Рентгеновская дифракция институющих Морин скелетной мышцы в качестве инструмента для изучения структурной основы мышечной болезни

Резюме

Мы представляем подробные протоколы для выполнения малоугольных рентгеновских экспериментов дифракции с использованием нетронутых мышечных скелетных мышц. С широкой доступностью трансгенных моделей мыши для болезней человека, эта экспериментальная платформа может сформировать полезный испытательный койк для выяснения структурной основы генетических заболеваний мышц

Аннотация

Трансгенные модели мыши были важными инструментами для изучения взаимосвязи генотипа с фенотипом для заболеваний человека, включая скелетные мышцы. Мышь скелетной мышцы было показано, производить высокое качество рентгеновского дифракции моделей на третьем поколении синхротронных лучей, обеспечивая возможность связать изменения на уровне генотипа с функциональными фенотипами в здоровье и болезни, определив структурные последствия генетических изменений. Мы представляем подробные протоколы для подготовки образцов, сбора рентгеновских узоров и извлечения соответствующих структурных параметров из рентгеновских моделей, которые могут помочь экспериментаторам, желающим провести такие эксперименты для себя.

Введение

Синхротрон малоугольная рентгеновская дифракция является методом выбора для изучения nm-масштабной структуры активно говорении мышечных препаратов в физиологических условиях. Важно отметить, что структурная информация от живых или кожурой мышечной подготовки могут быть получены синхронно с физиологическими данными, такими как мышечная сила и изменения длины. Там был растущий интерес к применению этого метода для изучения структурной основы наследственных заболеваний мышц, которые имеют свою основу в точке мутации в саркомерикных белков. Сообщество мышечной биофизики было очень активным в генерации трансгенных моделей мыши для этих человеческих заболеваний условиях, которые могли бы обеспечить идеальные испытательные кровати для структурных исследований. Последние публикации из нашей группы^1,2^,3и другие^4,5 указали, что рентгеновские узоры от мыши разгибателя digitorum longus (EDL) и подошвы мышцы могут обеспечить все дифракционная информация, доступная из более традиционных модельных организмов, таких как лягушка и кролик psoas скелетной мышцы. Преимуществом подготовки мышечной массы мыши является легкость вскрытия и выполнения основных мембранно-нетронутых, целые мышечные физиологические эксперименты. Размеры расчлененной мышцы имеют достаточную массу, чтобы дать высоко детализированные мышечные модели в очень короткие рентгеновские сроки экспозиции (миллисекунда в кадре) на рентгеновских лучах третьего поколения.

Модели дифракции мышечной рентгеновской дифракции состоят из экваториальных отражений, меридиональных отражений, а также отражений линии слоя. Соотношение экваториальной интенсивности (отношение интенсивности 1,1 и 1,0 экваториальных отражений, I₁₁/I_10),тесно коррелирует с числом прикрепленных кросс-мостов, что пропорционально силе, генерируемой в мышечной скелетной мышце ². Меридиональные отражения, которые сообщают периодии в толстой и тонкой нити могут быть использованы для оценки расширяемость нити^1,3,6,7. Особенности дифракции не на меридиане и экваторе называются слоеобразными линиями, которые возникают из примерно хелически упорядоченных головмиозина на поверхности толстой нити позвоночника, а также приблизительно хлоэнчевидно упорядоченных тонких нитей. Интенсивность линий слоя миосина тесно связана со степенью заказа миозина в различных условиях^2,8. Вся эта информация может быть использована исследование поведения саркомерикных белков на месте в области здоровья и болезней.

Синхротронная рентгеновская дифракция мышц исторически была сделана командами узкоспециализированных экспертов, но достижения в области технологий и наличие новых инструментов сокращения данных указывают на то, что это не всегда так. BioCAT Beamline 18ID на Расширенный источник фотона, Аргоннской национальной лаборатории выделен персонал и вспомогательные средства для выполнения мышечной рентгеновской дифракции экспериментов, которые могут помочь новичкам на местах начать использовать эти методы. Многие пользователи предпочитают официально сотрудничать с сотрудниками BioCAT, но все большее число пользователей считают, что они могут делать эксперименты и анализ себя снижение нагрузки на лучевой персонал. Основная цель данной работы заключается в обеспечении обучения, которое обеспечивает потенциальных экспериментаторов с информацией, необходимой для планирования и выполнения экспериментов на мышечной системы мыши либо на bioCAT луч или на других высоких лучей потока вокруг мире, где эти эксперименты были бы возможны.

протокол

Все протоколы экспериментов на животных были утверждены Иллинойском технологическим институтом институционального ухода за животными и угодьем Комитета (Протокол 2015-001, Дата утверждения: 3 ноября 2015) и следовали NIH "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных"⁹ .

1. Предварительная подготовка к эксперименту

1. Подготовьте 500 мл раствора Ringer (содержит: 145 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1.0 мМ MgSO₄, 1.0 мМ CaCl₂, 10.0 mM HEPES, 11 мМ глюкозы, pH 7.4) свежей для каждого дня эксперимента.
2. Заполните 200 мл раствора Ringer в распылитель и храните при холодильнике 4 градусов по Цельсию. Заполните чашку Петри (10 см в диаметре) раствором Ringer и надоете 100% кислородом, соединяя трубку из кислородного баллона с аквариумным воздушным камнем. Блюда Петри ("рассекающие посуды") ранее были покрыты эластомерным соединением, позволяющим вставлять булавки во время вскрытия.
3. Подготовка металлических монтажных крючков. Вырезать два куска нержавеющей стали проволоки, 0,5 мм в диаметре, до соответствующей длины и согнуть проволоку на обоих концах, чтобы сформировать крючки. Упорядочить все расчленяющие инструменты, ножницы, шов связывания щипцы, микро-ножницы удобно для использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длина крюкового детали должна быть около 3 мм. Более длинний провод (окончание в крючок) должен быть около 5 см в длину, и более короткий провод (также заканчивающийся в крючок) должен быть около 1 см в длину, чтобы соответствовать пользовательские камеры, используемые в BioCAT и позволяют достаточное диапазон движения для трансдукции руку.
4. Подключите и включите все оборудование. Это включает в себя комбинированный двигатель / сила преобразователя, двигатель / сила преобразователя контроллер мощных би-фасический ток стимулятор, и компьютер контролируемых данных приобретения / системы управления.
   1. Включите систему сбора данных и откалибруйте ее перед началом эксперимента^10. Кратко, калибровка силы путем добавления набора известных весов, охватывающих до 50% от максимальной силы, измеренной силой преобразователя в линейной прогрессии, на силой преобразовывания и записи изменения напряжения выходного напряжения. Калибровать длину, применяя набор известных выходных напряжения на рычаг руку и измерить изменение длины руки.
   2. Соедините шланги от теплового блока на держателе образца к охлажденной циркулирующей ванне и установите температуру для поддержания желаемой температуры в камере между 10 и 40 градусами По Цельсия. Определите это эмпирически заранее, установив циркулирующую ванну до диапазона температур и измерив температуру в камере термопарой.

2. Подготовка мышц

1. Эвтаназия мыши
   1. Эвтаназия мышь путем вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки.
   2. Спрей кожи на заднюю конечность с холодным раствором Ringer, чтобы предотвратить волосы от дует в подготовке. Удалите кожу, разрезая его вокруг бедра с помощью тонкой вскрытия ножницы и быстро потяните кожу вниз с помощью #5 щипцы подвергать мышцы.
   3. Ампутировать заднюю конечность и передать ее в рассекающее блюдо, которое было заполнено кислородом раствором Рингера, а затем поместите под бинокулярный рассекающий микроскоп.
2. Подготовка подошви ной мышцы
   1. Прикрепите заднюю конечность вниз в рассекающей тарелке с гастрокнемией мышцы, обращенные вверх. Отрежьте дистное сухожилие группы мышц gastrocnemius/soleus и поднимите мышцы нежно и медленно путем отрезать фасцию на обеих сторонах мышцы gastrocnemius используя тонкие ножницы. Изолировать гастрокнемия / подошвы мышечной группы от конечности после освобождения проксимального сухожилия мышцы подошвы.
   2. Прикрепите группу мышц, содержащую гастрокнемию мышци и дистальное сухожилие вниз в рассекающей блюдо. Поднимите мышцы подошвы мягко через проксимотальное сухожилие и отделить его от гастрокнемии мышц, оставляя как можно больше подошвы дистального сухожилия нетронутыми, насколько это возможно.
3. Подготовка раздвища digitorium longus (EDL) мышцы
   1. Прикрепите заднюю конечность вниз в рассекающей тарелке с передней мышцей tibialis, обращенной вверх. Вырезать фасции вдоль tibialis передней (TA) мышцы и потяните его ясно с помощью щипки. Определите и вырежьте дистальное сухожилие мышцы TA. Поднимите мышцы TA и вырезать его тщательно, не потянув на мышцу EDL.
   2. Отрежьте боковую сторону колена и разоблачить два сухожилия. Вырезать проксимального сухожилия, оставляя как можно больше сухожилия, как это возможно еще прилагается к мышце, и поднять мышцы EDL (медиаль мышцы), мягко потянув сухожилия. Вырежьте дистное сухожилие, как только оно подвергается.
4. Монтаж мышц
   1. Прикрепите мышцы через сухожилия, и обрезать все лишние жиры, фасции и сухожилия прочь как можно больше. Вставьте одно сухожилие в заранее завязанный узел и плотно свяжите шов шовными щипками. Свяжите второй узел вокруг металлического крючка.
   2. Повторите ту же процедуру с длинным крючком на другом конце сухожилия. Убедитесь, что ни один из тела мышцы не контактирует швы. Это повредит препарат.
   3. Прикрепите короткий крюк к нижней части экспериментальной камеры и длинный крюк к двойному режиму силы преобразователя / двигателя. Пузырь раствор в экспериментальной камере со 100% кислорода.
5. Оптимизация протоколов стимуляции и длины мышц
   1. Растянуть мышцу, регулируя микроманипуляторы, прикрепленные к преобразователь / двигатель для создания базового напряжения между 15 до 20 мн, прежде чем найти лучшие параметры стимула. Установите напряжение стимуляции до 40 В. Ток стимуляции систематически увеличивается до тех пор, пока не не будет дополнительного увеличения силы дергаться. Самый высокий ток, обнаруженный, увеличивается примерно на 50%, чтобы обеспечить активацию супра-максимума.
   2. Найти оптимальную длину, L₀, определяется как длина мышц, которые дают максимальную силу дергаться, путем увеличения длины мышц и активации мышцы с одной дергаться до тех пор, пока активная сила (пиковая сила минус базовая сила) останавливается растет.
   3. Выполните короткое столбняка (1 s активации), чтобы проверить монтаж и растянуть мышцы обратно к оптимальной исходной силы, если это необходимо. Запись длины мышц в мм с цифровым кабилизмом.

3. Рентгеновская дифракция

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее описание для рентгеновских экспериментов дифракции, сделанных с использованием малого угла рентгеновского дифракционного инструмента на BioCAT луч 18ID на Расширенный фотон Источник, Аргоннской национальной лаборатории, но аналогичные методы могут быть использованы на других лучах ID 02 в ESRF (Франция) и BL40XU на SPring8 (Япония). Луч 18ID управляется при фиксированной энергии рентгеновского луча 12 кэВ (0,1033 нм длина волны) с потоком инцидентов в 10¹³ фотонов в секунду в полном пучке.

1. Выберите образец на расстояние детектора (длина камеры). Используйте длину камеры длиной 1,8 м для экспериментов, изучающих актин 2,7 нм и отражения миозина высокого порядка, такие как меридиональные отражения 2,8 нм. Используйте 4-6 м камеру для других экспериментов, где один в первую очередь заинтересованы в мелких деталей на меридиан и слой линий
2. Оптимизация положения образца в луче
   1. Определите положение луча с помощью фрагмента рентгеновской чувствительной бумаги, которая производит темное пятно в ответ на рентгеновские лучи ("ожог"). Затем используйте видео-кросс-генератор для создания перекрестия выровнены с ожоговой марки на бумаге или просто сделать отметку на экране с маркером пера.
   2. Используйте BioCAT поставляется графический пользовательский интерфейс для образца позиционер для перемещения мышцы по центру на позиции луча. Осциллируйте образец камеры на 10-20 мм/с, перемещая этап образца для того, чтобы распространить дозу рентгена по мышце во время воздействия. Наблюдайте за образцом, как он движется, чтобы избежать больших областей фасции (содержит коллаген, который будет загрязнять дифракционные модели) и обеспечить, чтобы он остается освещенным в течение всего пути его путешествия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точные шаги, необходимые в разделах 3.3 и 3.4 для создания необходимых настроек и действий с использованием графического пользовательского интерфейса, поставляемого лучами, будут специфичными для луча и детектора. Спросите сотрудников beamline о том, как выполнять эти операции.
3. Настройка детектора CCD (зарядного связанного устройства) для моделей высокого разрешения от мышц в определенных статических состояниях (отдых, или во время изометрического сокращения)
   1. Настройка времени экспозиции и периода экспозиции в графическом пользовательском интерфейсе для управления программным обеспечением. Возьмите темный фоновое изображение перед тем, как сделать экспозицию, и повторите эту процедуру каждые 2 часа или после изменения времени экспозиции, чтобы исправить любой дрейф в электронике считывания детектора.
   2. Смягчить рентгеновский луч до желаемого значения для экспозиции. Тогда возьмите изображение. Это не возможно, чтобы взять последовательности изображений с помощью этого детектора. Детектору CCD также требуется несколько секунд, чтобы зачитать отдельное изображение.
4. Настройка детектора массива пикселей на эксперимент, решенный на время
   1. Настройка количества изображений, время экспозиции, период экспозиции в графическом пользовательском интерфейсе. Детектор массива пикселей, используемый здесь, должен по крайней мере 1 мс для считывательской информации. Максимальная частота кадров для детектора фотонного подсчета составляет 500 Гц. Используйте сигнал отсчета фотонов для контроля рентгеновского затвора.
   2. Смягчить луч до нужной интенсивности. Вооружите детектор и дождитесь спускового крючка из системы сбора данных. Синхронизируйте механические и рентгеновские данные, запуская их одновременно. Рентгеновские модели собираются непрерывно по всему протоколу с 1 мс время экспозиции и 2 мс периода экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное время экспозиции и период экспозиции должны определяться на индивидуальной основе в зависимости от желаемой информации и наблюдаемого срока службы образца в луче. Смягчайте луч, чтобы использовать не больше рентгеновского луча, чем это необходимо для предоставления аналитических данных в выбранный период экспозиции.

4. Пост-эксперимент лечения мышц

1. Восстановление и взвешивание мышц после каждого механического и рентгеновского эксперимента. Рассчитайте поперечную область мышцы, используя измеренную длину мышц и мышечную массу^11, предполагая плотность мышц 1,06 г/мл^12.
2. Растянуть мышцы до экспериментальной длины и исправить мышцы в 10% формалин в течение 10 мин. Разделите фиксированной мышцы в серию волоконных пучков, выбранных из мест на протяжении всей мышечной сечения³.
3. Измерьте длину саркомера с помощью системы измерения длины саркомера.

Результаты

Изометрическое столбняка. Любой классический мышечный механический эксперимент, такой как изометрические или изотонические сокращения, может быть выполнен с одновременным приобретением рентгеновских моделей. Рисунок 1 A показывает экспериментальную установку для механических и рентгеновских экспериментов. Пример следа силы для изометрического столбняка сжимающе показан в рисунке 1B. Мышца держалась на покоя в течение 0,5 с, прежде чем активировать сяртрию в течение 1 с. Механическая запись останавливается 1 с после стимула. Рентгеновские модели были собраны непрерывно по всему протоколу при 1 мс времени воздействия на 500 Гц.

Рентгеновские дифракционные модели. Мышечный рентгеновский дифракционный узор может дать нанометровое разрешение структурной информации от структур внутри саркомера. Модели дифракции мышечной рентгеновской дифракции состоят из четырех эквивалентных квадрантов, разделенных экватором и меридианом. Экваториальный узор возникает из упаковки миофилатата в саркомере перпендикулярно оси волокна, в то время как меридиональные модели сообщают структурную информацию из миофиламентов вдоль мышечной оси. Остальные отражения не на экваторе или меридиане называются слоеными линиями. Линии слоя (например, функции, помеченные MLL4 и ALL6 на рисунке 2A) возникают из примерно свекольного расположения молекулярных субъединиц внутри миозина, содержащего толстые нити и актин, содержащий тонкие нити. Линии слоя на основе миозина сильны и остры в узорах от отдыха мышцы(рисунок 2A), в то время как актин основе слоя линии являются более заметными в шаблонах от сокращения мышц (Рисунок 2B). Различия моделей, полученных путем вычитания отдыха картины из шаблона сокращения(Рисунок 2C) может пролить свет на структурные изменения во время развития силы в здоровой и больной мышцы. Следуя этим структурным изменениям в миллисекундной временной шкале молекулярных событий во время сокращения мышц, модели рентгеновской дифракции могут выявить существенную структурную информацию(рисунок 2D).

Анализ данных с использованием MuscleX. Вот пример экваториального анализа отражений с использованием "экватора" рутины в пакете MuscleX (Рисунок 3). MuscleX — это пакет программного обеспечения для анализа с открытым исходным кодом, разработанный в BioCAT^13. Соотношение экваториальной интенсивности (I_1,1/ I_1,0) является показателем близости миозина к актину в мышце отдыха (рисунок3А), в то время как это тесно коррелирует с числом прикрепленных кросс-мостов в договоре ( Рисунок 3B) мурин скелетной мышцы². Коэффициент интенсивности, я_1,1/ I_1,0, составляет около 0,47 в мышцах отдыха и около 1,2 в контракте мышцы. Расстояние между двумя отражениями 1,0 (2'S_1,0)обратно связано с межнити интервал. Подробная документация и руководства для MuscleX доступны онлайн¹³.

Рисунок 1 : Установка и протокол механического и рентгеновского эксперимента. (A) Мышца установлена на одном конце крючка внутри экспериментальной камеры, а другой конец двойного режима двигателя / силы преобразователя. Он проводится между двумя окнами пленки Kapton, чтобы рентгеновские лучи, чтобы пройти. Камера наполнена раствором Ringer, наполненным 100% кислородом на протяжении всего эксперимента. (B) Механический протокол для рентгеновских экспериментов на мышцах во время столбняка сокращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : модели дифракции рентгеновского рентгеновского снимка EDL. EDL мышцы рентгеновского дифракции картины от отдыха (A) и сокращения (B) мышцы. (C) Разница шаблон между отдыха и договоров шаблона. Синий регион указывает на высокую интенсивность в шаблоне отдыха, в то время как желтая область представляет высокую интенсивность в шаблоне сжимания. (D) Рентгеновский дифракционный шаблон от 1 мс воздействия с мышцей EDL. MLL1 - линия слоя миозина первого порядка; MLL4 - Линия четвертого порядка миозина; ALL1 - Линия первого уровня actin ACTin ALL6 - линия шестого порядка actin слоя; ALL7 - линия седьмого порядка actin слоя; ТМ и отражение тропомиозина (указанное белым ящиком); M3 - меридиональное отражение третьего порядка; M6 - шестой порядок меридионального отражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Анализ данных экваториальных моделей с использованием MuscleX. Фон вычитается экваториальной интенсивности коэффициента профиля (в то время как область) и первые пять ордеров (зеленые линии) были пригодны для расчета интенсивности каждого пика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Последние публикации из нашей группы показали, что рентгеновские модели из мыши скелетной мышцы могут быть использованы, чтобы пролить свет на саркомерик структурной информации от мышц в области здравоохранения и болезни^1,2,3 особенно с увеличение доступности генетически модифицированных моделей мыши для различных миопатий. Механические исследования высокого разрешения на отдельных волокнах или небольших пучках в сочетании с рентгеновской дифракцией лучше всего делать экспертами. Если, однако, более скромной механической информации будет достаточно для ваших целей, вся подготовка мышц позволяет сбор подробных рентгеновских моделей из простой подготовки.

Чистое вскрытие является ключом к успешному комбинированному механическому и рентгеновскому эксперименту. Очень важно не тянуть на целевой мышцы, а также другие мышцы, связанные с подошвами или EDL мышц во время вскрытия, поскольку это может разорвать части мышц и привести к снижению силы. Это также может привести к повреждению внутренней структуры, которая будет ухудшать рентгеновские узоры. Так как все будет рассеиваться в рентгеновском луче, важно, чтобы очистить от любого дополнительного жира, коллагена в фасции, а также любые волосы или свободные кусочки ткани при выполнении следующего протокола. Чтобы уменьшить дополнительное соответствие в подготовке мышц, также важно надежно привязать сухожилия к крючкам, как можно ближе к мышечному телу, не повреждая его.

Различные рентгеновские время экспозиции может обеспечить различные виды информации из той же мышцы. Используя полный луч на 18ID, анализируемый экваториальный шаблон может быть получен в 1 мс экспозиции (см. Рисунок 2D). Для анализа первого миозина слой линии отражения, 10 мс общее время экспозиции, как правило, требуется. Для сбора более высокого порядка меридиональных отражений, таких как M15 (2,8 нм миозина меридионального отражения) и 2,7 нм актина меридионального отражения, как правило, по крайней мере 1 с общей экспозиции не требуется, но более 2 с общей экспозиции рекомендуется для высокой точности Измерения.

Важен выбор оптимального рентгеновского детектора для эксперимента. Для наиболее подробных рентгеновских моделей индивидуальный детектор CCD, такой как детектор BioCAT с пикселями около 40 мкм и функциями распространения точек в фосфоре, может обеспечить шаблоны с высоким динамическим диапазоном и хорошим пространственным разрешением, но может принимать только один кадр за один раз. Для времени решенных экспериментов, фотон подсчета пиксель массива детектор на BioCAT может собирать рентгеновские узоры на 500 Гц. Размер пикселей 172 мкм с помощью этого детектора, однако, не обеспечивает достаточное пространственное разрешение для детального изучения внутренней части меридиана, но является адекватным для большинства других целей. BioCAT приобрела фотоновый детектор высокого разрешения, обеспечивающий реальное разрешение 75 мкм при максимальной частоте кадров 9000 Гц. Подобные детекторы этого типа, как ожидается, вытеснят текущие детекторы для исследования мышц в течение следующих нескольких лет.

При очень высоких потоках рентгеновских лучей на синхротронах третьего поколения, радиационное повреждение является серьезной проблемой. Это всегда хороший выбор, чтобы смятение пучка, чтобы доставить не больше пучка, чем это необходимо для наблюдения желаемых функций дифракции. Такое же общее рентгеновское облучение может быть достигнуто путем продления времени воздействия с ослабленного луча. Преимущество фотон подсчета детекторов массива пикселей заключается в том, что отдельные кадры могут быть суммированы вместе без штрафа за шум. Даже в этом году возможны радиационные повреждения. Признаки радиационного повреждения включают падение максимальной силы сжатия, размазывание отражений линии слоя, даже изменение цвета мышц.

Одним из ограничений нетронутой подготовки мыши скелетных мышц является трудность в получении саркомера длина от нетронутой мышцы во время экспериментов. Мышцы слишком толстые для видеомикроскопии и лазерной дифракции. В то время как с будущими разработками можно оценить длину саркомера непосредственно от дифракционных моделей¹⁴, в ближайшем будущем единственным вариантом является измерение его после эксперимента, как описано здесь.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	WPI	500342
4/0 surgical suture	Braintree Sci	SUT-S 108
Aquarium air stone	uxcell		a regular air stone from a pet store would be fine
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CCD detector	Rayonix Inc	MAR 165 CCD
Data acquisition system	Aurora Scientific Inc	610A
Elastomer compound	Dow Corning	Sylgard 184
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High resolution photon counting detector	Dectris Inc	EIGER X 500K
High-power bi-phasic current stimulator	Aurora Scientific Inc	701
Iris Scissors	WPI	501263-G
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro scissor	WPI	503365
Motor/force transducer	Aurora Scientific Inc	300C-LR
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Petri dish	Sigma-Aldrich	CLS430167
Photon counting detector	Dectris Inc	Pilatus 3 1M
Stainless Steel wire	McMaster-carr	8908K21
Suture Tying Forceps	WPI	504498
Video sarcomere length measuring system	Aurora Scientific Inc	900B