году в Эквадоре была проведена первая современная пересадка рук. Хотя это был технический успех, подавление иммунитета в то время было недостаточным, чтобы предотвратить отторжение, и трансплантат был потерян менее чем за 3 недели¹. В 1998 и 1999, первые трансплантаты руки в самомоднейшей эре иммуноподавления были выполнены в Лионе, Франции² и Луисвилле, кентукки, США³. В первый раз, Реконструктивная хирурги могут заменить, как с как. Трансплантация лица была впервые выполнена в 2005⁴, и в настоящее время регулярно выполняется ряд других трансплантатов VCA, таких как брюшной стенки⁵, матки и урогенитальных трансплантаций⁶.

В отличие от твердых трансплантации органов, большинство методов VCA связаны с наличием весьма антигенной донорской кожи. Клинический опыт определил, что острый отказ кожи относительно прост в контроле, но может способствовать хроническому отторжению основных тканей и сосудов, которые не реагируют на лечение⁷. Сосудистая дисфункция, связанная с аллоиммунным ответом, является более зловещим препятствием для области VCA⁷. Макровакровопатии привести к перфузии дефицита, задержка заживления и воспалительных заболеваний. Оба свободно агрессивной васкулопатии большого сосуда и очаговых гиперплазии интимал происходят в руках трансплантации получателей⁷. Кроме того, микровакровопатии вероятно, способствовать VCA осложнений, а также и может даже привести к отказу событий. В то время как иммунные и Неиммунные факторы, вероятно, играют роль в васкулопатии реципиентов трансплантации рук, специфические механизмы, продвиганые дисфункцию дистальных сосудов в VCA, неизвестны, особенно в контексте низкосортных, хронических отвержения. Эти нерешенные вопросы требуют развития животных VCA модель, которая позволит для последовательной оценки трансплантата во время клинического хода отказа VCA/техническое обслуживание и васкулопатии. Такая модель будет предлагать информацию о отторжении и васкулопатии в условиях иммуноподавления, инфекционной проблемы, и/или других послеоперационных травматических травм^8,9.

Здесь представлена аллогенной крысы VCA гетериопик остеомйокутанеаус задняя модель лоскут. На основе ранее опубликованных моделей VCA, эта процедура является технически легко выполнить, воспроизводимые в большом количестве, и экспонаты минимальной заболеваемости и дискомфорта для получателя животного. Эта модель была разработана, чтобы позволить клинических и гистопатологических оценок принятия VCA против отторжения, и дает возможность оценить основные иммунные и Неиммунные механизмы, участвующие в отторжении.

протокол

Все операции на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными в университете Луисвиллского институционального ухода за животными и Комитета по использованию (IAКУC утвержденных протокол 18198) и Национальный институт здравоохранения (НИЗ) руководство по уходу и использованию Лабораторные животные¹⁰. Четырехмесячный мужчина Браун-Норвегия (RT1. Aⁿ) и 4-месячный мужчина Льюис (RT1. ^L) крысы были использованы в качестве VCA доноров и получателей, соответственно.

1. донор аллотрансплантат урожай

1. Степенный донора животного с использованием испаряемого изофлуран применяется через камеру.
2. Бритье трансплантата донорского района (задняя конечности), а также пах и живота областях. После этого, лечения с кремом для удаления волос, с тем чтобы уменьшить количество пуха оставленные ножницы.
3. Глубоко анестезировать донорских животных с помощью интраперитонеальная (IP) кетамина (60 мг/кг)/ксилазин (15 мг/кг)/ацетпромазин (2 мг/кг). Администрирование начальной дозы 0,2 мл/100 г веса тела и дополнительных доз 0,2 mL каждый h. Для удобства не обязательно выполнять этот шаг перед шагом 2.
4. Непрерывно контролировать животных в то время как под наркозом для дыхания, температуры тела, и глубина анестезии, используя палец щепотку снятия рефлекторных испытаний.
5. Администрирование 30 U подкожно раствора гепарина (SC) в области сгривок до операции, чтобы предотвратить свертывание.
6. Носите маску, головной покров, одноразовые платья изоляции и одноразовые перчатки.
7. Поместите донора животного на спине на грелку. Производить стерильное хирургическое поле, готовя, очистка, и драпировка хирургической области, включая брюшной и спинной аспекты ноги. Дон стерильные перчатки.
8. Сделать 3 см разреза кожи в паховой вогнутости с помощью лезвия скальпеля #15 и отражать паховой жировой площадке с боков с помощью Ирис ножницы.
9. Разоблачить общие бедренные сосуды и поместить провод крюк с резинкой, чтобы убрать мышцы живота.
10. С помощью рассечения микроскопа (40x), рассекать ножку пропромо от появления общих бедренных сосудов под паховой связки и дистически к слиянию подливного сосудов в трансплантат.
11. Использование микроклипов и биполярных ювелиров щипцы, лигате и разделить большие артериальные и венозные ветви, такие как боковые околоflex бедренные сосуды, поверхностные хвостового эпигастральной сосудов, подкожной артерии, и проксимальных хвостового бедренных сосудов, мобилизовать основных бедренных сосудов. Прижигание небольших веток, используя тонкие Биполярные щипцы.
12. Сделать разрез кожи от центра предыдущего разреза кожи вдоль брюшной стороне задней конечности, в области лодыжки, используя Ирис ножницы.
13. Вырезать грациозно мышцы, а также другие приводящей мышцы под ним, в вертикальной моде подвергать и лигате медиального проксимальных геникулярных сосудов, глубоко разветвления малых сосудов, и седалищного нерва.
    Примечание: В этот момент, на отдельном хирургическом столе, другой хирург должен интубировать и анестезировать (2,5%-3% изофлуран) получателя животного; Это позволяет хирурги подготовить получателя хирургического сайта во времени для размещения трансплантата и свести к минимуму ишемического времени трансплантата.
14. На донорских животных, сделать окружным разрезов кожи на уровне колена и лодыжки. Разчленяйте колено и лодыжку, удалите посторонние мышцы и ткани, и сделайте вертикальный разрез кожи на спинной стороне задней конечности, чтобы освободить трансплантат. В этот момент трансплантат (состоящий из малоберцовой кости и голени, покрытый родственными мышцами и кожей острова, питающихся его перфораторами) соединен только ножке.
15. Поместите небольшие зажимы как можно более близко на бедренную артерию и Вену, и вырезать ножку как можно ближе, насколько это возможно, вблизи паховой связки.
16. Чтобы избавиться от трансплантата крови, вводят хепаринизированный физиологический раствор (30 U/mL) в бедренную артерию с помощью 27 G промывка тупой канюля.
    Примечание: Дилационировать артерию до заподлицо гепарин позволяет легкий доступ для вставки канюли. Во время флеша внимательно следите за оттоком из бедренной вены. Как только ясная жидкость выходит из бедренной вены, остановите флеш.
17. Оберните изолированных трансплантата в теплой соленой пропитанной Марли и транспортировать его сразу к столу животного получателя. В это время, получатель хирургического сайта уже должны быть подготовлены для сосудистой анастомоз.
18. После сбора трансплантата, немедленно усыпить донорской крысы через пневмоторакс.

2. хирургия трансплантации реципиента

1. После индукции седации с использованием испаряемого изофлуран применяется через камеру, глубоко обезболивания получателя животного через вентилятор контролируемые эндотрахеальной трубки и 2,5%-3% изофлуран.
   Примечание: На этом этапе донорская крыса все еще под наркозом.
2. Непрерывно контролировать частоту сердечных сокращений, частота дыхания, температуру тела, и глубина анестезии животного получателя, используя палец щепотку снятия рефлекторного теста.
3. Для предотвращения обезвоживания и гипогликемии, введите 2 мл раствора Рингер и 2,5% декстрозы подкожно в начале и еще 2 мл в конце операции.
4. Бритье паховой области, а затем лечить с помощью крема для удаления волос, с тем чтобы уменьшить количество пуха оставленные ножницы.
5. Носите маску, головной покров, одноразовые платья изоляции и стерильные перчатки.
6. Поместите животное на спине на грелку. Применяют офтальмологическую мазь для предотвращения ссадин роговицы во время анестезии. Производить стерильное хирургическое поле, готовя, очистка, и драпировка хирургического области.
7. Сделать 3 см разреза кожи в паховой вогнутости с помощью лезвия скальпеля #15 и отражать паховой жировой площадке с боков с помощью Ирис ножницы.
8. Разоблачить общие бедренные сосуды и поместить провод крюк с резинкой, чтобы убрать мышцы живота.
9. Лигейт и разделите ветви Мерфи.
10. Использование 10-0 нейлона прервал швы, анастомоза донорские сосуды для получателей судов через венозной конца в сторону техники и артериальной конца в конец техники. Постепенно отпустите зажимы от артерии, а затем Вены. Контролируйте анастомотические участки для кровотечения и при необходимости добавляйте дополнительные швы.
11. Визуально оценить сосудистый анастомоз, чтобы обеспечить эффективный репертуар трансплантата.
12. Вставка трансплантата в паховый карман и ориентировать его с ног на голову, с лодыжки совместных начальника и коленного сустава уступает.
13. Используя укладывание швов, закрепите трансплантат на соседние мышцы. Закройте кожу с помощью прерванного горизонтального матраса кожи, поглощаемой 4-0 швов.
14. Удалите получателя животного от анестезии и отучить его от вентилятора. Поместите животное на грелку для термической поддержки.
    Примечание: Общее время работы составляет от 3 до 4 ч, в зависимости от опыта хирурга и знакомства с хирургической процедурой.
15. Администрирование мелоксикама (1 мг/кг) подкожно для подавления боли и монитор, пока животное полностью восстановленные и мобильные.

3. Мониторинг получателя VCA

1. Дом получателя крыс поодиночке и контролировать их ежедневно для клинических признаков боли, обезвоживания, потеря веса, и снижение активности в дополнение к хирургической недостаточности (для первых 48-72 ч) или отказ. Администрирование мелоксикама подкожно (1 мг/кг) ежедневно в течение первых 3 дней для подавления боли.
2. Основываясь на конечной точке исследования, выберите препарат иммуноподавления для приема.

4. гистология

1. При вдыхании изофлуранном анестезии (2,5%-3%), получить серийную кожу и основные мышечные биопсии от донорского трансплантата в нужные временные точки. Кожа должна быть вымыта и драпированные до получения биопсии, и стерильные поля и техника должна выполняться.
2. Закройте рану одним-двумя стежками, используя рассасывающийся 4-0 швов. Верните животное в клетку и дайте ему восстановиться после анестезии.
3. Закрепите биопсию тканей в отдельных трубках в 10% формалина.
4. В терминальной точке времени и при вдыхании изофлуран анестезии (2,5%-3%), возьмите большую биопсию кожи, которая охватывает донора/получателя границы. Тщательно найдите пару поводка сосуда на месте анастомозов; надлежащее место будет очевидно из-за швов. Возьмите желаемые образцы сосуда из артерии и/или Вены. Исправить все образцы отдельно в 10% формалин. После сбора образцов тканей, и в то время как животное все еще находится под анестезией изофлуран, немедленно усыпить животное через пневмоторакс.
5. Используя процессор ткани (или другую предпочтительную технику вложения), парафин-встраивайте каждую биопсию в свой собственный блок. Для образцов кожи, ориентировать ткани так, чтобы все эпидермального и дермальных слоев можно увидеть в один ломтик. Для образцов судов, ориентировать сосуды так, чтобы поперекие секции могут быть получены.
6. С помощью микротома вырезать 6 мкм толщиной секций и применять их на слайды для гематоксина и ээин (H & E) окрашивание.
7. Пятно для H & E с помощью стандартного протокола.
8. Получить репрезентативные изображения всех желаемых образцов тканей с помощью методов микроскопии Брайта.

Результаты

Крыса VCA гетекотопическая задняя остеомйокутанеаус модель лоскут позволяет для долгосрочного аллотрансплантата выживание под иммуноподавления. Модель надежна, воспроизводимо и проста в выполнении. Лоскут хорошо скрыт в паховой области и представляет собой минимальную заболеваемос?...

Обсуждение

При разработке этой модели VCA были рассмотрены несколько ключевых вопросов. Во-первых, важно, чтобы включить нетронутыми кость (голени и малоберцовой кости), костный мозг, и кожи в трансплантата. В то время как клинические трансплантации рук от взрослых доноров не переносят значительное...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50