변형 된 이종 성 복합체 동종 요법 연구에 대 한 쥐에서 변성 이성애 자 골 진 피부 플랩 모델

요약

혈관 화 된 복합 알로이 식은 이식 받는 사람에 게 생명을 바꾸는 혜택을 제공 하지만, 이식 거부와 레이의 생물학적 원인은 제대로 이해 되지 않습니다. 여기에 제시 된 설치류 수술 모델은 재현 가능 하 고 임상적으로 관련 된 모델을 제공 하 여 연구원 들이 그 발생을 막기 위해 거부 사건과 잠재적인 치료 전략을 평가할 수 있도록 합니다.

초록

혈관 화 된 복합 동종 이식 (VCA)은 재건 수술에서 비교적 새로운 분야 이다. 인간적 인 VCA에 있는 임상 성과는 손과 얼굴 이식 및, 더 최근에, 복 부 벽, 자 궁 및 비뇨 생식 기 이식 포함 합니다. 기능적 결과는 초기 기대치를 초과 했으며 대부분의 수신자는 향상 된 삶의 질을 즐깁니다. 그러나 임상 경험이 축적 되 면 면역 억제에서 만성 거부 및 합병증을 해결 해야 합니다. 접목에 실패 한 많은 경우에, 원인이 되는 병리학은 허 혈 성 레이 되었습니다. VCA, 특히 허 혈 성 레이 관련 된 급성 및 만성 거절의 생물학적 기전은 연구의 중요 한 영역입니다. 그러나, VCA 환자의 아주 작은 수로 인해, 제안 된 메커니즘의 평가는 실험 모델에서 더 나은 해결 된다. 여러 그룹은 VCA 거부 및 레이 관련 미해결 문제 중 일부를 해결 하기 위해 동물 모델을 사용 했다. 다양 한 종을 포함 하는 몇몇 모형 디자인이 문헌에 기술 되어 있다. 여기에서 우리는 번역 VCA 연구를 위해 이용 될 수 있는 쥐에 있는 VCA 이성애 주제 힌 사지 골이 피부 플랩의 재현성 있는 모형을 제시 합니다. 이 모델은 낮은 수준의 사망률을 유지 하면서 생 검 및 다양 한 이미징 방식을 포함 한 접목의 시리얼 평가를 가능 하 게 합니다.

서문

절단에서 치명적인 조직 손실에 대 한 재건 수술, 폭발 부상, 악성, 그리고 선 천 성 결함은 환자에서 조직의 가용성과 기증자 사이트에서 발생 하는 추가 사망률에 의해 제한 됩니다. 일부 경우, 예컨대 화상 피해자 또는 사변형 수족, 재건을 위한 생 가능한 조직은 환자 로부터 사용할 수 없다. 1964에서, 최초의 현대 손 이식이 에콰도르에서 수행 되었다. 이것은 기술적인 성공, 당시에 유효한 면역 억제는 거절을 방지 하기 위하여 불충분 했 고, 이식 편 3 주 미만에서 분실 되었습니다¹. 1998 및 1999에서, 면역 억제의 현대 시대에 있는 첫번째 손은 리옹, 프랑스² 및 미국 켄터키 주 루이스 빌에서 수행 되었다³. 처음으로, 재건 외과 의사 처럼 대체 수 있습니다. 얼굴이 식은 2005⁴에서 처음 수행 되었으며, 다 수의 다른 VCA 접목은 이제 복 벽⁵, 자 궁 및 비뇨 생식 기 이식⁶과 같은 일상적으로 수행 되 고 있다.

고체 장기이 식을 달리, 대부분의 VCA 기술은 고도로 항 원 성 기증자 피부의 존재를 포함 한다. 임상 경험은 피부의 급성 거부 반응이 상대적으로 제어 하기 쉽지만 치료⁷에 잘 반응 하지 않는 기저 조직과 혈관의 만성 거부에 기여할 수 있다고 결정 했습니다. Alloimmune 반응과 관련 되었던 관 기능 장애는 VCA⁷의 필드를 위한 더 불길 한 장애물입니다. Macrovasculopathies는 관류 적자, 지연 된 치유, 및 염증 성 조건으로 이끌어 냅니다. Confluent 공격적인 대형 혈관 레이 및 국 소 막 증식은 손 이식 받는 사람⁷에서 발생 합니다. 또한 microvasculopathies는 VCA 합병증에도 기여할 가능성이 있으며 거부 이벤트로 이어질 수도 있습니다. 면역 및 비 면역 인자가 모두 손 이식 수용자의 레이에서 역할을 하는 반면, VCA에서 말단 혈관 기능 장애를 촉진 하는 특이 적 기전은 특히 저급, 만성 거부의 맥락에서 알려지지 않았다. 이러한 답이 없는 질문은 VCA 거부/유지 보수 및 레이 임상 과정 중에 접목의 시리얼 평가를 허용 하는 동물 VCA 모델의 개발을 필요로 합니다. 이러한 모델은 면역 억제, 전염 성 챌린지 및/또는 기타 수술 후 외상 부상^8,9에 대 한 거부 및 레이에 대 한 통찰력을 제공 할 것입니다.

여기에 제시 된 동종의 쥐의 VCA 이성애 주제 힌 사지 골 독 피부 플랩 모델입니다. 이전에 출판 된 VCA 모델을 기반으로,이 절차는 기술적으로 수행 하기 쉽고, 많은 수의 재현성이 있으며, 수령인 동물에 게 최소한의 사망률과 불편 함을 나타냅니다. 이 모델은 VCA 수락 대 거부의 임상 및 조직 병리학 적 평가를 허용 하 고 거부에 관련 된 기저 면역 및 비 면역 메커니즘을 평가할 수 있는 기회를 제공 하도록 설계 되었습니다.

프로토콜

모든 동물 수술은 루이스 빌의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC 승인 프로토콜 18198) 및 관리 및 사용에 대 한 국립 건강 연구소 (NIH) 가이드에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 되었다 실험실 동물¹⁰. 4 개월 된 남성 브라운-노르웨이 (RT1. Aⁿ) 및 4 개월 된 남성 루이스 (RT1. ^L) 랫 트는 각각 VCA 공여 및 수혜자로 서 사용 되었다.

1. 기증자의 동종 재배 수확

1. 기화 된 아이 소 루 레인을 사용 하 여 공여 동물을 챔버를 통해 적용 한다.
2. 사 타 구니 및 복 부 부위 뿐만 아니라 이식 편 공여 부위 (힌 사지)를 면도 한다. 그 다음에는가 위가 남긴 퍼지 양을 줄이기 위해 탈모 크림으로 치료 하십시오.
3. 복 강 내를 사용 하 여 기증자 동물을 깊숙이 마 취 (60) 케 타 민 (15mg/kg)/acepromazine (2mg/kg). 0.2 mL/100g의 초기 용량을 투여 하 고 모든 시간에 0.2 mL의 추가 용량을 제공 합니다. 편의상 2 단계 전에이 단계를 수행 하는 것은 선택 사항입니다.
4. 호흡, 체온 및 마 취의 깊이를 위해 마 취하에 있는 동안 동물을 지속적으로 모니터링 하 고 발가락 핀치 인출 반사 테스트를 사용 합니다.
5. 응고를 방지 하기 위해 수술 전에 목 덜 미 영역에서 헤 파 린 용액을 피하 (SC)로 30 U를 투여 한다.
6. 마스크, 헤드 커버, 일회용 절연 가운 및 일회용 장갑을 착용 하십시오.
7. 기증자 동물 부정사을가 열 패드에 놓습니다. 다리의 복 부 및 등 쪽 측면을 포함 하 여 수술 부위를 미리 준비, 스크러빙 및 드레이 핑 하 여 멸 균 수술 장을 생성 합니다. 돈 멸 균 장갑.
8. 메스 블레이드 #15를 사용 하 여 사 타 구니 오목한 구멍에 3cm 피부 절 개를 만들고 아이리스가 위를 사용 하 여 서 혜 부 지방 패드를 측면으로 반영 합니다.
9. 일반적인 대 퇴 혈관을 노출 하 고 복 부 근육을 철회 하는 탄성 밴드와 와이어 후크를 배치 합니다.
10. 해 부 현미경 (40x)을 사용 하 여 사 타 구니 인 대 아래에 있는 일반적인 대 퇴 혈관의 출현에서 척추를 근접 하 게 하 고 슬와 혈관의 합류에 대 한 거리를 이식 편으로 분해 합니다.
11. 마이크로 클립 및 양극 보석상의 집게를 사용 하 여, ligate 및 횡 정 대 퇴 골, 표 재 상 상 복 부 혈관, 사 포 성 동맥 및 근 위 꼬리 대 퇴 혈관과 같은 큰 동맥 및 정 맥 가지를 분할 하 여 동원 주요 대 퇴 혈관. 미세한 양극 집게를 사용 하 여 작은 가지를 소 작을.
12. 꽃 창포가 위를 사용 하 여, 뒷 다리의 복 부 쪽을 따라 자른 이전 피부의 중심에서 발목 부 위에 피부 절 개를 만드십시오.
13. 그 아래에 있는 다른 내 전근 근육 뿐만 아니라, gracilis 근육을 절단 하 고, 수직으로는 중간 근 위부 혈관을 노출 및 ligate, 깊은 분기 작은 혈관, 그리고 좌 골 신경.
    참고: 이 시점에서, 별도의 수술 테이블에, 다른 외과 의사는 삽 관 및 마 취 해야한다 (2.5%-3% 아이 소 잠복) 받는 동물; 이것은 외과 의사가 이식 편 배치를 위한 시간에 수령인 외과 부 대를 준비 하 고 접목의 허 혈 시간을 극소화 하는 것을 허용 합니다.
14. 기증자 동물에, 무릎과 발목의 수준에서 원주 형 피부 절 개를 확인 합니다. 무릎과 발목을 디스명료 하 게 하 고, 불필요 한 근육과 조직을 제거 하 고, 다리의 등 쪽 면에 수직 피부 절 개를 만들어 접목을 해제 합니다. 이 시점에서, 이식 편 (불 라와 경골으로 구성 된 관련 근육과 그 천공 기에 의해 양육 된 피부 섬으로 덮여)는 척추에 의해서만 연결 됩니다.
15. 작은 클램프를 대 퇴 동맥과 정 맥에 최대한 근접 하 게 배치 하 고, 사 타 구니 인 대 근처에서 척추를 가능한 한 근접 하 게 자릅니다.
16. 혈액의 접목을 플러시 하려면 27g의 플러싱 무딘 캐 뉼 러를 사용 하 여 대 퇴 동맥에 혈장 염 수 (30u/mL)를 주입 합니다.
    참고: 헤 파 린 플러시 전에 동맥을 팽창 시켜 캐 뉼 러의 삽입을 위해 쉽게 접근 할 수 있습니다. 플러시 동안 대 퇴 정 맥 으로부터의 유출을 면밀히 관찰 합니다. 맑은 액체가 대 퇴 정 맥을 벗어나면, 플러시를 중지 하십시오.
17. 격리 된 접목을 따뜻한 생리 식 염 수에 젖은 거 즈에 싸서 즉시 수령인 동물의 식탁에 운반 하십시오. 이 때, 수용자 수술 부위는 이미 혈관 문 합을 위해 준비 되어야 한다.
18. 이식 후 수확 후 즉시 기 흉을 통해 기증자의 쥐를 안락사 시킵니다.

2. 수용자 이식 수술

1. 챔버를 통해 적용 되는 기화 된 아이 소 루 레인을 이용한 진정 유도에이 어, 수용자 동물을 인공 호흡기 조절 기관 튜브 및 2.5%-3% 아이 소 루 레인을 통해 깊이 마 취 시켰다.
   참고: 이 단계에서 기증자 쥐는 여전히 마 취 됩니다.
2. 발가락 핀치 인출 반사 시험을 사용 하 여 수용자 동물의 심 박수, 호흡 률, 체온 및 마 취 깊이를 지속적으로 모니터링 합니다.
3. 탈수와 저 혈당을 예방 하기 위해서는 처음에는 2 mL의 락 트 링 된 링거 용액과 2.5%의 덱 스트로 스를 주사 하 고 수술 끝에 2 mL를 더 주입 합니다.
4. 사 타 구니 부위를 면도 한 다음 탈모 크림으로 치료 하 여가 위가 남긴 퍼지 양을 줄이십시오.
5. 마스크, 헤드 커버, 일회용 격리 가운 및 멸 균 장갑을 착용 하십시오.
6. 동물 부정사을가 열 패드 위에 놓습니다. 마 취 동안 각 막 찰과상을 방지 하기 위해 안과 연 고를 바르 십시오. 수술 부위를 준비 하 고, 닦 고, 드레이 핑 하 여 멸 균 수술 장을 만듭니다.
7. 메스 블레이드 #15를 사용 하 여 사 타 구니 오목한 구멍에 3cm 피부 절 개를 만들고 아이리스가 위를 사용 하 여 서 혜 부 지방 패드를 측면으로 반영 합니다.
8. 일반적인 대 퇴 혈관을 노출 하 고 복 부 근육을 철회 하는 탄성 밴드와 와이어 후크를 배치 합니다.
9. 머피 지점을 리 게이트 하 고 나눕니다.
10. 10-0 나일론 단속 봉합 사를 사용 하 여, 정 맥 엔드-투-사이드 기술과 동맥 종단 간 기술을 통해 수령인 혈관을 아 스 톨 mose 기증자 혈관. 서서히 동맥과 정 맥에서 클램프를 풀어. 출혈에 대 한 anastomotic 사이트를 모니터링 하 고 필요한 경우 추가 봉합을 추가.
11. 효과적인 접목 재 관류를 보장 하기 위해 혈관 문 합을 시각적으로 평가 합니다.
12. 접목을 사 타 구니 주머니에 끼워 넣고 거꾸로 뒤집어 발목 관절이 우수 하 고 무릎 관절이 열 등 합니다.
13. 투 킹 봉합을 사용 하 여 인접 한 근육에 접목을 고정 시킵니다. 중단 된 수평 매트리스 피부 흡수 4-0 봉합을 통해 피부를 닫습니다.
14. 마 취에서 받는 동물을 제거 하 고 통풍 기에서 벗으 십시오. 열 지지대를 위해 동물을가 열 패드 위에 놓으십시오.
    참고: 전체 작동 시간은 외과 의사의 경험과 외과 수술과 친분에 따라 3에서 4 시간 사이입니다.
15. 멜 록 시 캄 (1 밀리 그램/kg)을 피하로 통증을 억제 하 고 동물이 완전히 회복되 고 이동할 때까지 모니터링 합니다.

3. VCA 수신자 모니터링

1. 수용자 쥐를 단독으로 집 하 고 통증, 탈수, 체중 감소 및 외과 적 장애 (첫 번째 48 – 72 시간 동안) 또는 거절의 임상 징후에 대해 매일 모니터링 합니다. 통증 억제를 위해 처음 3 일 동안 매일 멜 록 시 캄을 피하 (1mg/kg)를 투여 한다.
2. 연구 엔드포인트에 기초 하 여, 투여 될 면역 억제제를 선택 한다.

4. 조직학

1. 흡입 된 아이 소 루 네 마 취 (2.5%-3%) 하에서, 원하는 시간 지점에서 기증자 이식 편 으로부터 시리얼 피부 및 기저 근육 생 검을 얻습니다. 피부는 생 검을 얻기 전에 긁 고 드 레이프 되어야 하며 멸 균 필드와 기술이 수행 되어야 합니다.
2. 흡수 4-0 봉합 사를 사용 하 여 1 ~ 2 개의 스티치로 상처를 닫습니다. 그것의 케이지에 동물을 반환 하 고 마 취에서 회복을 허용.
3. 10% 포 르 말린에 별도의 튜브에 생체 조직 조직을 고정 합니다.
4. 터미널 타임 포인트와 흡입 된 아이 소 루 네 마 취 (2.5%-3%)에서 기증자/받는 사람 경계에 걸쳐 있는 더 큰 피부 생 검을 취합니다. 조심 스럽게, 낙 지의 사이트에서 선박 가죽 끈 쌍을 찾습니다; 적절 한 사이트는 봉합으로 인해 명백 할 것입니다. 동맥 및/또는 정 맥에서 원하는 용기 샘플을 채취 하십시오. 10% 포 르 말린에서 모든 샘플을 개별적으로 수정 합니다. 조직 샘플을 수집 하 고, 동물이 여전히 아이 소 루 칸 마 취 하에 있는 동안, 그리고 기 흉을 통해 동물을 즉시 안락사 시킵니다.
5. 조직 프로세서 (또는 다른 바람직한 포함 기술)를 사용 하 여 파라핀-각 생 검을 자신의 블록에 포함 시킵니다. 피부 샘플의 경우, 모든 표 피 및 진 피 층이 단일 슬라이스 내에서 보일 수 있도록 조직의 방향을 잡습니다. 용기 샘플의 경우, 횡단면을 얻을 수 있도록 혈관의 방향을 잡습니다.
6. 마이크로 톰을 사용 하 여 6 µm 절편을 자르고 헤 마 톡 실린 및에 오신 (H & E) 염색을 위한 슬라이드에 적용 한다.
7. 표준 프로토콜을 사용 하 여 H & E에 얼룩.
8. 명시 야 현미경 기술을 사용 하 여 모든 원하는 조직 샘플의 대표 이미지를 얻습니다.

결과

쥐의 VCA 이성애 주제 힌 사지 골 피부 플랩 모델은 면역 억제 하에서 장기 동종 요법 생존을 허용 합니다. 이 모델은 신뢰할 수 있고 재현 가능 하며 간편 하 게 수행할 수 있습니다. 플랩은 사 타 구니 지역에 잘 숨겨져 있으며 동물에 게 최소한의 사망률과 불편 함을 구성 합니다. 피부 프레 젠 테이 션은 동종의 생존 및 거부의 임상 징후입니다 (그림 1). 플랩 디자인은 총 임?...

토론

VCA의이 모델을 개발, 몇 가지 주요 문제가 고려 되었다. 첫째, 그대로 뼈 (경골과 비 골), 골 수 및 이식에 피부를 포함 하는 것이 중요 했다. 성인 기증자에서 임상 손 이식 상당한 양의 활발 한 조 혈을 전송 하지 않는 동안, 골 수 틈새의 역할의 연구는 그대로 사용 하 여 더 나은 미러링, 혈관을 절단 보다는 긴 뼈, 어떤 결과 노출 된 골의 섬유 증. 또한, 폐쇄 된 골 골 절 세포 피부 플랩 디자인은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50