Cirugía de hemisección de la médula espinal torácica y evaluación locomotora de campo abierto en la rata

Resumen

La hemisección espinal torácica de rata es un modelo valioso y reproducible de lesión unilateral de la médula espinal para investigar los mecanismos neuronales de la recuperación locomotora y la eficacia del tratamiento. Este artículo incluye una guía detallada paso a paso para realizar el procedimiento de hemisección y evaluar el rendimiento locomotor en una arena de campo abierto.

Resumen

La lesión de la médula espinal (SCI) causa alteraciones en la función motora, sensorial y autonómica por debajo del nivel de la lesión. Los modelos animales experimentales son herramientas valiosas para entender los mecanismos neuronales involucrados en la recuperación locomotora después de SCI y para diseñar terapias para poblaciones clínicas. Hay varios modelos experimentales de SCI incluyendo contusiones, compresión y lesiones de transección que se utilizan en una amplia variedad de especies. Una hemisección implica la transección unilateral de la médula espinal e interrumpe todos los tratados ascendentes y descendentes en un solo lado. La hemisección espinal produce una lesión altamente selectiva y reproducible en comparación con las técnicas de contusión o compresión que es útil para investigar la plasticidad neuronal en vías salvadas y dañadas asociadas con la recuperación funcional. Presentamos un protocolo detallado paso a paso para realizar una hemisección torácica a nivel vertebral T8 en la rata que resulta en una parálisis inicial de la extremidad posterior en el lado de la lesión con recuperación espontánea calificada de la función locomotora en varios Semanas. También proporcionamos un protocolo de puntuación locomotor para evaluar la recuperación funcional en campo abierto. La evaluación locomotora proporciona un perfil de recuperación lineal y se puede realizar tanto antes como repetidamente después de una lesión con el fin de examinar con precisión a los animales en busca de puntos de tiempo adecuados para realizar pruebas conductuales más especializadas. La técnica de hemisección presentada se puede adaptar fácilmente a otros modelos y especies de transección, y la evaluación locomotora se puede utilizar en una variedad de SCI y otros modelos de lesiones para puntuar la función locomotora.

Introducción

La lesión de la médula espinal (SCI) se asocia con alteraciones graves en la función motora, sensorial y autonómica. Los modelos animales experimentales de SCI son herramientas valiosas para comprender los eventos anatómicos y fisiológicos involucrados en la patología del SCI, investigar los mecanismos neuronales en reparación y recuperación, y para detectar la eficacia y seguridad de los potenciales terapéuticos Intervenciones. La rata es la especie más utilizada en la investigación^{DeSC 1}. Los modelos de ratas son de bajo costo, fáciles de reproduciry una gran batería de pruebas de comportamiento están disponibles para evaluar los resultados funcionales 2. A pesar de algunas diferencias en la ubicación del tracto, la médula espinalde la rata comparte funciones sensorimotoras similares en general con mamíferos más grandes, incluyendo primates 3,^4. Las ratas también comparten consecuencias fisiológicas y conductuales análogas a SCI que se relacionan con los seres humanos⁵. Los modelos de primates no humanos y grandes modelos animales pueden proporcionar una aproximación más cercana a la SCI⁶ humana y son esenciales para probar la seguridad y eficacia del tratamiento antes de la experimentación humana, pero se utilizan con menos frecuencia debido al bienestar ético y animal consideraciones, gastos y requisitos reglamentarios⁷.

Los modelos de SCI de transección de ratas se realizan mediante la interrupción dirigida de la médula espinal con una lesión selectiva utilizando un cuchillo de disección o tijeras de iridectomía después de una laminectomía. En comparación con una transección completa, la transección parcial en la rata resulta en una lesión menos grave, un cuidado animal postoperatorio más fácil, una recuperación locomotora espontánea y modelos más de cerca de SCI en humanos que es predominantemente incompleta con tejido que conecta la médula espinal y las estructuras supraespinales⁸. Una hemisección unilateral interrumpe todos los tratados ascendentes y descendentes de un solo lado, y produce déficits locomotoras cuantificables y altamente reproducibles, mejorando la exploración de los mecanismos biológicos subyacentes. La consecuencia funcional más prominente de la hemisección es una parálisis inicial de las extremidades en el mismolado y por debajo del nivel de la lesión con recuperación espontánea calificada de la función locomotora durante varias semanas 9,^{10, 11 , 12}. El modelo de hemisección es particularmente útil para investigar la plasticidad neuronal de los tractoes y circuitos dañados y residuales asociados con la recuperación funcional^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. Específicamente, la hemisección realizada a nivel torácico, es decir, por encima de los circuitos espinales que controlan la locomoción de las extremidades posteriores, es particularmente útil para investigar cambios en el control locomotor. Dado que existe una relación no lineal entre la gravedad de la lesión y la recuperación locomotora después de SCI^19,las pruebas de comportamiento adecuadas para evaluar los resultados funcionales son primordiales en modelos experimentales.

Una batería completa de pruebas de comportamiento están disponibles para evaluar aspectos específicos de la recuperación locomotora funcional en la rata^2,20. Muchas pruebas de locomotoras no proporcionan medidas confiables temprano después de SCI, ya que las ratas están demasiado discapacitadas para soportar su peso corporal. Una medida de rendimiento locomotor espontáneo que es sensible a los déficits temprano después de la lesión, y no requiere entrenamiento preoperatorio o equipo especializado, es beneficiosa para monitorear la recuperación locomotora para los puntos de tiempo adecuados en los que complementar las pruebas de comportamiento especializadas. La puntuación de evaluación de campo abierto de Martínez¹⁰, desarrollada originalmente para evaluar el rendimiento locomotor después de SCI cervical en la rata, es una puntuación ordinal de 20 puntos que evalúa el rendimiento locomotor global durante la locomoción terrestre espontánea en un campo abierto. La puntuación se lleva a cabo por separado para cada extremidad utilizando una rúbrica que evalúa los parámetros específicos de una serie de medidas locomotoras, incluyendo el movimiento de las extremidades articulares, el soporte de peso, la posición del dígito, las habilidades de escalonamiento, la coordinación de las extremidades anteriores y posteriores, y la cola Posición. La puntuación de evaluación se deriva de la escala de clasificación de campo abierto Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) diseñada para evaluar el rendimiento locomotor después de la contusión torácica^21. Está adaptado para evaluar con precisión y fiofaidad la función locomotora de las extremidades anteriores y posteriores, permite una evaluación independiente de los diferentes parámetros de puntuación que no es susceptible con la puntuación jerárquica del BBB, y proporciona una recuperación lineal perfil¹⁰. Además, en comparación con el BBB, la puntuación de evaluación es sensible y fiable en los modelos de lesiones más graves^10,11,20,22. La puntuación de evaluación se ha utilizado para evaluar el deterioro locomotor en la rata después de la cera cervical^10,12 y torácica⁹ SCI solo y en combinación con lesión cerebral traumática²³.

Presentamos aquí un protocolo detallado paso a paso para realizar un Hemisección Torácica SCI a nivel vertebral T8 en la hembra Long-Evans, y para evaluar la recuperación del locomotor de las extremidades posteriores en el campo abierto.

Protocolo

Los experimentos descritos en este artículo se realizaron de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Montreal.

1. Cirugía de hemisección torácica

1. Use el equipo de protección adecuado (guantes, máscara y bata) para mantener un ambiente aséptico para la cirugía. Limpie el área quirúrgica con toallitas de alcohol y coloque cortinas quirúrgicas estériles sobre el campo quirúrgico. Esterilice las herramientas quirúrgicas y colóquelas en el campo quirúrgico.
2. Anestesiar a la rata bajo una mezcla de gas isoflurano (inducción del 3%, mantenimiento de 0,5 a 3%) y oxígeno (1 L/min). Confirme la profundidad anestésica quirúrgica adecuada verificando la ausencia de respuestas de pellizco de los dedos del dedo del tiempo y de reflejocornal. Supervise continuamente la rata durante todo el procedimiento y ajuste la cantidad de parto anestésico según sea necesario para mantener la profundidad anestésica quirúrgica.
3. Afeitar el tronco dorsal entre la cadera y el cuello, colocar la rata en el campo quirúrgico, desinfectar el sitio de la incisión con toallitas de alcohol y solución de proviodina, y mantener la temperatura corporal del núcleo a 37 oC utilizando una almohadilla de calentamiento controlada por retroalimentación supervisada por rectal Termómetro.
4. Coloque pomada oftálmica en los ojos para mantenerlos hidratados y volver a aplicarlos durante la cirugía según sea necesario.
5. Hacer una incisión de 2,5 cm en la piel que se superpone a las vértebras T6-T10 con un bisturí. Retraiga la piel y la grasa superficial con tijeras de disección contundente.
   NOTA: Los segmentos vertebrales T6-T10 pueden ser identificados ya sea rostrally por palpación suave de los segmentos dorsales de la columna vertebral desde la base del cráneo a partir de la notable protuberancia de la 2a vértebra torácica^24,o caudalmente por palpación de la costilla flotante más posterior que inducirá el movimiento en las vértebras torácicas 13.
6. Separe los músculos paravertebrales insertando en el aspecto dorsal de las vértebras T7-T9 usando tijeras de disección contundente y un retractor auto-retenedor. Desbrida y limpia cualquier tejido restante usando fórceps finos y aplicadores con punta de algodón para exponer los procesos espinosos y las láminas vertebrales.
   NOTA: Esto y los siguientes pasos están muy ayudados por la visualización microscópica (5 x 15 x ).
7. Corte cuidadosamente las facetas (articulaciones cigapophysial) bilateralmente en las vértebras T7 y T8 con delicados recortadores óseos. Cortar el tejido conectivo dorsal entre las láminas vertebrales T8 y T9 superficialmente con un bisturí (1 mm de profundidad) teniendo cuidado de no herir el cordón inferior.
8. Retire el proceso espinoso de la vértebra T8 con recortadores óseos. Con fórceps hemostáticos curvos cuidadosamente fijados en el proceso espinoso T7, gire el extremo caudal de la lámina T8 ligeramente rostrally (20o), inserte los recortadores óseos debajo de la lámina T8 y haga un corte de línea media que se extienda a lo largo de la lámina. Continúe la laminectomía repitiendo los cortes en el lado izquierdo y derecho de la lámina vertebral medial a los procesos transversales para exponer la médula espinal.
   NOTA: Tenga cuidado de eliminar todos los fragmentos óseos creados a partir de la laminectomía.
9. Drip lidocaína (2%, 0,1 ml) en el canal espinal expuesto y eliminar la dura superponiendo el segmento espinal T8 usando fórceps finos y tijeras de iridectomía. Repita la administración de lidocaína en el cordón expuesto e identifique la línea media del cordón mediante la visualización de una línea central creada entre los procesos espínes que se extienden entre la vértebra T7-T9 expuesta.
   NOTA: Junto con los procesos espinosos en T7 y T9, los ganglios de raíz dorsal expuestos en T8 también se pueden utilizar para ayudar a la identificación de la línea media y se puede colocar una aguja de 30 G en la línea media del cordón para ayudar con la hemisección posterior.
10. Hemisect la médula espinal desde la línea media hacia un lado con un cuchillo diseccionante. Tenga cuidado de no cortar a través de la arteria espinal anterior en el lado ventral (no aplique presión firme sobre el cuerpo vertebral). Usando tijeras de iridectomía, corte cuidadosamente a través de cualquier tejido restante en el lado lesionado de la médula espinal para asegurarse de que el cuadrante ventrolateral se transecta adecuadamente.
11. Coloque la esponja hemostática estéril empapada en solución salina (6 x 2 mm) en la cavidad expuesta por encima de la médula espinal y sutura las capas musculares (4-0 poliglactina 910). A continuación, sutura la piel alrededor del sitio de la incisión.
12. Proporcionar analgésico adecuado (buprenorfina 0,05 mg/kg subcutánea [s.c.]), antibiótico (enrofloxacino, 10 mg/kg s.c.) y reponer los líquidos perdidos con solución de anillo lactado de 5 cc (intraperitoneal [i.p.]) inmediatamente después de la cirugía.
13. Retire la rata de la anestesia. Coloque la rata en un ambiente cálido debajo de una almohadilla de calentamiento o una lámpara (a 33 oC) hasta que el animal esté completamente despierto.
14. Proporcionar analgesia suplementaria diariamente durante los primeros 3 días postquirúrgicos y monitorear continuamente los signos de dolor, pérdida de peso, micción inadecuada, infección, problemas con la cicatrización de heridas, o autofagia.

2. Procedimiento de prueba de campo abierto y puntuación de rendimiento locomotor

1. Manipule ratas diariamente durante 1 semana y habituado a la arena durante dos sesiones de 5 minutos antes de las pruebas para aclimatarse a ser recogidos, suavemente desde el medio del tronco, mientras que en el campo abierto y para asegurar la fiabilidad de la medición durante las pruebas.
2. Coloque una cámara a nivel del suelo frente a la arena circular de campo abierto de plexiglás para grabar sesiones de prueba para el análisis fuera de línea (30-60 fotogramas/s como mínimo).
3. Comience la grabación de vídeo y coloque la rata en el centro de la arena bajo condiciones de luz tenue para fomentar la actividad locomotora.
4. Continúe la sesión de prueba durante 4 min para asegurar una cantidad adecuada de peleas locomotoras para el análisis. Recoger y reemplazar ratas en el centro de la arena cuando permanecen estacionarias durante más de 20 s para promover la locomoción.
5. Puntuar el rendimiento locomotor de la sesión de prueba registrada completando la rúbrica proporcionada enTabla 1de acuerdo con los parámetros de las siguientes subsecciones.
   NOTA: Es útil puntuar cada parámetro por separado mediante la visualización repetida de la sesión de prueba grabada utilizando un software que permite una velocidad de reproducción variable y análisis fotograma a fotograma (por ejemplo, reproductor multimedia VLC).
   1. Para los movimientos de las extremidades articulares, puntuar los movimientos articulares de las extremidades posteriores durante la locomoción espontánea por separado para el tobillo, la rodilla y la cadera como normales (más de la mitad del rango de movimiento, puntuación otorgada a 2), leve (menos de la mitad del rango de movimiento, puntuación otorgada 1) o ausente (puntuación premiada 0).
   2. Para el apoyo al peso, evaluar la capacidad de los músculos extensores de las extremidades posteriores para contraer y apoyar el peso corporal cargado cuando la extremidad está en el suelo por separado para cuando la rata está estacionaria, así como durante la locomoción activa. Otorgue una puntuación de 1 cuando el soporte de peso esté presente y una puntuación de 0 cuando el soporte de peso esté ausente.
      NOTA: El soporte de peso estacionario se considera un perquisite para el soporte de peso activo.
   3. Para la posición del dígito, evalúe la posición de los dígitos de las extremidades posteriores mientras la rata está estacionaria y durante la locomoción. Otorgar una puntuación de 2 cuando los dígitos de las extremidades posteriores se extienden, se separan entre sí, y tónico durante la locomoción en más del 50% del período de prueba (considerado normal). Otorgue una puntuación de 1 cuando los dígitos permanezcan predominantemente flexionados y una puntuación de 0 cuando los dígitos permanezcan predominantemente atónicos.
   4. Para el paso, complete este parámetro solo si la rata puede soportar su peso corporal durante el paso. Evaluar el paso por la clasificación de la orientación de la posición de la pata de la extremidad posterior en el momento del contacto inicial y en el despegue del suelo, además de la fluidez de la fase de oscilación durante el paso.
      NOTA: Hay 3 puntuaciones para este parámetro descritas en las siguientes subsecciones evaluando por separado: 1) la orientación axial de la colocación de la pata en el contacto de las extremidades (colocación dorsal/plantar), 2) la orientación longitudinal de la colocación de la pata en el contacto inicial y durante la elevación (paralela al eje del cuerpo o girado interna/externamente), y 3) la calidad del movimiento de las extremidades durante la oscilación (regular o irregular).
      1. Para la colocación de la pata en el contacto de las extremidades, puntuar la orientación axial de la colocación de la pata en el contacto de las extremidades como 0 cuando las colocaciones dorsales se producen en más del 50% de los pasos.
         NOTA: La colocación plantar se considera perquisite para puntuar la orientación de la pata en contacto y elevación (paso 2.5.4.2), movimiento de oscilación (paso 2.5.4.3) y coordinación de las extremidades anteriores a las extremidades posteriores (paso 2.5.5).
      2. Para la orientación de la pata en el contacto y elevación de las extremidades, otorgue una puntuación de 2 cuando la pata longitudinal y los ejes del cuerpo sean paralelos y una puntuación de 1 cuando la extremidad se gira externa o internamente, por separado para el contacto con las extremidades y la elevación.
      3. Para el movimiento de oscilación, otorgue una puntuación de 2 cuando las articulaciones de las extremidades posteriores se muevan de manera armoniosa y regular durante el swing y una puntuación de 1 cuando se produzcan movimientos bruscos o espasmódicos de las articulaciones durante el swing.
   5. Para la coordinación entre las extremidades anteriores y traseras, complete este parámetro solo si se producen 4 pasos consecutivos durante las pruebas y si las extremidades pueden soportar activamente el peso corporal. Otorgar una puntuación de 3 cuando la coordinación es consistente (>90% de los pasos), 2 cuando es frecuente (50-90% de los pasos), 1 cuando es ocasional (<50% de los pasos) o 0 cuando está ausente (0% de los pasos).
      NOTA: La coordinación entre las extremidades anteriores y traseras se define como una alternancia regular al pasar entre la extremidad posterior que se está puntuando y la extremidad delantera en el mismo lado del cuerpo.
   6. Para la posición de la cola, evalúe la posición de la cola durante la locomoción como hacia arriba (fuera del suelo, con la puntuación otorgada 1) o hacia abajo (tocando el suelo, otorgando la puntuación 0).
      NOTA: Una posición elevada de la cola durante la locomoción es un indicador de la estabilidad del tronco en la rata. Después de la hemisección, la cola normalmente se mantiene cerca o tocando el suelo, ya que la estabilidad del tronco se ve afectada.
   7. Agregue las puntuaciones individuales de cada parámetro para proporcionar un total para cada extremidad posterior de un máximo de 20 puntos.
      NOTA: Una puntuación de 20 indica el rendimiento normal de la locomotora. Las puntuaciones <20 representan cantidades crecientes de deterioro locomotor y una puntuación de 0 indica parálisis de las extremidades.

Resultados

Las lesiones reproducibles con un alto grado de consistencia se pueden generar con la técnica de hemisección. Para evaluar y comparar el tamaño de las lesiones entre grupos experimentales, el área máxima de la lesión como porcentaje de la sección transversal total de la médula espinal se puede calcular fácilmente con la tinción histológica de las secciones de la médula espinal. La Figura 1 muestra una lesión representativa del hemicord izquierdo y una superposición de la propor...

Discusión

Una de las principales fortalezas de la técnica de hemisección es la selectividad y reproducibilidad de la lesión, lo que reduce la variabilidad en fenotipos histológicos y conductuales entre animales^25. Con el fin de garantizar una lesión unilateral en el nivel espinal adecuado, la identificación precisa tanto del segmento vertebral adecuado como de la línea media de la médula espinal es crítica. Como puede haber una tendencia a que la médula espinal gire en la dirección del corte dura...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc