ラットにおける胸部脊髄半切除手術とオープンフィールドロコ運動評価

要約

ラット胸部脊髄ヘミセクションは、一方的な脊髄損傷の貴重で再現可能なモデルであり、運動回収および治療効果の神経機構を調べる。この記事には、ヘミセクション手順を実行し、オープンフィールドアリーナでのローコモーターの性能を評価するための詳細なステップバイステップガイドが含まれています。

要約

脊髄損傷(SCI)は、病変のレベル以下の運動、感覚、自律神経機能の障害を引き起こす。実験動物モデルは、SCI後の運動回収に関与する神経機構を理解し、臨床集団の治療法を設計するための貴重なツールです。多種多様な種で使用されている挫傷、圧縮、および切除損傷を含むいくつかの実験的なSCIモデルがあります。片分断は脊髄の一方的な切除を伴い、片側のみ上降区域をすべて破壊する。脊髄ヘミセクションは、機能回復に関連するスペアドおよび損傷経路の神経可塑性を調べるのに有用である挫傷または圧縮技術と比較して、非常に選択的で再現可能な損傷を生み出す。ラットのT8椎体レベルで胸部半生切除を行うための詳細なステップバイステッププロトコルを提示し、その結果、病変側の後肢の初期麻痺を引き起こす。週間。また、オープンフィールドでの機能回復を評価するためのローコモータスコアリングプロトコルも提供しています。ローコモーター評価は線形回収プロファイルを提供し、より専門的な行動テストを行う適切な時間ポイントのために動物を正確にスクリーニングするために、傷害の早期および後に繰り返し行うことができます。提示されたヘミセクション技術は、他の切除モデルおよび種に容易に適合することができ、およびlocomotor評価は、ロコ運動機能をスコア付けするために、様々なSCIおよび他の傷害モデルで使用することができる。

概要

脊髄損傷(SCI)は、運動、感覚、および自律機能の重度の障害に関連しています。SCIの実験動物モデルは、SCI病理学に関わる解剖学的および生理学的事象を理解し、修復および回復における神経機構を調査し、潜在的な治療の有効性と安全性をスクリーニングするための貴重なツールである。介入。ラットはSCI研究1で最も一般的に使用される種です。ラットモデルは低コストで再現が容易で、機能的な結果を評価するために行動テストの大きなバッテリーが利用可能^です2.管の位置のいくつかの違いにもかかわらず、ラット脊髄は霊長類3、4を含むより大きな哺乳類と全体的に類似した感覚運動機能を共有する。ラットはまた、人間5に関連するSCIに類似した生理学的および行動的結果を共有する。非ヒト霊長類および大型動物モデルは、ヒトSCI⁶の近似を提供することができ、人間の実験前に治療の安全性と有効性を証明するために不可欠であるが、倫理的および動物の福祉のためにあまり一般的に使用されていない考慮事項、経費、および規制要件⁷.

ラットトランセクションSCIモデルは、解剖ナイフまたは線減少切除術後の切除術ハサミを用いて選択的病変を伴う脊髄の標的中断によって行われる。完全な切除と比較して、ラットの部分切除は、より少ない重症傷害、より容易な術後動物ケア、自発的な運動回収、および部分的なスペアリングで主に不完全であるヒトのSCIをより密接にモデル化する結果となる。脊髄と上脊髄構造を結ぶ組織⁸.一方的な片道は、片側のみのすべての上昇および下降区域を破壊し、定量化可能で再現性の高い運動障害を生み出し、基礎となる生物学的メカニズムの探索を強化する。半切除の最も顕著な機能的結果は、数週間にわたってローコ運動機能の等級付き自発的回復を伴う病変のレベルと同じ側の初期四肢麻痺である 9,^10,11歳,12.ヘミセクションモデルは、機能回復9、11、12^{に関連する損傷および残留路および回路の神経可塑性を調べるために特に有用である。13,14,15,16,17,18}.具体的には、胸部レベルで行われるヘミセクション、すなわち、後肢移動を制御する脊髄回路の上に、特に運動制御の変化を調べるための有用である。SCI¹⁹後の病変重症度とローコモータリカバリーとの間に非線形関係が存在するので、機能的結果を評価するための適切な行動試験が実験モデルにおいて最も重要である。

ラット2、20の機能的な運動回収の特定の側面を評価するために行動テストの包括的な電池が利用できる。多くのローコモーターテストは、ラットが体重を支えるためにあまりにも無効になっているので、SCIの後の早期に信頼性の高い対策を提供しません。怪我の後の早期の赤字に敏感で、術前の訓練や特殊な装置を必要としない自発的な運動性能の尺度は、適切な時間ポイントのロコモータの回復を監視するために有益である。特殊な行動テストを補完します。マルティネスオープンフィールド評価^スコア10は、もともとラットの頸部SCI後のロコ運動性能を評価するために開発されたもので、自発的な地上移動中のグローバルなローコ運動性能を評価する20点のオーディショナルスコアです。オープンフィールド。得点は、関節四肢の動き、体重サポート、数字位置、ステッピング能力、前肢後肢の調整、尾を含む一連のロコモーター測定の特定のパラメータを評価するルーブリックを使用して、各四肢に対して別々に行われます。位置。評価スコアは、胸部挫^傷21後のロコ運動性能を評価するように設計されたバッソ、ビーティーおよびブレスナハン(BBB)オープンフィールド評価尺度から導き出されます。それは正確かつ確実に前肢および後肢の運動運動機能を評価するために合わせ、BBBの階層的な得点と受け入れられなかった異なった採点変数の独立した査定を可能にし、線形回復を提供するプロファイル¹⁰.さらに、BBBと比較して、評価スコアは、より重度の傷害モデル10、11、20、22において敏感で信頼性が高い。評価スコアは、頸部10、12^および胸部9 SCI単独および外傷性脳損傷23との組み合わせでラットのlocomotor障害を評価するために使用されている。

ここでは、雌のロングエバンスラットのT8椎体レベルで胸部半分化SCIを行い、オープンフィールドでの後肢運動回収を評価するための詳細なステップバイステッププロトコルを示す。

プロトコル

この記事に記載されている実験は、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われ、モントリオール大学の倫理委員会によって承認されました。

1. 胸部血行切除手術

1. 手術のための無菌環境を維持するために、適切な保護具(手袋、マスク、ガウン)を着用してください。アルコールワイプで外科領域をきれいにし、外科分野の上に生殖不能の外科ドレープを置く。外科用具を殺菌し、外科分野に置く。
2. イソムランガス(3%誘導、0.5-3%の維持)と酸素(1 L/min)の混合物の下でラットを麻酔する。つま先のつまみと角膜反射応答の不在を確認することにより、適切な外科的麻酔深さを確認します。手順全体の間にラットを継続的に監視し、外科的麻酔深度を維持するために必要に応じて麻酔送達の量を調整する。
3. 股関節と首の間に背中の幹を剃り、ラットを外科場に置き、アルコール拭きとプロビオジン溶液で切開部位を消毒し、直腸で監視されるフィードバック制御の加熱パッドを使用して37°Cでコア体温を維持します。温度計。
4. 眼の防血を目に入れて水分補給を保ち、必要に応じて手術中に再適用してください。
5. メスでT6-T10椎骨をオーバーレイ皮膚に2.5センチメートルの切開を行います。鈍い解剖はさみを使用して皮膚と表面脂肪を引き込みます。
   注:T6−T10椎体セグメントは、第2胸椎24の顕著な突起から始まる頭蓋骨の基部からの背部脊髄セグメントの穏やかな触診によって、または口頭で識別することができる。 第13胸椎の動きを誘発する最後部浮遊肋骨の触診。
6. 鈍い解剖のはさみおよび自己保持リトラクタを使用してT7-T9脊椎の背部側面に挿入される副椎筋を分離する。デブライドと細かい鉗子と綿の先端アプリケータを使用して残りの組織をクリアし、脊椎のプロセスと椎体のラミナエを露出させます。
   注:これと、以下のステップは、顕微鏡的な可視化(~5−15x)によって大いに助けられます。
7. 繊細な骨トリマーでT7とT8椎骨の両側にファセット(zygapophysial関節)を慎重にカットします。T8とT9脊椎の間の背部結合組織を表面的にメス(1mmの深さ)で切り取り、下敷きのコードを傷つけないように注意する。
8. 骨トリマーでT8椎骨の脊椎の脊椎プロセスを取り除きます。曲げられた止血鉗子をT7の脊椎プロセスで慎重に締め付け、T8ラミネの小体端をわずかに回転させ(〜20°)、T8ラミナの下に骨トリマーを挿入し、ラミナに沿って伸びる中間線カットを行います。脊椎のラミナ中間体の左右の切り傷を横方向のプロセスに繰り返して、脊髄を露出させ、副膜切り取りを続けます。
   注: ラミネクトミーから作成されたすべての骨断片を除去するように注意してください。
9. 露出した脊柱管のドリップリドカイン(2%、0.1 mL)と細かい鉗子と二度切除性のはさみを使用してT8脊柱セグメントをオーバーレイする硬膜を除去します。露出したコードにリドカイン投与を繰り返し、露出したT7−T9椎骨の間に延びる脊椎間に作成された中心線の可視化によってコードの中線を識別する。
   注:T7およびT9の脊椎プロセスと共に、T8の露出した背面根神経節はまた中間線の識別を助けるために使用することができ、30 G針は、その後の半断を助けるためにコードの中間線に置くことができる。
10. 解剖ナイフで脊髄を中間線から片側に向かってヘミセクトします。腹部側の前脊柱動脈を切らない(椎体にしっかりとした圧力をかけない)。二重切除ハサミを用いて、脊髄の病変側の残りの組織を慎重に切断し、心室象限が適切に透過されることを確認する。
11. 無菌生理生理生殖止め止め止めスポンジ(~6 x 2mm)を脊髄の上の露出した空洞に置き、筋肉層を縫合する(4-0ポリグラクチン910)。次に、切開部位の周りに皮膚を縫合する。
12. 適切な鎮痛薬(ブプレノルフィン0.05mg/kg皮下[s.c.])、抗生物質(エンロフロキサシン、10mg/kg s.c.)を提供し、手術直後に5cc乳酸リンガー溶液(腹腔内[i.p.])で失われた液体を補充する。
13. ラットを麻酔から取り除く。動物が完全に目を覚ますまで、加熱パッドまたはランプ(~33°C)の下に温かい環境でラットを置きます。
14. 最初の3日間にわたって毎日補足鎮痛剤を提供し、痛み、体重減少、不適切な口実、感染症、創傷治癒の問題、またはオートファジアの徴候を継続的に監視します。

2. オープンフィールド試験手順とローコモータ性能スコアリング

1. ラットを毎日1週間取り扱い、テスト前に2回の5分間のセッションでアリーナに常習し、オープンフィールドで、オープンフィールドで、テスト中に測定の信頼性を確保するために、中間トランクから穏やかにピックアップされるように順応します。
2. 円形プレキシガラスオープンフィールドアリーナに面した地上レベルにカメラを設置し、オフライン解析(最小30~60フレーム)のテストセッションを記録します。
3. ビデオ録画を開始し、薄暗い光の条件下でアリーナの中央にラットを配置し、運動活動を奨励します。
4. 分析のための十分な量のロコモーターの試合を確実にするために、4分間のテストセッションを続けます。彼らは移動を促進するために20s以上静止したまま、アリーナの中央にネズミをピックアップし、交換します。
5. で提供されるルーブリックを完了することにより、記録されたテストセッションのスコアローコモータ性能表 1次のサブセクションのパラメータに従って。
   注:可変再生速度とフレームごとの分析(例えば、VLCメディアプレーヤー)を可能にするソフトウェアを使用して、記録されたテストセッションを繰り返し表示することにより、各パラメータを個別にスコア付けすると便利です。
   1. 関節四肢の動きの場合、足首、膝、股関節の自発的な移動中の後肢関節の動きを通常どおりにスコア(運動範囲の半分以上、スコア=2)、わずか(運動範囲の半分未満、授与スコア)。= 1)、または不在(授与スコア = 0)。
   2. 体重サポートの場合は、ラットが静止しているときと活動的な移動中に、四肢が地面にあるときに、荷を積まれた体重を収縮させ、サポートする後肢伸張筋の能力を評価します。体重サポートが存在する場合は1のスコアを与え、体重サポートが存在しない場合は0のスコアを与える。
      注:静止重量サポートは、アクティブな体重サポートのための必要条件とみなされます。
   3. 数字の位置については、ラットが静止している間と移動中の後肢桁の位置を評価します。後肢の数字が延長され、互いに間隔をあけ、テスト期間の50%以上で移動中に強壮剤が(正常と見なされる)場合、2のスコアを授与します。数字が主に屈曲したままの場合は 1 のスコアを与え、数字が主にアトニックのままである場合は 0 のスコアを与えます。
   4. ステッピングの場合は、ラットがステッピング中に体重をサポートできる場合にのみ、このパラメータを完了します。ステッピング中のスイングフェーズの流動性に加えて、最初の接触時と地面からのリフトオフ時の後肢の位置を評価してステッピングを評価します。
      注:別々に評価する次のサブセクションで説明されているこのパラメータの3つのスコアがあります:1)手足接触での足の配置の軸方向(後部/足底の配置)、2)最初の接触時の足の配置の縦方向の向きそして、リフト中(体軸に平行または内部/外部的に回転)、および3)スイング中の四肢の動きの質(規則的または不規則)。
      1. 四肢接触での足の配置の場合、後部配置がステップの50%以上で発生した場合、四肢接触における足の位置の軸方向を0としてスコア付けします。
         注:足底の配置は、接触とリフト(ステップ2.5.4.2)、スイング移動(ステップ2.5.4.3)および前肢後肢調整(ステップ2.5.5)で足の向きを採点するための必要条件とみなされます。
      2. 四肢の接触とリフトの足の向きについては、縦方向の足と体の軸が平行な場合は 2 のスコアを与え、四肢が外部または内部で回転する場合は 1 のスコアを、四肢の接触とリフトの両方に対して別々に与えます。
      3. スイングムーブメントの場合は、後肢関節がスイング中に調和した規則的な方法で動くときに2のスコアを与え、スイング中に関節のぎくしゃくまたは痙攣運動が起こった場合は1のスコアを与えます。
   5. 前肢-後肢の調整の場合は、テスト中に4つの連続したステップが発生し、四肢が積極的に体重をサポートできる場合にのみ、このパラメータを完了してください。コーディネーションが一貫している場合は3(ステップの90%)、頻繁な場合は2(ステップの50-90%)、時折1(<50%のステップ)、不在時は0(ステップの0%)のスコアを与えます。
      注:前肢-後肢のコーディネーションは、後肢が採点され、体の同じ側の前肢との間をステップする場合の規則的な交互として定義されます。
   6. 尾の位置の場合、移動中の尾の位置を上(地面から離れて、スコア = 1)または下 (地面に触れ、スコア = 0 を与える) のいずれかとして評価します。
      注:移動中の尾の位置が上昇することは、ラットの体幹の安定性を示す指標です。体幹切除後、尾部は通常、体幹の安定性が損なわれるため、地面の近くまたは触れ続けます。
   7. 各パラメータから個々のスコアを追加して、最大20ポイントの各後肢の合計を提供します。
      注:スコア20は、通常の運動性能を示します。スコア<20は、運動障害の増加量を表し、スコア0は四肢麻痺を示す。

結果

高い一貫性を持つ再現可能な病変は、ヘミセクション技術で生成することができる。実験グループ間の病変サイズを評価および比較するために、脊髄の全断面のパーセンテージとしての病変の最大領域は、脊髄セクションの組織学的染色によって容易に計算することができる。図1は、左ヘミコードの代表的な病変と、断面帯面積の平均病変サイズ47.3%±4.0%を持つラット?...

ディスカッション

ヘミセクション技術の主な強みは、^動物25間の組織学的および行動的現象の変動性の低下につながる病変の選択性および再現性である。適切な脊椎レベルで一方的な病変を確保するためには、適切な椎体セグメントと脊髄中線の両方を正確に同定することが重要です。ヘミセクション手順中に脊髄が切断の方向に回転する傾向があるので、手順の間に両側に置かれた細かい?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc