Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Resumen

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Resumen

Las células tumorales circulantes (CTC) derivadas del tumor primario se derraman en el torrente sanguíneo o en el sistema linfático. Estas células raras (1 a 10 células por ml de sangre) justifican un mal pronóstico y están correlacionadas con una supervivencia global más corta en varios tipos de cáncer (por ejemplo, mama, próstata y colorrectal). Actualmente, el sistema de captura de CTC basado en perlas magnéticas recubierta con recubrimiento anti-EpCAM es la prueba estándar de oro aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus otros) para enumerar los CTC en el torrente sanguíneo. Esta prueba se basa en el uso de perlas magnéticas recubiertas con marcadores anti-EpCAM, que se dirigen específicamente a las células cancerosas epiteliales. Muchos estudios han ilustrado que EpCAM no es el marcador óptimo para la detección de CTC. De hecho, los CTC son una subpoblación heterogénea de células cancerosas y son capaces de someterse a una transición epitelial a mesenquimal (EMT) asociada con la proliferación e invasión metastásica. Estos CTC son capaces de reducir la expresión del marcador eptelítico de superficie celular EpCAM, mientras que aumentan los marcadores mesenquimales como la vimentina. Para hacer frente a este obstáculo técnico, se han desarrollado otros métodos de aislamiento basados en las propiedades físicas de los CTC. Las tecnologías microfluídicas permiten un enfoque sin etiquetas para el enriquecimiento de CTC a partir de muestras de sangre enteras. La tecnología microfluídica espiral utiliza las fuerzas de arrastre inercial y Dean con flujo continuo en canales curvos generados dentro de un chip microfluídico espiral. Las células se separan en función de las diferencias de tamaño y plasticidad entre las células sanguíneas normales y las células tumorales. Este protocolo detalla los diferentes pasos para caracterizar la expresión programada de la muerte-ligand 1 (PD-L1) de los CTC, combinando un dispositivo microfluídico espiral con un conjunto de marcadores de inmunofluorescencia personalizable (IF).

Introducción

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del antígeno tumoral desempeñan un papel crucial en la respuesta a los cánceres a través de un proceso conocido como "vigilancia inmune" del cáncer. Sus funciones antitumorales se ven reforzadas por anticuerpos de bloqueo de punto de control inmune como inhibidores de CTLA-4 e inhibidores de PD-1/PD-L1. En el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), las terapias anti-PD-1/PD-L1 dan como resultado tasas de respuesta que oscilan entre el 0% y el 17% en pacientes con tumores PD-L1 negativos y un 36%-100% en aquellos que expresan PD-L1. Las respuestas sólidas al bloqueo PD-1/PD-L1 observado según el melanoma y el NSCLC se muestran mediante evidencia de una mejor tasa de respuesta global (RR), beneficios clínicos duraderos y supervivencia libre de progresión (SLP). Actualmente, los tratamientos anti-PD1 son el estándar de atención en el tratamiento de Segunda Línea de NSCLC con nivolumab independientemente de la expresión de PD-L1 y con pembrolizumab en pacientes que expresan PD-L1 a 1%. En el tratamiento de primera línea, el estándar de atención es pembrolizumab solo en pacientes con CPSN que expresa PD-L1 el 50% y puede mejorarse potencialmente con quimioterapia (platin y doblete dependiendo del subtipo histológico)^1,2.

Sin embargo, este enfoque para el manejo del paciente es discutible³, ya que la expresión de PD-L1 en células tumorales por inmunohistoquímica (IHC) probablemente no es el biomarcador complementario más ideal. Otros como la carga de mutación tumoral⁴ (TMB), la inestabilidad de microsatélites (MSI) y/o la microbiota son posiblemente interesantes en este entorno, ya sea solo o en combinación. Se sabe que el CPNC son tumores heterogéneos, ya sea espacialmente (de un sitio tumoral a otro) o temporalmente (desde el diagnóstico hasta la recurrencia). Los pacientes con NSCLC suelen ser frágiles, y las biopsias de tejidos invasivos iterativos pueden ser un problema. De hecho, la tasa de rebiopsia en la primera progresión oscila entre 46%-84% dependiendo de la serie, y la re-biopsia exitosa (es decir, con análisis histológico y molecular completo) oscila entre 33%-75%. Esto significa que entre el 25% y el 67% delos pacientes no pueden recibir un análisis completo de la rebiopsia durante la primera progresión 5,^6,7,8.

Así pues, el advenimiento de las "biopsias líquidas" ha generado un entusiasmo considerable en este entorno particular, ya que permite una reevaluación crucial de las alteraciones moleculares durante la progresión de la enfermedad examinando el ADN libre circulante (ADNr) derivado de la circulación células tumorales (CTC). Estas células vivas se liberan del tumor hacia el torrente sanguíneo, donde circulan libremente. Aunque no se utiliza habitualmente, el análisis de los CTC parece ser muy prometedor en el caso de caracterización molecular y fenotípica, pronóstico y significación predictiva en el cáncer de pulmón (através de DNAseq, RNAseq, miRNA y análisis de proteínas). De hecho, es probable que los CTC albergan características fenotípicas de la enfermedad activa en lugar de los marcadores iniciales (detectados en biopsias de tejidos al momento del diagnóstico). Además, los CTC evitan el problema de la heterogeneidad espacial del tejido tumoral, que puede ser un problema crucial en pequeñas biopsias. En consecuencia, la expresión de PD-L1 en los CTC puede potencialmente arrojar luz sobre las discrepancias derivadas de su uso como biomarcador predictivo utilizando tejido tumoral.

Recientemente, la expresión PD-L1 se ha probado en CTC de NSCLC. Casi todos los pacientes evaluados⁹ fueron positivos en PD-L1, lo que complica la interpretación del resultado y su uso clínico. En general, se detectaron CTC con PD-L1 positivos en el 69,4% de las muestras a partir de un promedio de 4,5 células/ml^10. Después del inicio de la radioterapia, la proporción de CTC pd-L1 positivos aumentó significativamente, lo que indica una regulación ascendente de la expresión de PD-L1 en respuesta a la radiación^11. Por lo tanto, el análisis de CTC PD-L1 se puede utilizar para monitorear los cambios dinámicos del tumor y la respuesta inmunitaria, que pueden reflejar la respuesta a los tratamientos de quimioterapia, radiación y probable inmunoterapia (IT).

Hasta la fecha, el aislamiento de los CTC y la caracterización PD-L1 se basan en diversos métodos tales como la captura de CTC basada en perlas magnéticas recubierta santi-EpCAM, el ensayo basado en el enriquecimiento y los ensayos de captura¹²basados en el tamaño,¹³ CTC. Sin embargo, los CTC solo se detectaron en el 45%-65% de los pacientes con CPNC metastásico, lo que limita batuta su capacidad de proporcionar cualquier información para más de la mitad de los pacientes con CPNC metastásica. Además, el recuento de CTC fue bajo en la mayoría de estos estudios utilizando el enfoque basado en el tamaño¹⁰. Además, este método ha dado lugar a discrepancias como la detección de células CD45(-)/DAPI(+) con "patrones citomorfológicos de neoplasia maligna" en el torrente sanguíneo de donantes sanos. Estas preocupaciones ponen de relieve la necesidad de un método altamente sensible de recolección de CTC asociado con el fenotipado inmune de células atípicas CD45(-) de sangre entera sana utilizando biomarcadores adicionales de cáncer (es decir, TTF1, Vimentin, EpCAM y CD44) en NSCLC.

En consecuencia, evaluamos un dispositivo microfluídico en espiral que utiliza fuerzas de arrastre inercial y dedean para separar las células en función del tamaño y la plasticidad a través de un chip microfluídico. La formación de flujos de vórtice Dean presentes en el chip microfluídico da como resultado CTCs más grandes ubicados a lo largo de la pared interna y células inmunitarias más pequeñas a lo largo de la pared externa del chip. El proceso de enriquecimiento se completa siphoning las células más grandes en la salida de la colección como la fracción CTC enriquecida. Este método es particularmente sensible y específico (detección de alrededor de 1 CTC/ml de sangre entera)¹⁴ y puede asociarse con análisis personalizados de inmunofluorescencia (IF). Estas herramientas permitirán establecer un umbral positivo para la interpretación clínica. Se describe así un flujo de trabajo que permite a los biólogos aislar e inmunofenotótipos CTC con una alta tasa de recuperación y especificidad. El protocolo describe el uso óptimo del dispositivo microfluídico espiral para recoger los CTC, los ensayos IF optimizados que se pueden personalizar según el tipo de cáncer, y el uso de software libre de código abierto para medir y analizar imágenes celulares para realizar una numeración de las células según la tinción fluorescente. Además, la multiplexación por microscopio se puede llevar a cabo dependiendo del número de filtros/marcadores fluorescentes disponibles.

Protocolo

Las muestras fueron recogidas prospectivamente en el marco de la cohorte CIRCAN ("CIRculating CANcer") con sede en el Hospital Universitario de Lyon tras el consentimiento por escrito del paciente. Este estudio se integró en la cohorte CIRCAN_ALL. El estudio CIRCAN_ALL fue reconocido como no intervencionista por el CPP South-East IV de fecha 04/11/2015 bajo la referencia L15-188. Una versión modificada fue reconocida como no intervencionista el 20/09/2016 bajo la referencia L16-160. El estudio CIRCAN_ALL fue declarado al corresponsal de TI y libertad de los Hospices Civils de Lyon el 01/12/2015, bajo la referencia 15-131. La recolección de sangre se realizó cuando los médicos observaron la primera indicación de progresión tumoral.

NOTA: Utilice todos los reactivos y materiales descritos en la Tabla de Materiales con las condiciones de almacenamiento respectivas para la preparación de muestras preanalíticas y el ensayo de inmunofluorescencia. La sustitución de reactivos y/o la modificación de las condiciones de almacenamiento podrían dar lugar a un rendimiento de ensayo subóptimo.

1. Descontaminación del dispositivo microfluídico espiral

NOTA: La descontaminación del dispositivo microfluídico espiral es un requisito para eliminar todos los antecedentes de inmunofluorescencia generados por la contaminación bacteriana, explorar la citomorfología de los CTC y ser capaces de diferenciarlos de las células inmunitarias normales. El protocolo está optimizado para muestras de sangre recogidas en tubos K₂EDTA dentro de las 6 h después del muestreo de sangre y enriquecido utilizando el dispositivo microfluídico espiral en condiciones limpias. El uso de este ensayo para otros tipos de muestras (otros fluidos biológicos) puede requerir optimización adicional. Este protocolo de descontaminación debe hacerse una vez por semana.

1. Preparación de reactivos
   1. Preparación del tampón diluyente
      1. Esterilizar 20 ml de reactivo aditivo diluyente utilizando un filtro de jeringa de 0,22 m y añadir directamente a 1 L de 1x de fosfato tampón de solución salina (PBS) grado ultrapuro (Tablade materiales).
   2. Esterilización de reactivos y paja de entrada
      1. Esterilizar el búfer de lisis RBC y el búfer de resuspensión (RSB; Tabla de Materiales) utilizando un filtro de jeringa de 0,22 m y un material en un nuevo tubo cónico de polipropileno de 50 ml para cada solución.
      2. Esterilice la paja de entrada incubando a temperatura ambiente (RT) durante 1 h en el reactivo de limpieza multiusos (Tablade materiales). Transfiera la pajita al agente limpiador a base de lejía (Tablade Materiales)e incubar a RT durante 1 h.
      3. Enjuague la pajita de entrada dos veces con PBS estéril durante 1 h cada uno y almacene la pajita de entrada esterilizada en una bolsa quirúrgicamente estéril (Tablade materiales).
2. Descontaminación del dispositivo microfluídico en espiral
   1. Desinfección utilizando el reactivo de limpieza multiusos
      1. Desconecte la tapa de la botella diluyente del puerto diluyente del dispositivo microfluídico espiral desenroscando el tornillo marrón. Bajo un armario de seguridad microbiológico, transfiera hasta 250 ml de reactivo de limpieza multiuso (Tablade materiales)a una nueva botella vacía.
      2. Atornille la tapa de la botella diluyente y la paja a la botella de reactivo de limpieza multiusos de 250 ml bajo un armario de seguridad microbiológico. Fije esta botella al puerto diluyente del dispositivo microfluídico espiral atornillando hacia atrás el tornillo marrón.
      3. Transferir hasta 100 ml de lejía (1% de concentración final; Tabla de Materiales) al contenedor de residuos suministrado en el kit de funcionamiento (Figura1A).
      4. Cargue una nueva pajita de entrada estéril en el dispositivo microfluídico espiral (Tablade materiales)en el puerto de entrada. Cargue un nuevo tubo centrífugo de 50 ml en el puerto de entrada. Cargue un nuevo tubo centrífugo de 50 ml en el puerto de salida.
      5. Proceda a preparar el dispositivo microfluídico espiral haciendo clic en Prime en el dispositivo microfluídico espiral (3 min). Retire el tubo de entrada después de que se haya completado el primo.
      6. Transfiera hasta 15 ml de reactivo de limpieza multiusos a un nuevo tubo centrífugo de 50 ml con una pipeta serológica bajo un armario de seguridad microbiológico y conecte el tubo al puerto de entrada del dispositivo microfluídico en espiral.
      7. Antes de iniciar la ejecución, compruebe que la solución está libre de burbujas excesivas. Si hay burbujas, retírelas por aspiración lenta con una pipeta.
      8. Cargue un chip microfluídico de descontaminación en el dispositivo microfluídico en espiral. Ejecute un programa 3 en el dispositivo microfluídico espiral haciendo clic en Ejecutar y seleccionando el Programa 3 (31 min).
         NOTA: El programa 3 del dispositivo microfluídico espiral permite un rápido enriquecimiento de los CTC en 31 min.
      9. Continúe con el paso de limpieza del dispositivo microfluídico en espiral utilizando el volumen restante del reactivo de limpieza multiusos en el tubo de entrada.
      10. Deseche el tubo de entrada después de que se haya completado el paso de limpieza, dejando atrás la pajita de entrada.
   2. Descontaminación utilizando el agente limpiador a base de lejía
      1. Desconecte la tapa del frasco del reactivo de limpieza multiuso del puerto diluyente del dispositivo microfluídico espiral desenroscando el tornillo marrón. Bajo un armario de seguridad microbiológico, transfiera hasta 250 ml de agente limpiador a base de lejía (Tablade materiales)en una nueva botella vacía (Figura1A).
      2. Atornille la tapa de la botella del reactivo de limpieza multiusos y la paja a la botella que contiene el agente de limpieza a base de lejía bajo un armario de seguridad microbiológico. Fije esta botella al puerto diluyente del dispositivo microfluídico espiral atornillando hacia atrás el tornillo marrón.
      3. Transfiera hasta 15 ml de agente limpiador a base de lejía a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta serológica bajo un armario de seguridad microbiológico. Cargue la posición de entrada del tubo de centrífuga de 50 ml. Cargue un tubo vacío en la posición de salida.
      4. Antes de procesar la carrera, compruebe que la muestra está libre de burbujas excesivas y, si las hay, retire las burbujas al aspirarlas lentamente con una pipeta.
      5. Ejecute el programa 3 haciendo clic en Ejecutar y seleccionando el Programa 3 (31 min). Después de la carrera, proceda directamente al paso de limpieza utilizando el volumen restante del agente limpiador a base de lejía en el tubo de entrada.
      6. Deseche los tubos de entrada y salida.
   3. Enjuague el dispositivo microfluídico en espiral.
      1. Desconecte la tapa de la botella del agente limpiador a base de lejía del puerto diluyente del dispositivo microfluídico espiral desenroscando el tornillo marrón. En el marco de un armario de seguridad microbiológico, transfiera la paja del frasco que contiene el agente limpiador a base de lejía al nuevo frasco que contiene el tampón diluyente. Atornille la botella al dispositivo microfluídico en espiral.
      2. Transfiera hasta 15 ml de agua esterilizada (Tablade materiales)a un nuevo tubo de entrada de tubo centrífugo de 50 ml utilizando una pipeta serológica bajo un armario de seguridad microbiológico. Cargue la posición de entrada del tubo de centrífuga de 50 ml. Cargue un tubo vacío en la posición de salida.
      3. Antes de procesar la carrera, compruebe que la muestra está libre de burbujas excesivas y, si las hay, retire las burbujas al aspirarlas lentamente con una pipeta.
      4. Ejecute el programa 3 haciendo clic en Ejecutar y seleccionando el Programa 3 (31 min). Después de la carrera, proceda directamente al paso de limpieza utilizando el volumen restante de agua esterilizada en el tubo de entrada.
      5. Deseche los tubos de entrada y salida.

2. Mantenimiento para mantener el dispositivo microfluídico espiral libre de bacterias

NOTA: El mantenimiento de rutina debe realizarse al final del día durante el último paso de limpieza.

1. Transfiera hasta 7 ml de agente limpiador a base de lejía al nuevo tubo centrífugo de 50 ml utilizando una pipeta serológica bajo un armario de seguridad microbiológico. Atornille el tubo de limpieza a base de lejía en el puerto de entrada del dispositivo microfluídico espiral.
2. Antes de procesar el funcionamiento limpio, compruebe que la muestra de entrada está libre de burbujas excesivas y, si las hay, retire las burbujas al aspirarlas lentamente con una pipeta.
3. Ejecute la limpieza en el dispositivo microfluídico en espiral.

3. Enriquecimiento pre-analítico del CTC de muestras de sangre del paciente

1. Recoger 7,5 ml de sangre en el tubo K₂EDTA y mantener bajo agitación suave para evitar la sedimentación celular y la coagulación. Proceso dentro de las 6 h.
   NOTA: Si la sangre se recoge en un tubo de recolección de sangre de ADN libre de células que contiene conservante, guárdela a 4 oC hasta su procesamiento. Asegúrese de que la muestra de sangre, el tampón de lisis RBC y el tampón de RBS estén en RT antes de continuar con el paso de enriquecimiento.
2. Transfiera hasta 7,5 ml de sangre entera a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta serológica bajo un armario de seguridad microbiológico.
3. Centrífuga a 1.600 x g durante 10 minutos en RT. Recoger la fracción de plasma con una pipeta sin molestar la capa de color beige. Reemplace la fracción de plasma añadiendo un volumen directamente equivalente de PBS hasta 7,5 ml.
4. Agregue suavemente el tampón de lisis RBC (Tablade materiales)a la muestra de sangre a un volumen final de 30 ml (para un tubo K₂EDTA) o 37,5 ml (para un tubo de recolección de sangre de ADN libre de células). Invierta suavemente el tubo de recolección de sangre 10x e incubar durante 10 min a RT.
   NOTA: La muestra de sangre se vuelve más oscura durante la lisis rbc. Si no se observa ningún cambio (de rojo oscuro y opaco) después de 10 min, invierta suavemente el tubo 3x y déjelo reposar durante otros 5 minutos como máximo. No deje la muestra en el búfer de lisis RBC durante más de 15 minutos porque puede comprometer la calidad de la muestra y el rendimiento del ensayo.
5. Centrifugar la muestra de sangre lysed a 500 x g durante 10 minutos a RT, con frenos de centrífuga encendidos (o la mayor velocidad de desaceleración). Utilice una pipeta Pasteur o una pipeta serológica para retirar suavemente el sobrenadante hasta que el volumen alcance la marca de 4-5 ml. A continuación, utilice puntas de micropipeta filtradas para eliminar el sobrenadante restante.
6. Usando un micropipeta P1000 con una punta filtrada, agregue 1.0 mL de RSB a la pared del tubo de entrada del tubo de centrífuga de 50 ml. Para evitar introducir burbujas en la mezcla, resuspenda el pellet celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la muestra sea homogénea.
7. Añadir 3 ml adicionales de RSB a la pared del tubo de entrada del tubo centrífugo de 50 ml (volumen total 4 ml). Evite introducir burbujas en la mezcla. Mezcle suavemente la suspensión de la celda pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: En el improbable caso de que el pipeteo regular no pueda descomponer los grumos de las células (definidos por ser visibles o bloquear la punta de la pipeta), filtre la muestra a través de un colador de células de 40 m para eliminar los grumos. Agregue 150 sl de RSB a la muestra para compensar la pérdida de volumen por filtrado. Tenga en cuenta que este método debe utilizarse con moderación y solo cuando se observen grupos grandes.
8. Antes de proceder a la etapa de enriquecimiento, compruebe que la muestra está libre de burbujas excesivas y, si las hay, retire las burbujas y tenga cuidado de no descartar ninguna muestra. Si hay pequeñas burbujas presentes, no se requiere su eliminación.
9. Procesar la muestra en el dispositivo microfluídico espiral.

4. Enriquecimiento de CTCs de Patient Whole Blood con el Dispositivo Microfluídico Espiral

1. Cargue un nuevo chip microfluídico en espiral. Cargue dos tubos de centrífuga vacíos de 50 ml en los puertos de entrada y salida.
2. Ejecute una prima haciendo clic en Prime en el dispositivo microfluídico espiral (3 min). Retire los tubos de entrada y salida y cargue la muestra que se va a procesar en el puerto de entrada.
3. Cargue un tubo cónico claro de 15 ml en el puerto de salida para recoger los CTC enriquecidos.
4. Descargar el tubo de salida y la centrífuga a 500 x g durante 10 min (aceleración: 9; desaceleración: 5). Con una pipeta serológica de 5 ml, retire la parada de sobrenadante en la marca de 2 ml en el tubo cónico de 15 ml. Con una micropipeta, retire la parada del sobrenadante a una marca de 100 l en el tubo cónico de 15 ml. Procesar la muestra enriquecida directamente para la tinción de inmunofluorescencia.

5. Mancha de inmunofluorescencia

1. Enumerar en una diapositiva con cámara con una cuadrícula de tipo hemocímetro el número de celdas por ml. Diluir la muestra enriquecida con una solución anti-unión del 0,2% (Tablade materiales)a una concentración que alcance las 100.000 células/100 ml por citopin.
2. Humedezca el contorno de la cámara de muestra utilizando algodón (Tablade Materiales)con 50 ml de solución anti-unión al 0,2%. Coloque un tobogán de vidrio de polilisina en la cámara de muestra y cierre.
3. Recubrir una punta con 0.2% solución anti-unión por pipeteo hacia arriba y hacia abajo 3x. Resuspenda la muestra enriquecida y transfiera la solución celular a la cámara de muestras. Centrífuga con centrífuga dedicada(Tabla de Materiales)a 400 rpm durante 4 min (aceleración baja).
4. Coloque un aislador de silicio alrededor del área de deposición. Deje secar el portavidrios debajo de un armario de seguridad microbiológico durante 2 min.
5. Preparar la solución de fijación diluyendo 1 ml de 16% de paraformaldehído (PFA) con 3 ml de PBS estéril. Añadir 100 l de solución de fijación (4% PFA) por muestra e incubar a RT durante 10 min. Retire la solución de fijación y realice tres lavados con 200 ml de PBS e incubar a RT cada uno durante 2 min.
   PRECAUCION: Utilice PFA bajo un gabinete de seguridad química para evitar la inhalación.
6. Preparar la solución de saturación diluyendo el suero bovino fetal (FBS) al 5%, el receptor Fc (FcR) bloqueando el reactivo al 5%, y la albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS estéril (Tablade Materiales). Añadir 100 l de solución de saturación por muestra e incubar durante 30 minutos a RT. Retire la solución de saturación.
7. Añadir 100 l de solución de anticuerpos por muestra (anticuerpo CD45 1/20; Anticuerpo PanCK 1/500; PD-L1 anticuerpo 1/200; Solución de saturación de Qsp 100 l) (Tablade materiales). Coloque el tobogán de vidrio de polilisina en una placa Petri de 100 mm x 15 mm. Humedezca un papel absorbente con 2 ml de agua estéril y cierre la placa Petri con la tapa. Colocar a 4oC durante la noche y protegerlo de la luz.
8. Retire la mezcla de anticuerpos y realice 3 lavados con 200 ml de PBS incubando cada lavado durante 2 min. Dejar secar la muestra durante 5 min y protegerla de la luz. Colocar 10 l de solución de montaje (Tablade materiales)en el área de deposición y cubrir con una cubierta del microscopio sin hacer una burbuja. Selle la cubierta con esmalte de uñas.

6. Adquisición de imágenes inmunofluorescentes con microscopio fluorescente recto y software asociado

1. Utilice un microscopio fluorescente recto con una plataforma motorizada X/Y. Utilice un objetivo 20x para tomar imágenes TIFF RGB de 8 bits en cuatro canales correspondientes a tinte de ADN (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), tinte PanCK (isotiocianato de fluoresceína [FITC]), tinte PD-L1 (CY3) y tinte CD45 (CY5). Encienda la lámpara de mercurio 15 minutos antes de su uso y adapte el microscopio y el software asociado al brote semi-automático.
2. Coloque el tobogán de vidrio en la plataforma.
3. En el menú de adquisición, defina los cuatro canales y configure el tiempo de exposición (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1.000 ms). Defina las teselas que desea escanear. Haga clic en Mosaicos. En Experimento avanzado, defina el área que desea escanear.
4. Ajuste el enfoque en la pantalla. Haga clic en Iniciar experimento.
5. Exporte archivos TIF de cada canal y asigne específicamente el nombre del archivo de imagen con esta información: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (por ejemplo, Sample1_TR1_c1m01). Tinte de nombre de la siguiente manera: el canal DAPI es c1, el canal FITC es c2, el canal CY3 es c3 y el canal CY5 es c4.

7. Análisis de imágenes inmunofluorescentes con software de análisis de imágenes

1. Descargue e instale el software gratuito de análisis de imágenes desde el sitio web de Broad Institute. Acepte todos los valores predeterminados durante la instalación. Abra el software de análisis de imágenes y haga clic en Archivo . Tubería desde el archivo ? Analysis_4channels_CTC.cppipe.
   NOTA: La canalización convierte imágenes de color RGB en escala de grises, elimina artefactos suavizando imágenes con un filtro mediano, identifica núcleos y citoplasma, cuantifica las intensidades de fluorescencia de cada canal y las exporta a un archivo Excel.
2. Suelte los archivos en la lista de archivos. Actualice los metadatos para agrupar los archivos por iconos.
   NOTA: Todas las instrucciones para agrupar imágenes se especifican en el software. Los archivos de nombre aparecieron en el módulo NamesAndTypes y los archivos se agrupan según el número de teselas y canales por muestras.
3. Haga clic en Ver configuración de salida y especifique una salida predeterminada correcta. Haga clic en Analizar imágenes. Abra el archivo de hoja de cálculo correspondiente a los parámetros measure_intensity.

Resultados

El primer requisito previo fue obtener colecciones no contaminadas (sin agentes infecciosos) de CTC según el cultivo de tejidos y evitar los antecedentes IF generados. El protocolo de descontaminación permitió la limpieza de todas las tuberías y bombas, y dio lugar a la recogida de CTCs con una buena tasa de recuperación sin contaminación bacteriana. Las muestras enriquecidas se compararon sin y con el flujo de trabajo del protocolo de descontaminación del dispositivo microfluídico espiral. Para validar el protoc...

Discusión

En el presente estudio se plantearon dos puntos importantes, el primero en lo que respecta al rendimiento del flujo de trabajo para su transferencia a aplicaciones clínicas, y el segundo relativo a la disminución de la subjetividad para el análisis de las imágenes de fluorescencia obtenidas.

Inicialmente se determinó un flujo de trabajo optimizado y de rendimiento para la enumeración CTC mediante el ensayo IF personalizable después del enriquecimiento celular a través de un sistema mic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4 °C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4 °C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software