JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

Özet

Primer tümörden elde edilen dolaşımdaki tümör hücreleri (CtCs) kan dolaşımına veya lenfatik sisteme dökülür. Bu nadir hücreler (mL başına kan başına 1−10 hücre) kötü bir prognoz garanti ve çeşitli kanserlerde kısa genel sağkalım ile ilişkilidir (örneğin, meme, prostat ve kolorektal). Şu anda, anti-EpCAM kaplı manyetik boncuk tabanlı CTC yakalama sistemi kan dolaşımında CTC'ler sayısaliçin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan altın standart testtir. Bu test, özellikle epitel kanseri hücrelerini hedef leyen anti-EpCAM belirteçleri ile kaplanmış manyetik boncukların kullanımına dayanmaktadır. Birçok çalışma EpCAM CTC tespiti için en uygun belirteç olmadığını gösterdi. Gerçekten de, CtCs kanser hücrelerinin heterojen bir alt popülasyon ve metastatik proliferasyon ve invazyon ile ilişkili bir epitelyal-mesenkimal geçiş (EMT) geçmesi edebiliyoruz. Bu CtCs hücre yüzeyi epitel marker EpCAM ifadesini azaltmak mümkün, vimentin gibi mezenkimal belirteçleri artırırken. Bu teknik engeli gidermek için, CTC'lerin fiziksel özelliklerine dayalı diğer izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Mikroakışkan teknolojiler, tam kan örneklerinden CTC zenginleştirme için etiketsiz bir yaklaşım sağlar. Spiral mikroakışkan teknolojisi, spiral mikroakışkan çip içinde oluşturulan kavisli kanallarda sürekli akış ile atalet ve Dean sürükleme kuvvetleri kullanır. Hücreler normal kan hücreleri ve tümöral hücreler arasındaki boyut ve plastisite farklılıklarına göre ayrılır. Bu protokol, ctcs programlanmış ölüm-ligand 1 (PD-L1) ekspresyonu karakterize etmek için farklı adımları ayrıntıları, özelleştirilebilir immünoreskence ile spiral mikroakışkan cihaz birleştirerek (IF) marker seti.

Giriş

Tümör antijene özgü sitotoksik T-lenfositler (CtLs) kanser "bağışıklık gözetimi" olarak bilinen bir süreç yoluyla kanserlere yanıt önemli bir rol oynamaktadır. Anti-tümör fonksiyonları, CTLA-4 inhibitörleri ve PD-1/PD-L1 inhibitörleri gibi immün kontrol noktası blokantikorları ile geliştirilmiştir. Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 tedavileri, PD-L1 negatif tümörlü hastalarda %0-17, PD-L1'i ifade eden hastalarda ise %36-100 arasında değişen yanıt oranlarıile sonuçlanır. Melanom ve NSCLC'de gözlenen PD-1/PD-L1 ablukasına verilen sağlam yanıtlar, genel yanıt oranının (RR), dayanıklı klinik faydalar ve progresyonsuz sağkalım (PFS) kanıtları ile gösterilmiştir. Şu anda, anti-PD1 tedavileri pd-L1 ekspresyonu ne olursa olsun nivolumab ile ikinci basamak NSCLC tedavisinde bakım standardı ve PD-L1 ≥1 ifade eden hastalarda pembrolizumab ile. Birinci basamak tedavide, pd-L1 ≥50' yi ifade eden NSCLC'li hastalarda tek başına pembrolizumab bakım standardıdır ve potansiyel olarak kemoterapi ile geliştirilebilir (histolojik alt tipe bağlı olarak platin ve doublet ilaç)1,2.

Ancak, hasta yönetimine böyle bir yaklaşım tartışmalıdır3, immünohistokimya ile tümör hücrelerinde PD-L1 ekspresyonu beri (IHC) muhtemelen en ideal eşlik biyomarker değildir. Tümör mutasyon yükü4 (TMB), mikrouydu instabilitesi (MSI) ve/veya mikrobiyota gibi diğerleri bu ortamda muhtemelen tek başına veya birlikte ilginçtir. NSCLC heterojen tümörler olduğu bilinmektedir, ya mekansal (bir tümör sitesinden diğerine) ya da zamansal (tanıdan nüksiçin). NSCLC'li hastalar genellikle kırılgandır ve yinelemeli invaziv doku biyopsileri sorun olabilir. Nitekim seriye bağlı olarak ilk progresyonda rebiyopsi oranı %46-84 arasında, başarılı re-biyopsi (histolojik ve tam moleküler analiz ile anlam) %33-75 arasında değişmektedir. Bu, hastaların %25-67'sinin ilk progresyon sırasında kapsamlı bir rebiyopsi analizi alamadığı anlamına gelir5,6,7,8.

"Sıvı biyopsiler"in ortaya çıkışı, bu ortamda önemli bir heyecan yaratmıştır, çünkü dolaşımdan elde edilen serbest DNA'yı (cfDNA) inceleyerek hastalığın ilerlemesi sırasında moleküler değişikliklerin önemli ölçüde yeniden değerlendirilmesini sağlar. tümör hücreleri (CtCs). Bu canlı hücreler tümörden kan dolaşımına salınır ve serbestçe dolaşır. Rutin olarak kullanılmamasına rağmen, akciğer kanserinde moleküler ve phenotipik karakterizasyon, prognoz ve tahmine dayalı önemi (DNAseq, RNAseq, miRNA ve protein analiziyoluyla) açısından KTK'ların analizi son derece umut verici görünmaktadır. Gerçekten de, KTK'lar büyük olasılıkla ilk belirteçler yerine aktif hastalığın hevit özellikleri barındırır (tanı da doku biyopsileri üzerinde saptanmıştır). Ayrıca, CtCs tümör dokusunun mekansal heterojenite sorunu atlamak, hangi küçük biyopsiler önemli bir sorun olabilir. Sonuç olarak, CTCs pd-L1 ekspresyonu potansiyel tümör dokusu kullanarak bir tahmine dayalı biyomarker olarak kullanımından kaynaklanan tutarsızlıklar ışık tutabilir.

Son zamanlarda, PD-L1 ekspresyonu NSCLC'nin CTC'lerinde test edilmiştir. Test edilen hastaların hemen hemen hepsi 9'u PD-L1 pozitifti, bu da sonucun yorumlanmasını ve klinik kullanımını karmaşık hale getiriyordu. Genel olarak, PD-L1-pozitif KTK'lar ortalama 4,5 hücre/mL10'danalınan örneklerin %69.4'ünde saptandı. Radyasyon tedavisinin başlamasından sonra, PD-L1-pozitif KTC'lerin oranı önemli ölçüde artarak, radyasyona yanıt olarak PD-L1 ekspresyonunun yükseltilmesine işaret eder11. Bu nedenle, PD-L1 CtCs analizi tümör ve bağışıklık yanıtı dinamik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir, hangi kemoterapi yanıtı yansıtabilir, radyasyon, ve olası immünoterapi (BT) tedaviler.

Bugüne kadar, CTCs izolasyon ve PD-L1 karakterizasyonu anti-EpCAM kaplı manyetik boncuk tabanlı CTC yakalama, zenginleştirme-ücretsiz tabanlı tahlil ve boyut tabanlı12,13 CTC yakalama tahlilleri gibi çeşitli yöntemlere dayanır. Ancak metastatik NSCLC'li hastaların sadece %45-65'inde KTK saptandı ve böylece metastatik NSCLC hastalarının yarısından fazlası için herhangi bir bilgi verme yetenekleri sınırlandı. Buna ek olarak, ctc sayısı boyut tabanlı yaklaşım10kullanarak bu çalışmaların çoğunda düşüktü. Ayrıca bu yöntem sağlıklı donörlerin kan dolaşımında "malignitenin sitomorfolojik paternleri" ile CD45(-)/DAPI(+) hücrelerinin saptanması gibi tutarsızlıklara yol açmıştır. Bu endişeler, NSCLC'de ek kanser biyobelirteçleri (yani, TTF1, Vimentin, EpCAM ve CD44) kullanarak sağlıklı tam kandan atipik CD45(-) hücrelerinin immün-fenotipleme ile ilişkili CTC toplama son derece hassas bir yöntem için ihtiyaç vurgulamak.

Sonuç olarak, bir mikroakışkan çip aracılığıyla boyut ve plastisite dayalı hücreleri ayırmak için atalet ve Dean sürükleme kuvvetleri kullanan bir spiral mikroakışkan cihaz değerlendirildi. Dekan girdabının oluşumu mikroakışkan çipte bulunan akıntılar, iç duvar boyunca bulunan daha büyük CtC'ler ve çipin dış duvarı boyunca daha küçük bağışıklık hücreleri ile sonuçlanır. Zenginleştirme işlemi, büyük hücrelerin zenginleştirilmiş CTC fraksiyonu olarak toplama çıkışına emilmesiyle tamamlanır. Bu yöntem özellikle hassas ve spesifiktir (yaklaşık 1 CTC/mL tam kan saptanması)14 ve özelleştirilmiş immünoresans (IF) analizleri ile ilişkili olabilir. Bu araçlar klinik yorumlama için olumlu bir eşik kurulmasını sağlayacaktır. Bu nedenle biyologların yüksek iyileşme hızı ve özgüllük le immünfenotip BTC'leri izole etmelerini ve immünofopoftip BtC'leri izole etmelerini sağlayan bir iş akışı tanımlanmıştır. Protokol, spiral mikroakışkan cihazın CTC'leri toplamak için optimal kullanımını, kanser türüne göre özelleştirilebilen optimize edilmiş IF testlerini ve yarı otomatik bir performans sergilemek için hücre görüntülerini ölçmek ve analiz etmek için ücretsiz açık kaynak yazılım kullanımını tanımlar. floresan boyama göre hücrelerin numeration. Buna ek olarak, mikroskop çoklama mevcut floresan filtreler / belirteçleri sayısına bağlı olarak yapılabilir.

Protokol

Numuneler, lyon Üniversitesi Hastanesi'nde bulunan Circan ("CIRculating CANcer") kohortu çerçevesinde, hastanın yazılı onayı ile prospektif olarak toplanmıştır. Bu çalışma CIRCAN_ALL kohortuna entegre edilmiştir. CIRCAN_ALL çalışması, 04/11/2015 tarihli L15-188 referansı altında CPP Güney-Doğu IV tarafından girişimsel olmayan olarak kabul edilmiştir. Değiştirilen sürüm 20/09/2016 tarihinde L16-160 referansı altında girişimsel olmayan olarak kabul edilmiştir. CIRCAN_ALL çalışması 01/12/2015 tarihinde, 15-131 referansı altında, Hospices Civils de Lyon'un BT ve özgürlük muhabirine ilan edilebildi. Doktorlar tümörün ilerlemesinin en erken endikasyonuna dikkat edince kan toplanması yapıldı.

NOT: Analitik numune hazırlama ve immünoffloresan teşrinatı için ilgili depolama koşullarına sahip Malzemeler Tablosu'nda özetlenen tüm reaktifleri ve malzemeleri kullanın. Reaktiflerin değiştirilmesi ve/veya depolama koşullarının değiştirilmesi, optimal inden düşük bir şekilde istinat performansına neden olabilir.

1. Spiral Mikroakışkan Cihazın Dekontaminasyonu

NOT: Spiral mikroakışkan cihazın dekontaminasyonu, bakteri kontaminasyonundan kaynaklanan tüm immünfloresans arka planının çıkarılması, CtC'lerin sitomorfolojisinin araştırılması ve normal bağışıklık hücrelerinden ayırt edilebilme zorunluluğudur. Protokol,k2EDTA tüplerinde kan örneklemesi sonrasında 6 saat içinde toplanan ve spiral mikroakışkan cihaz kullanılarak temiz koşullarda zenginleştirilmiş kan örnekleri için optimize edilmiştir. Bu tahkikatın diğer numune türleri (diğer biyolojik sıvılar) için kullanılması ek optimizasyon gerektirebilir. Bu dekontaminasyon protokolü haftada bir yapılmalıdır.

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. Dilüent arabelleği hazırlanması
      1. 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak 20 mL dilüent katkılı reaktifi sterilize edin ve doğrudan 1 X fosfattampon salin (PBS) ultra saf kalitede (Malzeme Tablosu) doğrudan ekleyin.
    2. Reaktiflerin sterilizasyonu ve giriş saman
      1. RBC lysis tampon ve resuspension tampon (RSB; Malzeme Tablosu) her çözelti için yeni bir 50 mL polipropilen konik tüp içinde 0,22 μm şırınga filtre ve stok kullanarak.
      2. Çok amaçlı temizlik reaktifinde (MalzemeTablosu)1 saat oda sıcaklığında (RT) kuluçkaya yatırArak giriş pipetini sterilize edin. Pipeti çamaşır suyu bazlı temizlikmaddesine (Malzeme Tablosu) aktarın ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
      3. Giriş samanını steril PBS ile iki kez 1 saat erteleyin ve steril giriş samanını cerrahiolarak steril bir torbada saklayın (Malzeme Tablosu).
  2. Spiral mikroakışkan cihazın dekontamine edilmesi
    1. Çok amaçlı temizleme reaktifini kullanarak dezenfeksiyon
      1. Kahverengi vidayı sökerek spiral mikroakışkan cihazın dilüent portundan dilüent şişe kapağını kesin. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında, 250 mL'ye kadar çokamaçlı temizlik reaktifini (Malzeme Tablosu) yeni bir boş şişeye aktarın.
      2. Dilüent şişe kapağını ve samanını mikrobiyolojik güvenlik kabini altında 250 mL çok amaçlı temizleme reaktifinin şişesine vidalayın. Bu şişeyi spiral mikroakışkan cihazın dilüent portuna kahverengi vidayı vidalayarak takın.
      3. 100 mL'ye kadar çamaşır suyu aktarımı (%1 nihai konsantrasyon; Malzeme Tablosu) çalışma kitinde verilen atık kabına (Şekil1A).
      4. Giriş portundaki spiral mikroakışkan cihaza (MalzemeTablosu) yeni bir steril giriş pipeti yükleyin. Giriş portuna yeni bir 50 mL santrifüj tüp yükleyin. Çıkış portuna yeni bir 50 mL santrifüj tüp yükleyin.
      5. Spiral mikroakışkan cihaz (3 dk) üzerinde Prime tıklayarak spiral mikroakışkan cihaz asal devam edin. Asal tamamlandıktan sonra giriş tüpünü çıkarın.
      6. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet içeren yeni 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 15 mL'e kadar çok amaçlı temizleme reaktifini aktarın ve tüpü spiral mikroakışkan cihazın giriş noktasına takın.
      7. Çalıştırmaya başlamadan önce, çözümün aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin. Kabarcıklar varsa, bir pipet ile yavaş aspirasyon ile kaldırın.
      8. Spiral mikroakışkan cihaza dekontaminasyon mikroakışkan çip yükleyin. Çalıştır'a tıklayıp Program 3'ü (31 dk)seçerek spiral mikroakışkan cihazda Bir Program 3 çalıştırın.
        NOT: Spiral mikroakışkan cihazın 3.
      9. Spiral mikroakışkan cihazın temizleme adımıile giriş tüpündeki çok amaçlı temizleme reaktifinin kalan hacmini kullanarak devam edin.
      10. Temizleme adımı tamamlandıktan sonra giriş tüpünü atın ve giriş samanını geride bırakın.
    2. Çamaşır suyu bazlı temizlik maddesi kullanılarak dekontaminasyon
      1. Kahverengi vidayı sökerek spiral mikroakışkan cihazın dilüent portundan çok amaçlı temizleme reaktifi şişesi kapağını kesin. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında, 250 mL'ye kadarçamaşır suyu bazlı temizlik maddesi (Tablo Malzemeler) yeni bir boş şişeye (Şekil1A) aktarın.
      2. Çok amaçlı temizleme reaktifi şişe kapağını ve pipeti, mikrobiyolojik güvenlik kabininin altında Bleach tabanlı temizlik maddesi içeren şişeye vidalayın. Bu şişeyi spiral mikroakışkan cihazın dilüent portuna kahverengi vidayı vidalayarak takın.
      3. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet kullanarak 15 mL'e kadar çamaşır suyu bazlı temizlik maddesini 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüp giriş tüpüne aktarın. 50 mL santrifüj tüp giriş pozisyonunu yükleyin. Çıkış pozisyonunda boş bir tüp yükleyin.
      4. Çalıştırmayı işlemeden önce, numunenin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa pipetle yavaşça azarlayarak kabarcıkları çıkarın.
      5. Çalıştır'a tıklayıp Program 3'ü seçerek Program 3'ü çalıştırın (31 dk. Çalıştırmadan sonra, giriş tüpündeki çamaşır suyu bazlı temizlik maddesinin kalan hacmini kullanarak doğrudan temizleme adımına geçin.
      6. Giriş ve çıkış tüplerini atın.
    3. Spiral mikroakışkan cihazı durulayın.
      1. Kahverengi vidayı sökerek beyazlatıcı bazlı temizlik maddesi şişe kapağını spiral mikroakışkan cihazın dilüent portundan sökün. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında, çamaşır suyu bazlı temizlik maddesi içeren şişedeki pipeti, dilüent tamponu içeren yeni şişeye aktarın. Şişeyi spiral mikroakışkan cihaza vidalayın.
      2. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojikpipet kullanarak 15 mL'e kadar steril su (Malzeme Tablosu) 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüp giriş tüpüne aktarın. 50 mL santrifüj tüp giriş pozisyonunu yükleyin. Çıkış pozisyonunda boş bir tüp yükleyin.
      3. Çalıştırmayı işlemeden önce, numunenin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa pipetle yavaşça azarlayarak kabarcıkları çıkarın.
      4. Çalıştır'a tıklayıp Program 3'ü seçerek Program 3'ü çalıştırın (31 dk. Çalıştırmadan sonra, giriş tüpünde kalan sterilize su hacmini kullanarak doğrudan temizleme basamacına geçin.
      5. Giriş ve çıkış tüplerini atın.

2. Spiral Mikroakışkan Cihazı Bakterisiz Tutmak Için Bakım

NOT: Rutin bakım son temizlik adımı sırasında günün sonunda yapılmalıdır.

  1. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet kullanarak 7 mL'e kadar çamaşır suyu bazlı temizlik maddesini yeni 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Spiral mikroakışkan cihazın giriş portundaki ağartıcı tabanlı temizleme tüpünü vidalayın.
  2. Temiz çalıştırmayı işlemeden önce, giriş örneğinin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa pipetle yavaşça azarlayarak kabarcıkları çıkarın.
  3. Spiral mikroakışkan cihaz üzerinde temiz çalıştırın.

3. Hasta Kan Örneklerinden CTC'nin Analitik Öncesi Zenginleşmesi

  1. K2EDTA tüpünde 7,5 mL kan toplayın ve hücre sedimantasyonu ve pıhtılaşmasını önlemek için nazik ajitasyon altında tutun. 6 saat içinde işlem.
    NOT: Kan, koruyucu içeren hücresiz DNA kan toplama tüpünde toplanırsa, işleme alınana kadar 4 °C'de saklayın. Zenginleştirme adımına geçmeden önce kan örneğinin, RBC lysis tamponundan ve RBS tamponundan RT'de olduğundan emin olun.
  2. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet kullanarak 7,5 mL'e kadar tam kanın 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüp giriş tüpüne aktarın.
  3. RT 10 dakika için 1.600 x g centrifuge. Buffy ceket rahatsız etmeden bir pipet ile plazma fraksiyonu toplamak. Plazma fraksiyonu değiştirerek 7,5 mL'ye kadar doğrudan eşdeğer PBS hacmini ekledi.
  4. Kan örneğine 30 mL (K2EDTA tüpü için) veya 37,5 mL (hücresiz DNA kan toplama tüpü için) için rbc lysis tamponu (MalzemeTablosu)ekleyin. Kan toplama tüpünü 10x'i hafifçe ters çevirin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: RBC lysis sırasında kan örneği daha koyu kırmızıya döner. 10 dakika sonra (koyu kırmızı ve opaktan) herhangi bir değişiklik gözlenmezse, tüpü 3x'i hafifçe ters çevirin ve maksimum 5 dakika daha bekletin. Numune kalitesini ve test performansını tehlikeye atabileceğinden numuneyi RBC lysis arabelleğinde 15 dakikadan fazla bırakmayın.
  5. 500 x g'de lysed kan örneğini RT'de 10 dk, santrifüj frenleri (veya en yüksek yavaşlama hızı) ile santrifüj edin. Hacim 4-5 mL işaretine ulaşana kadar süpernatantı nazikçe çıkarmak için pasteur pipetveya serolojik pipet kullanın. Daha sonra, kalan supernatant kaldırmak için filtrelenmiş mikropipet ipuçları kullanın.
  6. Filtrelenmiş uçlu bir P1000 mikropipet kullanarak, 50 mL santrifüj tüp giriş tüpünün duvarına 1,0 mL RSB ekleyin. Karışıma kabarcıklar girmesini önlemek için, numune homojen olana kadar yavaşça yukarı ve aşağı borulama hücre pelet yeniden askıya.
  7. 50 mL santrifüj tüp giriş tüpünün duvarına 3 mL rsl daha ekleyin (toplam hacim 4 mL). Karışımiçine kabarcıklar tanıtan kaçının. Yavaşça yukarı ve aşağı boru ile hücre süspansiyon karıştırın.
    NOT: Düzenli pipetlemenin hücre kümelerini parçalayamayacağı (görünür olarak veya pipet ucunu engelleyerek tanımlanan) olası durumlarda, herhangi bir kümeyi çıkarmak için numuneyi 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Filtrelemeden kaynaklanan hacim kaybını telafi etmek için örneğe 150 μL RSB ekleyin. Bu yöntemin dikkatli ve yalnızca büyük kümeler gözlendiğinde kullanılacağını unutmayın.
  8. Zenginleştirme adımına geçmeden önce, numunenin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa kabarcıkları çıkarın ve herhangi bir numuneyi atmamaya özen verin. Küçük kabarcıklar varsa, bunların kaldırılması gerekli değildir.
  9. Spiral mikroakışkan cihazda numuneyi işlayın.

4. Spiral Mikroakışkan Cihaz ile Hasta Tam Kanından CTC'lerin Zenginleşmesi

  1. Yeni bir spiral mikroakışkan çip yükleyin. Giriş ve çıkış portlarına iki boş 50 mL santrifüj tüpü yükleyin.
  2. Spiral mikroakışkan cihazda (3 dk) Prime'a tıklayarak bir asal çalıştırın. Giriş ve çıkış tüplerini çıkarın ve giriş portuna işlenecek numuneyi yükleyin.
  3. Zenginleştirilmiş CTC'leri toplamak için çıkış portuna 15 mL'lik net bir konik tüp yükleyin. Çalıştır'a tıklayarak ve Program 3'ü seçerek Program 3'ü çalıştırın (31 dk).
  4. Çıkış tüpünü ve santrifüjü 500 x g'de 10 dakika (hızlanma: 9; yavaşlama: 5). 5 mL serolojik pipetle, konik 15 mL tüpüzerindeki 2 mL işaretinde süpernatant durdurmayı kaldırın. Mikropipet ile konik 15 mL tüpte 100 μL marklıkta süpernatant durdurmayı kaldırın. Zenginleştirilmiş numuneyi doğrudan immünofloresan boyama için işle.

5. İmmünofluoresan Boyama

  1. Hemositometre tipi ızgara ile odacıklı bir slayt üzerinde numaralandırmak mL başına hücre sayısı. Zenginleştirilmiş numuneyi %0,2 anti-bağlayıcı çözelti(Malzeme Tablosu) ile sitospin başına 100.000 hücre/100 μL'ye ulaşan bir konsantrasyona seyreltin.
  2. %0,2 anti-bağlayıcı çözeltiile50 μL'lik pamuk (Malzeme Tablosu) kullanarak numune haznesinin konturunu nemlendirin. Örnek haznesine bir polilizin cam kaydırağı yerleştirin ve kapatın.
  3. 3 x yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak %0,2 anti-bağlayıcı çözeltisi ile bir ucu katlayın. Zenginleştirilmiş numuneyi yeniden askıya alın ve hücre çözeltisini numune odasına aktarın. 4 dakika (ivme düşük) için400 rpm özel bir santrifüj (Malzeme Tablosu) ile santrifüj.
  4. İfade alanının etrafına bir silikon izolatör yerleştirin. 2 dakika mikrobiyolojik güvenlik kabini altında cam slayt kurulalım.
  5. Fiksasyon çözeltisini 1 mL %16 paraformaldehit (PFA) ile 3 mL steril PBS seyrelterek hazırlayın. Numune başına 100 μL fiksasyon çözeltisi (%4 PFA) ekleyin ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Fiksasyon çözümünü çıkarın ve 200 μL PBS ile üç yıkama yapın ve 2 dk boyunca RT'de inkübatyapın.
    DİkKAT: Soluma önlemek için kimyasal güvenlik kabini altında PFA kullanın.
  6. Fetal büyükbaş serumu (FBS) %5, Fc reseptörü (FcR) reaktifini %5 ve sığır serum albuminini (BSA) steril PBS'de %1 oranında seyrelterek doygunluk çözeltisini hazırlayın (Malzeme Tablosu). Numune başına 100 μL doygunluk çözeltisi ekleyin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  7. Numune başına 100 μL antikor çözeltisi ekleyin (CD45 antikor 1/20; PanCK antikor 1/500; PD-L1 antikor 1/200; Qsp doygunluk çözeltisi 100 μL) (Malzeme Tablosu). Polilizin cam kaydırağı 100 mm x 15 mm Petri kabına yerleştirin. 2 mL steril su ile emici bir kağıdı nemlendirin ve Petri kabını kapakla kapatın. Bir gecede 4 °C'ye yerleştirin ve ışıktan koruyun.
  8. Antikor karışımını çıkarın ve 2 dakika boyunca her yıkamada 200 μL PBS ile 3 yıkama yapın. Numunenin 5 dk kurumasına izin verin ve ışıktan koruyun. Birkabarcık yapmadan bir mikroskop kapağı ile kaplayın ve 10 μL montaj çözeltisi (MalzemeTablosu)yerleştirin. Oje ile coverslip mühür.

6. Düz Floresan Mikroskobu ve İlişkili Yazılım ile İmmünofloresan Görüntülerin Edinimi

  1. X/Y motorlu platformlu düz floresan mikroskop kullanın. DNA boyasına karşılık gelen dört kanalda 8 bit RGB tiff görüntüleri (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), PanCK boya (floresan izotiyosiyanat [FITC]), PD-L1 boya (CY3) ve CD45 boyası (CY5) olmak üzere 20 x bir hedef kullanın. Kullanmadan önce cıva lambasını 15 dakika açın ve mikroskobu ve ilişkili yazılımı yarı otomatik çekime uyarla.
  2. Cam kaydırağı platforma yerleştirin.
  3. Edinme menüsünde, dört kanalı tanımlayın ve pozlama süresini ayarlayın (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1.000 ms). Tmak için döşemeleri tanımlayın. Kutucuklar'ıtıklatın. Gelişmişdenemede, taymak için alanı tanımlayın.
  4. Ekrandaki odağı ayarlayın. Denemeyi Başlat'ıtıklatın.
  5. Her kanalın TIF dosyalarını dışa aktarın ve özellikle bu bilgilerle resim dosyasını adlandırın: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (örn., Sample1_TR1_c1m01). Ad boyası aşağıdaki gibidir: DAPI kanalı c1, FITC kanalı c2, CY3 kanalı c3 ve CY5 kanalı c4'tur.

7. İmmünofluoresan Görüntülerin Görüntü Analiz Yazılımı ile Analizi

  1. Broad Institute web sitesinden ücretsiz görüntü analizi yazılımını indirin ve kurun. Yükleme sırasında tüm varsayılan kabul edin. Görüntü analizi yazılımını açın ve Dosya'yı tıklatın | Dosyadan Boru Hattı | Analysis_4channels_CTC.cppipe.
    NOT: Ardışık düzen, RGB renkli görüntüleri gri tonlama içine dönüştürür, görüntüleri ortanca filtreyle düzelterek yapıları kaldırır, çekirdekleri ve sitoplazmayı tanımlar, her kanalın floresan yoğunluklarını ölçer ve bunları bir excel dosyasına aktarır.
  2. Dosyaları dosyalistesine bırakın. Dosyaları kutucuklara göre gruplandırmak için meta verileri güncelleştirin.
    NOT: Görüntüleri gruplandırmak için tüm talimatlar yazılımda belirtilir. Ad dosyaları NamesAndTypes modülünde ortaya çıktı ve dosyalar, örnek başına renk ve kanal sayısına göre gruplandırılır.
  3. Çıktı ayarlarını görüntüle'yi tıklatın ve doğru varsayılan çıktı belirtin. Resimleri AnalizEt'e tıklayın. Measure_intensity parametrelerine karşılık gelen elektronik tablo dosyasını açın.

Sonuçlar

İlk ön koşul doku kültürü için kirlenmemiş (enfeksiyöz ajaniçermeyen) CTC koleksiyonlarını elde etmek ve oluşturulan IF arka planından kaçınmaktı. Dekontaminasyon protokolü tüm boru ların ve pompaların temizlenmesine olanak sağladı ve bakteriyel kontaminasyon olmadan iyi bir geri kazanım oranı ile CTC'lerin toplanmasıyla sonuçlandı. Zenginleştirilmiş numuneler spiral mikroakışkan cihazın dekontaminasyon protokolü iş akışı olmadan ve bunlarla karşılaştırıldı. Dekontaminasyon pro...

Tartışmalar

Bu çalışmada, ilki klinik uygulamalara aktarılması için iş akışının performansı, ikincisi ise elde edilen floresan görüntülerinin analizinde öznellik azalması ile ilgili iki önemli nokta ortaya konmuştür.

CTC numaralandırma için bir performant ve optimize edilmiş iş akışı başlangıçta ctc etiketsiz mikroakışkan sistem (spiral mikroakışkan cihaz) ile hücre zenginleştirme sonrası özelleştirilebilir IF tahlili kullanılarak belirlendi. Bu iş akışını kull...

Açıklamalar

Jean-Philippe Aurel ve Kathryn Weiqi Li bu makalede kullanılan aletleri üreten Biolidics şirketin çalışanlarıdır. Diğer yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma AstraZeneca (Londra, Birleşik Krallık), Biolidics (Singapur) ve Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Fransa) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Yazarlar AstraZeneca ve Biolidics şirketlerine mali desteklerinden ötürü teşekkür ediyorlar.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)OzymeBLE 422801Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 LBD Biosciences340345Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mLBiolidicsCBB-F016012Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%SigmaA8412Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647BioLegendBLE304020Storage conditions: +4 °C
CellProfiler SoftwareBroad InstituteImage Analysis Software
Centrifuge deviceHettich4706Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mLCorning430-829Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mLBiolidicsCBB-F001004-25Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 SystemBiolidicsCBB-F011002Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 LBeckman Coulter8448222All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1SBiolidicsCBB-FR001002Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4ThermoFisherA78300003Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mLBiolidicsCBB-F016009Storage conditions: +4 °C
EZ CytofunnelsThermoFisherA78710003Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking AgentMiltenyi Biotec130-059-901Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10270-106Storage conditions: +4 °C
FluoromountSigmaF4680Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mgBristol-Myers-Squibb90129TB29Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock capBiolidicsCBB-F013005Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlideDutscher50126Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisher53-9003-80Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16%ThermoFisher11490570Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - PhycoerythrinBioLegendBLE329706Storage conditions: +4 °C
Petri DishDutscher632180Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)OzymeBE17-512FStorage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L1st Base LaboratoryBUF-2040-1X1LStorage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%Gibco24040-032Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slidesThermoFisherJ2800AMNZStorage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mLFalcon352098Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mLG Biosciences786-649Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mLG Biosciences786-650Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB)BiolidicsCBB-F016003Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifugeThermoFisherA78300003Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon IsolatorGrace bio-Labs664270Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL1st Base LaboratoryCUS-4100-100mlStorage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1ZeissStorage conditions: Room temperature
Surgical Sterile BagSPS Laboratoires98ULT01240Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterileBD Biosciences300296Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterileClearLine51732Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite SoftwareZeissMicroscope associated software

Referanslar

  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
  12. Hao, S. -. J., Wan, Y., Xia, Y. -. Q., Zou, X., Zheng, S. -. Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 150akci er kanseridola mdaki t m r h creleriserbest DNA dola animm nororesans testiCTCspiral mikroak kan cihazPD L1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır