쥐의 흉척 척수 위축 수술 및 개방운동 운동 평가

요약

쥐 흉부 척추 절제술은 운동 성 회복 및 치료 효능의 신경 메커니즘을 조사하기 위해 일방적 인 척수 손상의 귀중하고 재현 가능한 모델입니다. 이 문서에는 hemisection 절차를 수행하고 오픈 필드 경기장에서 운동 성능을 평가하기 위한 자세한 단계별 가이드가 포함되어 있습니다.

초록

척수 손상 (SCI)은 병변 수준 이하의 운동, 감각 및 자율 기능에 장애를 일으킵니다. 실험동물 모델은 SCI 후 운동 성 회복에 관여하는 신경 메커니즘을 이해하고 임상 집단을 위한 치료법을 설계하는 귀중한 도구입니다. 다양한 종에서 사용되는 타박상, 압축 및 성분절 손상을 포함한 여러 실험SCI 모델이 있습니다. 반구는 척수의 일방적 인 절제술을 포함하고 한쪽에만 모든 오름차순 및 내림차순 을 방해합니다. 척추 위면은 기능 회복과 관련된 절약 및 손상된 경로에서 신경 가소성을 조사하는 데 유용한 타박상 또는 압축 기술과 비교하여 매우 선택적이고 재현 가능한 부상을 일으킵니다. 우리는 여러 가지에 걸쳐 운동 기능의 등급이 매겨진 자발적인 회복과 병변의 측면에 뒷다리의 초기 마비를 초래하는 쥐의 T8 척추 수준에서 흉부 척수 에서 흉부 척면을 수행하기위한 상세한 단계별 프로토콜을 제시 주. 우리는 또한 오픈 필드에서 기능 적 회복을 평가하기 위해 운동 점수 프로토콜을 제공합니다. 운동 평가는 선형 회복 프로파일을 제공하며 부상 후 조기 및 반복적으로 수행될 수 있어 보다 전문적인 행동 테스트를 수행하기 위한 적절한 시점에 대해 동물을 정확하게 스크리볼 수 있습니다. 제시된 반구 기술은 다른 전도 모델 및 종에 용이하게 적응될 수 있으며, 운동 성 평가는 다양한 SCI 및 기타 상해 모델에서 운동 기능을 점수화하는 데 사용될 수 있다.

서문

척수 손상 (SCI)은 모터, 감각 및 자율 기능의 심각한 장애와 관련이 있습니다. SCI의 실험 동물 모델은 SCI 병리학에 관련된 해부학 적 및 생리적 사건을 이해하고, 수리 및 회복의 신경 메커니즘을 조사하고, 잠재적 인 치료의 효능과 안전성을 검사하는 귀중한 도구입니다. 개입. 쥐는 SCI 연구 1에서 가장일반적으로 사용되는 종입니다. 쥐 모델은 저렴한 비용으로 재생이 용이하며, 행동 테스트의 큰 배터리는기능 결과를 평가하기 위해 사용할 수 있습니다 2. 요로 위치에 있는 몇몇 다름에도 불구하고, 쥐 척수는 영장류^3,4를포함하여 더 큰 포유동물과 전반적인 유사한 감각 운동 기능을 공유합니다. 쥐는 또한 인간과 관련된 SCI에 유사한 생리적 및 행동 적 결과를 공유⁵. 비인간 영장류 및 대형 동물 모델은 인간 SCI 6의 근사치를 더 가깝게 제공할 수 있으며 인간 실험 전에 치료 안전성과 효능을 입증하는 데 필수적이지만 윤리적 및 동물 복지로 인해 덜 일반적으로 사용됩니다. 고려 사항, 비용 및규제 요구 사항 7.

쥐 transection SCI 모형은 절제 나이프 또는 laminectomy 후에 iridectomy 가위를 사용하여 선택적인 병변을 가진 척수의 표적으로 한 중단에 의해 수행됩니다. 완전한 transection에 비해, 쥐에 있는 부분 적인 transection는 보다 적게 가혹한 상해 귀착됩니다, 수술 후 동물 관리, 자발적인 운동 성 복구, 및 부분적인 절약으로 우세하게 불완전한 인간에 있는 더 밀접하게 모형 SCI 척수와 척수 구조를 연결하는조직 8. 일방적인 위미섹션은 한쪽에서만 모든 오름차순 및 내림차순 을 방해하고, 정량화 가능하고 매우 재현 가능한 운동 적자를 생성하여 근본적인 생물학적 메커니즘의 탐구를 향상시킵니다. 반구의 가장 두드러진 기능적 결과는 몇 주 동안 운동 기능의 등급이 매겨진 자발적인 회복과 병변의수준 이하의 초기 사지 마비입니다 9,^{10, 11세 , 12}. 편도모델은 기능회복과 관련된 손상및잔류관및회로의신경가소성을 조사하는데 특히유용하다 9,^{11,12, 13,14,15,16,17,18}. 특히, 흉부 수준에서 수행 된 심층절제술, 즉 뒷다리 운동을 제어하는 척추 회로 위에는 운동 제어의 변화를 조사하는 데 특히 유용합니다. SCI¹⁹이후 병변 심각도와 운동 성 회복 사이에 비선형 관계가 존재하기 때문에 기능적 결과를 평가하기 위한 적절한 행동 테스트가 실험 모델에서 가장 중요합니다.

행동 테스트의 포괄적 인 배터리는 쥐^2,20에서기능성 운동 회복의 특정 측면을 평가하기 위해 사용할 수 있습니다. 쥐가 체중을 지원하기에는 너무 비활성화되어 있기 때문에 많은 운동 운동 테스트는 SCI 후 초기에 신뢰할 수있는 조치를 제공하지 않습니다. 부상 후 조기에 적자에 민감하고 수술 전 훈련이나 특수 장비가 필요하지 않은 자발적인 운동 성능 측정은 적절한 시간 지점에 대한 운동 성 회복을 모니터링하는 데 유용합니다. 보충 전문 행동 테스트. Martinez 오픈 필드 평가 점수^10,원래 쥐에 자궁 경부 SCI 후 운동 성능을 평가하기 위해 개발, 자발적인 지상 운동 동안 글로벌 운동 성능을 평가하는 20 점 서수 점수입니다 오픈 필드. 점수 매기기는 관절 사지 운동, 체중 지원, 자리 위치, 스테핑 능력, 앞다리 뒷다리 조정 및 꼬리를 포함한 다양한 운동 측정의 특정 매개 변수를 평가하는 루브릭을 사용하여 각 팔다리에 대해 별도로 수행됩니다. 위치. 평가 점수는 흉부^{타박상(21)}후 운동 성능을 평가하도록 설계된 바소, 비티 및 브레스나한(BBB) 오픈 필드 등급 척도에서 파생됩니다. 그것은 정확하고 안정적으로 앞다리와 뒷다리 운동 기능을 모두 평가하도록 적응, BBB의 계층 적 점수와 허용되지 않는 다른 점수 매개 변수의 독립적 인 평가를 허용하고, 선형 복구를 제공합니다 프로필¹⁰. 또한, BBB에 비해, 평가 점수는 더 심각한 부상 모델^{10,11,20,22에서}민감하고 신뢰할 수 있다. 평가 점수는 자궁 경부^10,12 및 흉부⁹ SCI 단독으로 외상성 뇌 손상 (23)과 함께 다음 쥐에서 운동 손상을 평가하는 데 사용되었습니다.

우리는 여기에서 여성 롱 에반스 쥐의 T8 척추 수준에서 흉부 척수 SCI를 수행하고 오픈 필드에서 뒷다리 운동 회복을 평가하기위한 상세한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

이 문서에 설명 된 실험은 동물 관리에 대한 캐나다위원회의 지침에 따라 수행하고 몬트리올 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 흉부 위면 수술

1. 수술용 무균 환경을 유지하기 위해 적절한 보호 장비(장갑, 마스크 및 가운)를 착용하십시오. 알코올 물티슈로 수술 부위를 청소하고 멸균 수술 용 커튼을 수술 부위에 놓습니다. 수술 도구를 살균하고 수술 분야에 배치합니다.
2. 이소플루란 가스 (3 % 유도, 0.5-3 % 유지 보수) 및 산소 (1 L / 분)의 혼합물로 쥐를 마취시다. 발가락 핀치와 각막 반사 반응의 부재를 확인하여 적절한 수술 마취 깊이를 확인합니다. 전체 시술 동안 쥐를 지속적으로 모니터링하고 수술 마취 깊이를 유지하기 위해 필요에 따라 마취 전달량을 조정합니다.
3. 엉덩이와 목 사이의 등쪽 트렁크를 면도하고, 쥐를 수술 장에 놓고, 절개 부위를 알코올 물티슈와 프로비오딘 용액으로 소독하고, 직장에 의해 모니터링되는 피드백 제어 가열 패드를 사용하여 37 °C에서 핵심 체온을 유지하십시오. 온도계.
4. 안과 연고를 눈에 바르고 수분을 유지하고 필요에 따라 수술 내내 다시 발라주세요.
5. T6−T10 척추를 메스로 겹치는 피부에 2.5 cm 절개를 합니다. 무딘 해부 가위를 사용하여 피부와 표면 지방을 철회하십시오.
   참고 : T6-T10 척추 세그먼트는 2^nd 흉부 척추 24의 눈에 띄는 protuberance에서 시작하여 두개골의 기지에서 등쪽 척추 세그먼트의 부드러운 촉진에 의해 rostally 식별 할 수 있습니다²⁴, 또는 caudally 13^th 흉부 척추에서 움직임을 유도하는 가장 후방 부동 갈비뼈의 촉진.
6. 무딘 해부 가위와 자기 유지 리트랙터를 사용하여 T7-T9 척추의 등쪽 측면에 삽입하는 척추 근육을 분리하십시오. 가낭 공정 및 척추 라미나에 노출미세 집게와 면 팁 어플리케이터를 사용하여 남아있는 조직을 debride 및 취소.
   참고 : 이것은, 다음 단계는 크게 현미경 시각화 (~ 5−15x)에 의해 도움이된다.
7. 조심스럽게 섬세한 뼈 트리머와 T7과 T8 척추에 양측 면 (zygapophysial 관절)을 잘라. T8과 T9 척추 라미나 사이의 등쪽 결합 조직을 메스(깊이 1mm)로 피상적으로 잘라 내어 밑줄이 손상되지 않도록 주의하십시오.
8. 뼈 트리머로 T8 척추의 회전 과정을 제거합니다. T7 가중 공정에 조심스럽게 고정 된 곡선 지혈 포셉으로 T8 라미네이트의 꼬리 끝을 약간 장밋빛 (~ 20 °)으로 회전시키고 T8 라미나 아래에 뼈 트리머를 삽입하고 라미나를 따라 연장되는 미드 라인 컷을 만듭니다. 척수를 노출하는 가로 과정에 척추 층의 왼쪽과 오른쪽에 상처를 반복하여 laminectomy을 계속합니다.
   참고 : 라민 절제술에서 생성 된 모든 뼈 조각을 제거해야합니다.
9. 노출된 척추관에서 드립 리도카인(2%, 0.1 mL)을 제거하고 미세 한 집게와 무당류 가위를 사용하여 T8 척추 세그먼트를 오버레이하는 경막을 제거합니다. 노출된 코드에 리도카인 투여를 반복하고 노출된 T7−T9 척추 사이에서 연장되는 가시 성 과정 사이에 생성된 중심선의 시각화를 통해 코드의 중간선을 식별합니다.
   참고 : T7 및 T9의 가시 공정과 함께 T8의 노출 된 등쪽 뿌리 중추는 미드 라인의 식별을 돕기 위해 사용할 수 있으며 30G 바늘은 후속 편도를 돕기 위해 코드의 중간선에 배치 할 수 있습니다.
10. 해부 칼로 한쪽으로 중간선에서 척수를 반추합니다. 복부 측의 전방 척추 동맥을 절단하지 않도록주의하십시오 (척추 신체에 단단한 압력을 가하지 마십시오). iridectomy 가위를 사용하여 척수의 병변 쪽에 남아있는 조직을 조심스럽게 잘라 혈관 측쪽 사분면이 적절하게 전환되도록합니다.
11. 멸균 식염수 에 젖은 지혈 스폰지 (~ 6 x 2mm)를 척수 위의 노출 된 구멍에 놓고 근육 층 (4-0 폴리 글락틴 910)을 봉합하십시오. 다음으로, 절개 부위 주위의 피부를 봉합한다.
12. 적절한 진통을 제공 (buprenorphine 0.05 mg/ kg 피하 [s.c.]), 항생제 (enrofloxacin, 10 mg / kg s.c.), 5 cc 수유 벨소리의 솔루션으로 잃어버린 체액을 보충 (복강 내 [i.p.]) 수술 직후.
13. 마취에서 쥐를 제거하십시오. 동물이 완전히 깨어날 때까지 가열 패드 또는 램프 (~ 33 °C)에서 따뜻한 환경에 쥐를 놓습니다.
14. 처음 3 수술 후 일 동안 매일 보충 진통을 제공하고 지속적으로 통증의 징후를 모니터링, 체중 감소, 부적절한 micturition, 감염, 상처 치유 문제, 또는 autophagia.

2. 오픈 필드 테스트 절차 및 운동 성능 점수

1. 쥐를 매일 1주일 동안 처리하고 5분 동안 경기장에 습관화하여 테스트 전에 중간 트렁크에서 부드럽게 픽업에 적응하고, 오픈 필드에서 측정 신뢰성을 보장합니다.
2. 원형 플렉시글라스 오픈 필드 경기장을 향한 지상에 카메라를 배치하여 오프라인 분석을 위한 테스트 세션(최소 30-60프레임/s)을 기록합니다.
3. 비디오 녹화를 시작하고 운동 활동을 장려하기 위해 희미한 조명 조건에서 경기장 중앙에 쥐를 배치합니다.
4. 분석을 위해 적절한 양의 운동 경기를 보장하기 위해 4 분 동안 테스트 세션을 계속하십시오. 경기장을 중심으로 20s 이상 고정된 상태로 유지되면 쥐를 집어 들고 교체하여 운동을 촉진하십시오.
5. 제공된 루브릭을 완료하여 기록된 테스트 세션의 운동 성능 점수표 1다음 하위 섹션의 매개 변수에 따라.
   참고: 가변 재생 속도 및 프레임별 분석(예: VLC 미디어 플레이어)을 허용하는 소프트웨어를 사용하여 기록된 테스트 세션을 반복해서 확인하여 각 매개 변수를 개별적으로 채점하는 것이 좋습니다.
   1. 관절 사지 운동의 경우, 발목, 무릎 및 엉덩이에 대해 자발적으로 운동하는 동안 뒷다리 관절 움직임을 정상 (운동 범위의 절반 이상, 점수 = 2) 및 약간의 (운동 범위의 절반 미만, 점수 수여) = 1) 또는 부재(수여 점수 = 0).
   2. 체중 지원을 위해, 쥐가 고정되어있을 때뿐만 아니라 활성 운동 중에 사지가 별도로 지상에있을 때 로드 된 체중을 수축하고 지원하는 뒷다리 신근 근육의 능력을 평가하십시오. 체중 지원이 있을 때 1의 점수와 체중 지원이 없을 때 0의 점수를 부여합니다.
      참고: 고정 중량 지지대는 활성 체중 지원에 필요한 것으로 간주됩니다.
   3. 숫자 위치의 경우 쥐가 고정되어 있고 운동 중에 뒷다리 숫자의 위치를 평가합니다. 뒷다리 숫자가 확장되고 서로 간격을 두고 운동 중 토닉이 시험 기간의 50% 이상(정상으로 간주)되면 2점을 부여합니다. 숫자가 주로 구부러진 상태로 유지될 때 1의 점수를 부여하고 숫자가 주로 atonic으로 남아있을 때 0 의 점수를 부여합니다.
   4. 스테핑의 경우 쥐가 스테핑 중에 체중을 지원할 수 있는 경우에만 이 매개 변수를 완료합니다. 스테핑 시 스윙 단계의 유동성 외에 초기 접촉 시 및 지면에서 들어올릴 때 의 방향에 따라 스테핑을 평가합니다.
      참고 : 별도로 평가 다음 하위 섹션에 설명 된이 매개 변수에 대한 3 점수가 있습니다 : 1) 사지 접촉에서 발 배치의 축 방향 (등쪽 / 발바닥 배치), 2) 초기 접촉에서 발 배치의 종방향 및 리프트 (몸축에 평행하거나 내부 / 외부로 회전) 및 3) 스윙 중 팔다리 운동의 품질 (일반 또는 불규칙) 동안.
      1. 사지 접촉에서 발 배치의 경우 등등 배치가 단계의 50% 이상에서 발생할 때 사지 접촉에서 발 배치의 축 방향을 0으로 채점합니다.
         참고: 발바닥 배치는 접촉 및 리프트(단계 2.5.4.2), 스윙 이동(단계 2.5.4.3) 및 앞다리 뒷다리 조정(2.5.5단계)에서 발의 방향을 채점하기 위한 필수 조건으로 간주됩니다.
      2. 사지 접촉 및 리프트에서 발 방향의 경우 세로 발과 몸체 축이 평행할 때 2의 점수를 부여하고 사지가 외부 또는 내부적으로 회전 할 때 1 점수를 따로 따로 부여합니다.
      3. 스윙 운동의 경우, 뒷다리 관절이 스윙 중에 조화롭고 규칙적인 방식으로 움직일 때 2의 점수를, 스윙 중에 관절의 육포 또는 경련 운동이 발생할 때 1 의 점수를 부여합니다.
   5. 앞다리 뒷다리 조정의 경우, 테스트 중에 4 개의 연속 단계가 발생하고 사지가 체중을 적극적으로 지원할 수있는 경우에만이 매개 변수를 완료하십시오. 조정이 일관된 경우(>90% 단계), 빈번한 경우(단계의 50-90%), 가끔(걸음 수의 50%), 결석 시 0(단계의 0%)이 있을 때 3점을 부여합니다.
      참고: 앞다리-뒷다리 협응은 득점되는 뒷다리와 신체의 같은 쪽의 앞다리 사이의 스테핑에서 규칙적인 교대로 정의됩니다.
   6. 꼬리 위치의 경우 운동 중 꼬리 위치를 위(지면 에서, 수여된 점수 = 1) 또는 아래로(지면에 닿기, 점수 = 0)로 평가합니다.
      참고: 운동 중 높은 꼬리 위치는 쥐의 트렁크 안정성을 나타냅니다. 반구 후, 꼬리는 일반적으로 트렁크 안정성이 손상되기 때문에 가까이 또는 땅에 닿는 개최됩니다.
   7. 각 매개 변수의 개별 점수를 추가하여 최대 20점의 각 뒷다리에 대한 합계를 제공합니다.
      참고: 20의 점수는 정상적인 운동 성능을 나타냅니다. 점수 <20은 운동 장애의 증가양을 나타내고 0의 점수는 사지 마비를 나타냅니다.

결과

높은 수준의 일관성을 가진 재현 가능한 병변은 반면 기술로 생성 될 수 있습니다. 실험 군 간의 병변 크기를 평가하고 비교하기 위해 척수의 총 단면의 백분율로 병변의 최대 면적을 척수 섹션의 조직학적 염색으로 쉽게 계산할 수 있습니다. 도 1은 좌측 반단의 대표적인 병변 및 절단코드 영역의 평균 병변 크기47.3% ±4.0%를 가진 쥐 들 사이에서 공유된 최대 병변 영역의 비?...

토론

반면 기술의 주요 강점은 병변의 선택성 및 재현성으로 동물⁽²⁵⁾사이의 조직학적 및 행동 표현형의 가변성 감소로 이어진다. 적절한 척추 수준에서 일방적 인 병변을 보장하기 위해서는 적절한 척추 세그먼트와 척수 중간선의 정확한 식별이 중요합니다. 척수가 하구 시술 중에 절단 방향으로 회전하는 경향이 있을 수 있으므로 시술 중 양쪽에 미세한 집게를 배치하여 코드를 섬?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc