Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

Resumen

Presentamos protocolos detallados para realizar experimentos de difracción de rayos X de ángulo pequeño utilizando músculos esqueléticos de ratón intactos. Con la amplia disponibilidad de modelos de ratón transgénicos para enfermedades humanas, esta plataforma experimental puede formar un banco de pruebas útil para esclarecer la base estructural de las enfermedades musculares genéticas

Resumen

Los modelos de ratón transgénicos han sido herramientas importantes para estudiar la relación del genotipo con el fenotipo para enfermedades humanas, incluidas las del músculo esquelético. Se ha demostrado que el músculo esquelético del ratón produce patrones de difracción de rayos X de alta calidad en líneas de haz sincrotrón de tercera generación, lo que proporciona la oportunidad de vincular los cambios a nivel del genotipo con fenotipos funcionales en salud y enfermedad al determinar las consecuencias estructurales de los cambios genéticos. Presentamos protocolos detallados para la preparación de muestras, la recopilación de los patrones de rayos X y la extracción de parámetros estructurales relevantes de los patrones de rayos X que pueden ayudar a guiar a los experimentadores que deseen realizar tales experimentos por sí mismos.

Introducción

La difracción de rayos X de ángulo pequeño de Sincrotrón es el método de elección para estudiar la estructura a escala nm de la contratación activa de preparaciones musculares en condiciones fisiológicas. Es importante destacar que la información estructural de las preparaciones musculares vivas o despellejadas se puede obtener en sincronía con datos fisiológicos, como la fuerza muscular y los cambios de longitud. Ha aumentado el interés en aplicar esta técnica para estudiar la base estructural de las enfermedades musculares hereditarias que tienen su base en mutaciones puntuales en proteínas sarcomricas. La comunidad de biofísica muscular ha sido muy activa en la generación de modelos de ratón transgénicos para estas condiciones de enfermedades humanas que podrían proporcionar camas de prueba ideales para estudios estructurales. Publicaciones recientes de nuestro grupo^1,2,3 y otros^4,5 han indicado que los patrones de rayos X del ratón extensor digitorum longus (EDL) y los músculos soleus pueden proporcionar todos los músculos soleus pueden proporcionar todos los músculos soleus pueden proporcionar todos los músculos soleus pueden proporcionar todos los información de difracción disponible en organismos modelo más tradicionales como el músculo esquelético de psoas de rana y conejo. Una ventaja de la preparación del músculo esquelético del ratón es la facilidad de la disección y la realización de experimentos fisiológicos musculares enteros intactos de membrana. Las dimensiones del músculo diseccionado tienen suficiente masa para producir patrones musculares muy detallados en tiempos de exposición de rayos X muy cortos (milisegundos por fotograma) en líneas de haz de rayos X de tercera generación.

Los patrones de difracción de rayos X musculares consisten en las reflexiones ecuatoriales, los reflejos meridionales, así como los reflejos de la línea de capa. La relación de intensidad ecuatorial (relación de la intensidad de los reflejos ecuatoriales 1,1 y 1,0, I₁₁/I₁₀), está estrechamente correlacionada con el número de puentes cruzados conectados, que es proporcional a la fuerza generada en el músculo esquelético del ratón ². Las reflexiones meridionales que informan de las periodicidades dentro de los filamentos gruesos y delgados se pueden utilizar para estimar la extensibilidad de filamentos^1,3,6,7. Las características de difracción que no están en el meridiano y el ecuador se llaman líneas de capa, que surgen de las cabezas de miosina ordenadas aproximadamente helically en la superficie de la columna vertebral del filamento grueso, así como de los filamentos delgados ordenados aproximadamente hélically. La intensidad de las líneas de capa de miosina está estrechamente relacionadacon el grado de orden de las cabezas de miosina en diversas condiciones 2,^8. Toda esta información se puede utilizar para estudiar los comportamientos de las proteínas sarcomricas in situ en la salud y la enfermedad.

La difracción de rayos X sincrotrón del músculo ha sido realizada históricamente por equipos de expertos altamente especializados, pero los avances en tecnología y la disponibilidad de nuevas herramientas de reducción de datos indican que esto no siempre tiene por qué ser el caso. El BioCAT Beamline 18ID en la Fuente De Fotón Avanzado, Laboratorio Nacional de Argonne tiene personal dedicado e instalaciones de apoyo para realizar experimentos de difracción de rayos X musculares que pueden ayudar a los recién llegados al campo a comenzar en el uso de estas técnicas. Muchos usuarios optan por colaborar formalmente con el personal de BioCAT, pero un número cada vez mayor de usuarios encuentran que pueden hacer los experimentos y el análisis ellos mismos reduciendo la carga en el personal de la línea de haz. El objetivo principal de este documento es proporcionar capacitación que proporcione a los experimentadores potenciales la información que necesitan para planificar y ejecutar experimentos en el sistema muscular esquelético del ratón, ya sea en la línea de haz BioCAT o en otras líneas de haz de alto flujo alrededor de la mundo donde estos experimentos serían posibles.

Protocolo

Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Tecnología de Illinois (Protocolo 2015-001, Fecha de aprobación: 3 de noviembre de 2015) y siguieron a la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio"⁹ .

1. Preparación previa al experimento

1. Preparar 500 ml de la solución de Ringer (contiene: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO₄, 1,0 mM CaCl₂, 10,0 mM HEPES, 11 mM de glucosa, pH 7,4) recién para cada día del experimento.
2. Llene 200 ml de la solución de Ringer en una botella de spray y guárdela a 4 oC en nevera. Llene una placa Petri (10 cm de diámetro) con la solución de Ringer y perfundie con oxígeno 100% conectando el tubo de un cilindro de oxígeno a una piedra de aire del acuario. Los platos De Petri ("platos de disección") fueron recubiertos previamente con un compuesto de elastómero para permitir la inserción de alfileres durante la disección.
3. Prepare ganchos de montaje metálicos. Corte dos piezas de alambre de acero inoxidable, de 0,5 mm de diámetro, a la longitud adecuada y doble el alambre en ambos extremos para formar ganchos. Organice todas las herramientas de diselación, tijeras, fórceps de atablimiento de sutura, microtijeras a mano para su uso.
   NOTA: La parte del gancho debe ser de unos 3 mm de largo. El cable más largo (que termina en un gancho) debe ser de unos 5 cm de largo, y el alambre más corto (que también termina en un gancho) debe ser de aproximadamente 1 cm de largo para adaptarse a las cámaras personalizadas utilizadas en BioCAT y permitir un rango de movimiento suficiente para el brazo del transductor.
4. Conecte y encienda todo el equipo. Esto incluye un motor/transductor de fuerza combinado, un controlador de transductor de motor/fuerza, un estimulador de corriente bifásica de alta potencia y un sistema de adquisición/control de datos controlado por computadora.
   1. Encienda el sistema de adquisición de datos y bistúrelo antes de iniciar el experimento¹⁰. Brevemente, calibrando la fuerza añadiendo un conjunto de pesos conocidos, cubriendo hasta el 50% de la fuerza máxima medida por el transductor de fuerza en una progresión lineal, en el transductor de fuerza y registrando los cambios de voltaje de salida. Calibrar la longitud aplicando un conjunto de voltaje de salida conocido al brazo de la palanca y medir el cambio de longitud del brazo.
   2. Conecte las mangueras del bloque térmico del soporte de la muestra a un baño circulante refrigerado y ajuste la temperatura para mantener la temperatura deseada en la cámara a entre 10 oC y 40 oC. Determine esto empíricamente con antelación ajustando el baño circulante a un rango de temperaturas y midiendo la temperatura en la cámara con un termopar.

2. Preparación muscular

1. Eutanasia del ratón
   1. Eutanasia el ratón por inhalación de dióxido de carbono seguida de luxación cervical.
   2. Rocíe la piel de la extremidad posterior con la solución fría de Ringer para evitar que el cabello sople en la preparación. Retire la piel cortándola alrededor del muslo usando tijeras de disección fina y tire rápidamente de la piel hacia abajo usando #5 fórceps para exponer los músculos.
   3. Amputar la extremidad posterior y transferirla a una placa de disección que ha sido llena de solución de Ringer oxigenada, y luego colocar bajo un microscopio de disección binocular.
2. Preparación de un músculo soleus
   1. Ancle la extremidad posterior hacia abajo en el plato de diseción con el músculo gastrocnemius hacia arriba. Corta el tendón distal del grupo muscular gastrocnemius/soleus y levanta los músculos suavemente y lentamente cortando la fascia a ambos lados del músculo gastrocnemius usando tijeras finas. Aísle el grupo muscular gastrocnemius/soleus de la extremidad después de liberar el tendón proximal del músculo soleus.
   2. Ancle el grupo muscular que contiene el músculo gastrocnemius y el tendón distal hacia abajo en la placa de diseción. Levante el músculo soleus suavemente a través del tendón proximal y sepárelo del músculo gastrocnemius dejando la mayor parte del tendón distal soleus intacto como sea posible.
3. Preparación de un extensor digitorium longus (EDL) muscular
   1. Ancle la extremidad posterior hacia abajo en la placa de diseción con el músculo anterior tibialis hacia arriba. Corta la fascia a lo largo del músculo tibialis anterior (TA) y tira de ella con fórceps. Identificar y cortar el tendón distal del músculo TA. Levante el músculo TA y córtelo cuidadosamente sin tirar del músculo EDL.
   2. Cortar el lado lateral de la rodilla y exponer los dos tendones. Cortar el tendón proximal, dejando la mayor cantidad posible del tendón todavía unido al músculo, y levantar el músculo EDL (músculo medial) tirando suavemente del tendón. Corte el tendón distal una vez expuesto.
4. Montaje del músculo
   1. Anclar el músculo a través de los tendones, y recortar toda la grasa extra, fascia y tendón de distancia tanto como sea posible. Inserte un tendón en un nudo preatado y ate la sutura firmemente con fórceps de sutura. Ate el segundo nudo alrededor del gancho de metal.
   2. Repita el mismo procedimiento con el gancho largo en el otro extremo del tendón. Asegúrese de que ninguno del cuerpo del músculo es contactado por las suturas. Esto dañará la preparación.
   3. Fije el gancho corto a la parte inferior de la cámara experimental y el gancho largo al transductor/motor de fuerza de modo dual. Burbuja la solución en la cámara experimental con 100% de oxígeno.
5. Optimización de los protocolos de estimulación y la longitud muscular
   1. Estirar el músculo ajustando los micromanipuladores conectados al transductor/motor para generar una tensión basal entre 15 y 20 mN antes de encontrar los mejores parámetros de estímulo. Ajuste el voltaje de estimulación a 40 V. La corriente de estimulación aumenta sistemáticamente hasta que no hay un aumento adicional en la fuerza de contracción. La corriente más alta encontrada se incrementa en aproximadamente un 50% para garantizar la activación supra-máxima.
   2. Encuentra la longitud óptima, L₀, definida como la longitud muscular que da la máxima fuerza de contracción, aumentando la longitud muscular y activando el músculo con una sola contracción hasta que la fuerza activa (fuerza máxima menos fuerza basal) deje de aumentar.
   3. Realice una contracción tetanica corta (activación de 1 s) para probar el montaje y estirar el músculo de nuevo a la fuerza basal óptima si es necesario. Registre la longitud muscular en mm con una pinza digital.

3. Difracción de rayos X

NOTA: La siguiente descripción es para experimentos de difracción de rayos X realizados utilizando el instrumento de difracción de rayos X de ángulo pequeño en la línea de haz BioCAT 18ID en la Fuente Avanzada de Fotones, laboratorio nacional de Argonne, pero métodos similares podrían emplearse en otras líneas de haz como ID 02 en la ESRF (Francia) y BL40XU en SPring8 (Japón). Beamline 18ID se opera a una energía de haz de rayos X fija de 12 keV (0.1033 nm de longitud de onda) con un flujo incidente de 10¹³ fotones por segundo en el haz completo.

1. Elija una muestra a la distancia del detector (longitud de la cámara). Utilice una longitud de cámara de 1,8 m para experimentos que examinen las reflexiones de miosina de 2,7 nm de actina y alto orden, como reflejos meridionales de 2,8 nm. Utilice una cámara de 4-6 m para otros experimentos, donde uno está principalmente interesado en detalles finos en el meridiano y las líneas de capa
2. Optimización de la posición de la muestra en la viga
   1. Determine la posición del haz utilizando un trozo de papel sensible a los rayos X que produzca una mancha oscura en respuesta a los rayos X ("una quemadura"). A continuación, utilice un generador de video cruz para crear una cruz alineada con la marca de quemadura en el papel o simplemente haga una marca en la pantalla de video con un rotulador.
   2. Utilice la interfaz gráfica de usuario suministrada por BioCAT al posicionador de muestra para mover el músculo que se va a centrar en la posición del haz. Oscila la cámara de la muestra a 10-20 mm/s moviendo la etapa de la muestra para extender la dosis de rayos X sobre el músculo durante la exposición. Observe la muestra a medida que se mueve para evitar grandes regiones de fascia (contiene colágeno que contaminará los patrones de difracción) y para asegurarse de que permanece iluminada durante todo el camino de su recorrido.
      NOTA: Los pasos exactos requeridos en las secciones 3.3 y 3.4 para realizar los ajustes y acciones requeridos utilizando la interfaz gráfica de usuario suministrada por la línea de haz serán específicos de la línea de haz y del detector. Pregunte al personal de la línea de haz sobre cómo realizar estas operaciones.
3. Configuración del detector CCD (dispositivo acoplado de carga) para patrones de alta resolución desde el músculo en estados estáticos definidos (descanso o durante la contracción isométrica)
   1. Configure el tiempo de exposición y el período de exposición en la interfaz gráfica de usuario con el software de control. Tome una imagen de fondo oscuro antes de tomar la exposición y repita este procedimiento cada 2 horas o después de cambiar el tiempo de exposición para corregir cualquier deriva en la electrónica de lectura del detector.
   2. Atenúe el haz de rayos X al valor deseado para la exposición. A continuación, tome una imagen. No es posible tomar secuencias de imágenes con este detector. El detector CCD también necesita varios segundos para leer una imagen individual.
4. Configuración del detector de matriz de píxeles para un experimento resuelto en el tiempo
   1. Configure el número de imágenes, el tiempo de exposición y el período de exposición en la interfaz gráfica de usuario. El detector de matriz de píxeles utilizado aquí necesita al menos 1 ms para la lectura. La frecuencia máxima de fotogramas para el detector de recuento de fotones es de 500 Hz. Utilice la señal de salida del detector de recuento de fotones para controlar el obturador de rayos X.
   2. Atenúe el haz a la intensidad deseada. Armar el detector y esperar el disparador del sistema de adquisición de datos. Sincronice los datos mecánicos y de rayos X accionándolos al mismo tiempo. Los patrones de rayos X se recogen continuamente a lo largo del protocolo a con un tiempo de exposición de 1 ms y un período de exposición de 2 ms.
      NOTA: El tiempo exacto de exposición y el período de exposición deben determinarse caso por caso para la información deseada y la vida útil observada de la muestra en el haz. Atenúe el haz para no utilizar más haz de rayos X del necesario para proporcionar datos analizables en el período de exposición elegido.

4. Tratamiento muscular post-experimento

1. Recuperar y sopesar el músculo después de cada experimento mecánico y de rayos X. Calcular el área transversal del músculo utilizando la longitud muscular medida y la masa muscular¹¹ asumiendo una densidad muscular de 1,06 g/mL^12.
2. Estirar el músculo a la longitud experimental y fijar el músculo en 10% de formalina durante 10 min. Separar el músculo fijo en una serie de haces de fibra seleccionados de lugares a lo largo de toda la sección³de la cruz muscular.
3. Mida la longitud del sarcomere utilizando un sistema de medición de longitud de sarcomere de vídeo.

Resultados

Contracción tetánica isométrica. Cualquier tipo de experimento mecánico muscular clásico, como contracciones isométricas o isotónicas, se puede realizar con la adquisición simultánea de patrones de rayos X. Figura 1 A muestra la configuración experimental para experimentos mecánicos y de rayos X. En la Figura 1Bse muestra un seguimiento de fuerza de ejemplo para una contracción tetánica isométrica. El músculo se mantuvo en reposo durante 0,5 s antes de activarse durante 1 s. La grabación mecánica se detiene 1 s después del estímulo. Los patrones de rayos X se recogieron continuamente a lo largo del protocolo a 1 ms de tiempo de exposición a 500 Hz.

Patrones de difracción de rayos X. El patrón de difracción de rayos X muscular puede dar información estructural de resolución de nanómetros de estructuras dentro del sarcomere. Los patrones de difracción de rayos X musculares se componen de cuatro cuadrantes equivalentes divididos por el ecuador y el meridiano. El patrón ecuatorial surge del empaque de miofilamento dentro del sarcomere perpendicular al eje de fibra, mientras que los patrones meridionales informan información estructural de los miofilamentos a lo largo del eje muscular. Las reflexiones restantes que no se encuentran en el ecuador o en el meridiano se denominan líneas de capa. Las líneas de capa (por ejemplo, entidades etiquetadas MLL4 y ALL6 en la Figura 2A)surgen de la disposición aproximadamente helicoidal de las subunidades moleculares dentro de la miosina que contienen filamentos gruesos y la actina que contiene filamentos delgados. Las líneas de capa basadas en miosina son fuertes y nítidas en patrones de músculo en reposo (Figura2A), mientras que las líneas de capa basadas en actina son más prominentes en patrones de músculo de conserciación (Figura2B). Los patrones de diferencia obtenidos al restar el patrón de reposo del patrón de contratación (Figura2C) pueden arrojar luz sobre los cambios estructurales durante el desarrollo de la fuerza en el músculo sano y enfermo. Siguiendo estos cambios estructurales en la escala de tiempo de milisegundos de los eventos moleculares durante la contracción muscular, los patrones de difracción de rayos X pueden revelar información estructural sustancial (Figura2D).

Análisis de datos mediante MuscleX. Este es un ejemplo de análisis de reflexiones ecuatoriales utilizando la rutina "ecuador" en el paquete MuscleX (Figura 3). MuscleX es un paquete de software de análisis de código abierto desarrollado en BioCAT¹³. La relación de intensidad ecuatorial (I_1,1/I_1,0) es un indicador de la proximidad de la miosina a la actina en el músculo en reposo (Figura3A), mientras que está estrechamente correlacionada con el número de puentes cruzados conectados en la contratación ( Figura 3B) músculo esquelético murino². La relación de intensidad, I_1,1/I_1,0, es de aproximadamente 0,47 en el músculo en reposo y aproximadamente 1,2 en el músculo de contracción. La distancia entre los dos 1,0 reflejo (2 * S_1,0) está inversamente relacionada con el espaciado entre filamentos. La documentación detallada y los manuales de MuscleX están disponibles en línea¹³.

Figura 1 : Configuración y protocolo de experimentos mecánicos y de rayos X. (A) El músculo se monta en un extremo en un gancho dentro de la cámara experimental y el otro extremo a un transductor de motor/fuerza de modo dual. Se mantiene entre dos ventanas de película Kapton para permitir el paso de los rayos X. La cámara está llena de la solución de Ringer perfundida con 100% de oxígeno durante todo el experimento. (B) El protocolo mecánico para experimentos de rayos X en un músculo durante la contracción tetánica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Patrones de difracción de rayos X EDL. Patrón de difracción de rayos X muscular EDL por reposo (A) y contraer (B) músculo. (C) El patrón de diferencia entre el patrón de reposo y de contratación. La región azul indica alta intensidad en el patrón de reposo, mientras que la región amarilla representa una alta intensidad en el patrón de contratación. (D) Patrón de difracción de rayos X a partir de una exposición de 1 ms con músculo EDL. MLL1 - Línea de capa de myosin de primer orden; MLL4 - Línea de capa de miosina de cuarto orden; ALL1 - Línea de capa actin de primer orden ALL6 - Sexta línea de capa de actina de orden; ALL7 - Línea de capa de actina de séptimo orden; Reflejo de tropomiosina (indicado por una caja blanca); M3 - reflexión meridional de tercer orden; M6 - reflexión meridional de sexto orden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Análisis de datos de patrones ecuatoriales utilizando MuscleX. El fondo restaba el perfil de la relación de intensidad ecuatorial (mientras que el área) y las primeras cinco órdenes (líneas verdes) eran adecuadas para calcular la intensidad de cada pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Publicaciones recientes de nuestro grupo mostraron que los patrones de rayos X del músculo esquelético del ratón se pueden utilizar para arrojar luz sobre la información estructural sarcomerica del músculo en la salud y la enfermedad^1,2,3 especialmente con la mayor disponibilidad de modelos genéticos de ratón modificados para varias miopatías. Los expertos realizan mejor estudios mecánicos de alta resolución en fibras individuales o pequeños paquetes combinados con difracción de rayos X. Si, sin embargo, información mecánica más modesta será suficiente para sus propósitos, toda la preparación muscular permite la recolección de patrones detallados de rayos X de una preparación simple.

Una disección limpia es clave para un exitoso experimento mecánico y de rayos X combinado. Es muy importante no tirar del músculo objetivo, así como otros músculos asociados con el soleus o los músculos EDL durante la disección ya que esto podría romper partes del músculo y conducir a la reducción de la fuerza. También puede conducir a una estructura interna dañada que degradará los patrones de rayos X. Dado que todo se dispersará en el haz de rayos X, es importante limpiar cualquier grasa extra, el colágeno en la fascia, así como cualquier pelo o trozos sueltos de tejido mientras se hace el siguiente protocolo. Para reducir el cumplimiento adicional en la preparación muscular, también es importante atar de forma segura los tendones a los ganchos, lo más cerca posible del cuerpo muscular sin dañarlo.

Diferentes tiempos de exposición a rayos X pueden proporcionar diferentes tipos de información del mismo músculo. Usando el haz completo en 18ID, se puede obtener un patrón ecuatorial analizable en una exposición de 1 ms (ver Figura 2D). Para una reflexión de línea de capa de miosina analizable, normalmente se requiere un tiempo total de exposición de 10 ms. Para recopilar reflexiones meridionales de orden superior, como la M15 (reflexión de miosina meridional de 2,8 nm) y la reflexión de 2,7 nm de actina meridional, normalmente se requiere al menos 1 s de exposición total, pero se recomienda una exposición total superior a 2 s para una alta precisión Medidas.

La elección del detector de rayos X óptimo para el experimento es importante. Para los patrones de rayos X más detallados, un detector de CCD personalizado, como el de BioCAT con funciones de dispersión de puntos de aprox. 40 m y 65 m en el fósforo, puede proporcionar patrones con un alto rango dinámico y una buena resolución espacial, pero solo puede tomar un fotograma a la vez. Para experimentos resueltos por tiempo, el detector de matriz de píxeles de recuento de fotones en BioCAT puede recopilar patrones de rayos X a 500 Hz. Sin embargo, el tamaño de píxel de 172 m con este detector no proporciona suficiente resolución espacial para estudios detallados de la parte interna del meridiano, pero es adecuado para la mayoría de los otros propósitos. BioCAT adquirió un detector de recuento de fotones de alta resolución que proporciona una resolución real de 75 m a una velocidad de fotogramas máxima de 9.000 Hz. Se espera que detectores similares de este tipo suplanten detectores de corriente para estudios musculares en los próximos años.

Con los flujos muy altos de rayos X en sincrotrones de tercera generación, el daño por radiación es una preocupación grave. Siempre es una buena opción para atenuar la viga para no entregar más viga de la necesaria para observar las características de difracción deseadas. La misma exposición total a los rayos X se puede lograr prolongando el tiempo de exposición de un haz atenuado. Una ventaja de los detectores de matriz de píxeles de recuento de fotones es que los fotogramas individuales se pueden sumar junto sin penalización por ruido. Incluso entonces, el daño por radiación es posible. Los signos de daño por radiación incluyen caída de la fuerza máxima de contracción, manchado de reflejos de la línea de capa, incluso cambio de color muscular.

Una de las limitaciones de la preparación intacta del músculo esquelético del ratón es la dificultad para obtener la longitud del sarcomere del músculo intacto durante los experimentos. Los músculos son demasiado gruesos para la microscopía de vídeo y la difracción láser. Mientras que con los desarrollos futuros puede ser posible estimar la longitud del sarcomere directamente desde los patrones de difracción¹⁴, en el corto plazo la única opción es medirlo después del experimento como se describe aquí.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	WPI	500342
4/0 surgical suture	Braintree Sci	SUT-S 108
Aquarium air stone	uxcell		a regular air stone from a pet store would be fine
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CCD detector	Rayonix Inc	MAR 165 CCD
Data acquisition system	Aurora Scientific Inc	610A
Elastomer compound	Dow Corning	Sylgard 184
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High resolution photon counting detector	Dectris Inc	EIGER X 500K
High-power bi-phasic current stimulator	Aurora Scientific Inc	701
Iris Scissors	WPI	501263-G
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro scissor	WPI	503365
Motor/force transducer	Aurora Scientific Inc	300C-LR
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Petri dish	Sigma-Aldrich	CLS430167
Photon counting detector	Dectris Inc	Pilatus 3 1M
Stainless Steel wire	McMaster-carr	8908K21
Suture Tying Forceps	WPI	504498
Video sarcomere length measuring system	Aurora Scientific Inc	900B